高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素含量的不確定度評價探討

古汶玉，鐘國才，鄧常繼，黃 玉，何詠怡

（廣東省糧食科學(xué)研究所，廣州 510000）

脫氧雪腐鐮刀烯醇，俗稱嘔吐毒素，是一種來源于鐮刀菌屬產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素[1]。嘔吐毒素污染糧食的情況嚴(yán)重，主要污染小麥、玉米等谷物。人和動物在食用被該毒素污染的食物后，會導(dǎo)致各類急性中毒癥狀，如惡心、腹瀉、嘔吐等，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致造血系統(tǒng)受損而死亡，對人和動物的健康造成很大威脅，也對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失[2]。因此，準(zhǔn)確測量小麥中的嘔吐毒素含量具有重要意義。本實驗采用GB 5009.111-2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》規(guī)定的方法測定小麥中嘔吐毒素含量[3]，以不確定度為指標(biāo)，依據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[4]及CNASGL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[5]的要求對實驗過程中產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行評估計算，為評估檢測結(jié)果的質(zhì)量水平和改進(jìn)實驗操作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥，2020年委托檢測小麥樣品。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品GBW(E)100304:純度99%，國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；嘔吐毒素質(zhì)控樣GBW(E)100382，國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；嘔吐毒素免疫親和柱，青島普瑞邦生物工程有限公司；甲醇：色譜純，德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀：配有紫外檢測器，美國Agilent公司；ML-3002型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；渦旋振蕩器，德國Hei-dolph公司；BLH-56K型粉碎機(jī)，浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將小麥樣品用高速粉碎機(jī)粉碎，過0.5～1 mm孔徑試驗篩，從篩下物準(zhǔn)確稱取25 g試樣于具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，置于渦旋振蕩器震蕩20 min，10 000 r/min下離心5 min，移取上清液1 mL過免疫親和柱。用5mL PBS緩沖鹽溶液和5 mL去離子水分兩次清洗，棄去全部流出液，抽干小柱后，用2.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后用氮吹儀吹干，然后加入1.0 mL流動相復(fù)溶，渦旋混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取1.0 mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度并充分混勻，再配制成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，4℃保存，有效期7 d。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（15:15:70，V/V）；柱溫 35 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量 50 μL；檢測波長 218 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果計算

試樣中嘔吐毒素的含量按以下公式計算：

式中：X為試樣中嘔吐毒素的含量，其單位為μg/kg；C1為試樣中嘔吐毒素的質(zhì)量濃度，其單位為ng/mL；C0為空白試樣中嘔吐毒素的質(zhì)量濃度，單位為ng/mL；V為樣品洗脫液的最終定容體積，單位為mL；f為樣液稀釋因子；1 000為換算系數(shù)；m為試樣的稱樣量，單位為g。

2.2 不確定度來源

本測試方法的不確定度主要來自：樣品非均勻性引起的不確定度；測量重復(fù)性引起的不確定度；測量回收率引起的不確定度；樣品前處理引起的不確定度，包括天平引起的不確定度、25 mL量筒引起的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度引起的不確定度、10 mL容量瓶引起的不確定度、1 000 μL移液器引起的不確定度、200 μL移液器引起的不確定度、100 μL移液器引起的不確定度。

2.3 不確定度的計算

2.3.1 樣品非均勻性引起的不確定度

取小麥樣品，經(jīng)分樣、制備得到6份小麥試樣，分別測定含量，探究樣品非均勻性引入的不確定度。測定結(jié)果見表1，其不確定度按A類評定。

2.3.2 測量重復(fù)性引起的不確定度

表2 樣品重復(fù)測定檢測結(jié)果

2.3.3 測量回收率引起的不確定度

對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，得出結(jié)果如表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率測定結(jié)果

則測量回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

2.3.4 樣品前處理引起的不確定度

2.3.4.1 天平引起的不確定度

2.3.4.2 100 mL量筒引起的不確定度

2.3.4.3 由樣品前處理引起的不確定度的合成

由樣品前處理引起的2個不確定度分量ur4-1和ur4-2互不相關(guān)，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur4采用平方和的平方根方法得到：

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的不確定度

2.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度引起的不確定度

2.3.5.2 10 mL容量瓶引起的不確定度

2.3.5.3 1 000 μL移液器引起的不確定度

2.3.5.4 200 μL移液器引起的不確定度

2.3.5.5 100 μL移液器引起的不確定度

2.3.5.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起不確定度的合成

由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的5個不確定度分量 ur5-1、ur5-2、ur5-3、ur5-4、ur5-5互不相關(guān)，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur5采用平方和的平方根方法合成得到：

2.4 合成不確定度

各個分量的合成不確定度如表4所示，各不確定度分量相互獨(dú)立，因此相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量與合成不確定度

2.5 拓展不確定度

取95%的置信區(qū)間，擴(kuò)展因子k=2，則擴(kuò)展不確定度:U=uc××k=3.74×10-2×950×2=71 μg/kg。因此，本次嘔吐毒素測得的含量為950±71 μg/kg。

3 結(jié)論

本實驗對使用高效液相色譜法測定小麥中的嘔吐毒素含量的不確定度進(jìn)行了評定，通過評定可以得出，影響測量結(jié)果的不確定度主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的不確定度，樣品非均勻性引起的不確定度和測量重復(fù)性引起的不確定度，結(jié)果表明高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素的測量不確定度為:71 μg/kg。