硅酸二鈣對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響*

劉亞蕊 羅倩婷 鐘文超 曹威 李傳潔 黎星陽 朱明靜 吳安桐 曾素娟

齲病是口腔常見的慢性進(jìn)行性疾?。?］，當(dāng)齲病進(jìn)展累及牙髓組織時(shí)，如何保護(hù)牙髓、維持牙髓組織對(duì)牙體組織的營養(yǎng)支持作用成為了口腔臨床的難題。為保護(hù)牙髓組織活性，蓋髓治療是目前有效的治療方法之一，氫氧化鈣、三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）、波特蘭水門汀、等為最常用的蓋髓材料［2-4］。其中硅鈣類蓋髓劑——波特蘭水門汀具有良好的生物相容性和密閉性，在牙科治療中受到了越來越多的關(guān)注［5］。硅酸二鈣（Dicalcium silicate，C2S）作為波特蘭水門汀的主要成分之一，與其他蓋髓材料成分（如磷酸三鈣、羥基磷灰石等）相比，C2S生物毒性更低，并對(duì)銅綠假單胞菌、糞腸球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等展現(xiàn)出更加強(qiáng)大的長(zhǎng)期抗菌能力［6］。

人類來源的牙髓干細(xì)胞（hDPSCs，Human dental pulp stem cells）是牙源性干細(xì)胞的一種，因其具有良好的多向分化潛能，易獲取等優(yōu)點(diǎn)，常常被用作口腔組織工程的種子細(xì)胞。hDPSCs具有維持牙髓組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用［7］。在使用直接蓋髓術(shù)對(duì)患牙進(jìn)行治療時(shí)，hDPSCs是最先與蓋髓材料接觸的干細(xì)胞，而蓋髓材料中C2S在hDPSCs中的功能作用尚不清楚。本研究將通過多種實(shí)驗(yàn)方法，探究hDPSCs在C2S顆粒的刺激下細(xì)胞增殖和骨向分化能力的影響，為蓋髓材料的性能提升、牙體組織的修復(fù)和再生等方面提供一定的依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器C2S微米級(jí)顆粒（中科院上海硅酸鹽研究所，中國）；α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco，美國）；氯化十六烷基吡啶（CPC，Sigma，美國）；Triton-100X（碧云天，中國）；CCK-8試劑盒（碧云天，中國）；ALP染色試劑盒（碧云天，中國）；茜素紅染色液（索萊寶，中國）；ALP、RUNX2、OPN、GAPDH、HRP-Rabbit抗體（abcam，美國）；澳洲胎牛血清（Gibco，美國）；5% CO2恒溫孵育箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；β-磷酸甘油（Sigma，美國）；地塞米松（Sigma，美國）；光學(xué)顯微鏡（Leica，德國）；L-抗壞血酸（Sigma，美國）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；Western Blot系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）。

1.2 細(xì)胞來源hDPSCs購自上海斯德喏生物科技有限公司（貨號(hào)：HUM-iCell-m003，中國）。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 選取3-6代hDPSCs作為工作細(xì)胞接種到96孔板（3×103個(gè)/孔），用完全培養(yǎng)基作為溶劑，配制含有1、5、10、50、100μg/mL C2S的培養(yǎng)液。每個(gè)分組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，向各組孔中分別加入100μL含不同濃度C2S溶液的條件培養(yǎng)基。選取培養(yǎng)第1、3、5、7d為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔加入10μL CCK-8試劑后，將培養(yǎng)板置于5%CO2恒溫孵育箱，避光孵育1-4h，選擇450nm濾光片下檢測(cè)吸光度（OD）值。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀況良好的第3-6代hDPSCs接種到Transwell小板上室（1×105個(gè)/孔），分別加入含1、5、10、50、100μg/mL C2S溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，取出Transwell小板下室，PBS洗滌后固定染色。對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行定量分析（Image J）。

1.5 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）實(shí)驗(yàn) 取hDPSCs，接種于48孔板（2.5×104個(gè)/孔）。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、10μg/mL C2S組和50μg/mL C2S組，配制含10mM β-甘油磷酸鈉、50μg/mL抗壞血酸，10mM地塞米松的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入濃度為0、10、50μg/mL的C2S溶液。培養(yǎng)7d后，使用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒進(jìn)行染色。使用ALP定量試劑盒進(jìn)行ALP定量分析，并相對(duì)于總蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.6 茜素紅染色實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)及骨向誘導(dǎo)同步驟5。培養(yǎng)14d后，茜素紅染色并定量分析礦化結(jié)節(jié)形成情況。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%茜素紅染液染色。室溫下用10%氯化十六烷基吡啶脫色30min，測(cè)量562nm OD值，總蛋白質(zhì)濃度作為內(nèi)參，定量分析礦化結(jié)節(jié)的含量差異。

1.7 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 使用Takara公司的RNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（Takara，中國）提取總RNA，使用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq（Takara，中國）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。每個(gè)樣本取1μg總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞骨向誘導(dǎo)的第7d，RT-PCR檢測(cè)ALP、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（RUNX2）和骨橋蛋白（OPN）等骨向分化標(biāo)志物的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。通過比較Ct值法（2-△△Ct法）計(jì)算各RNA表達(dá)值，利用內(nèi)參將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。所得到的數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。

1.8 Western Blot實(shí)驗(yàn) 選取hDPSCs，接種于6孔板中（2×105個(gè)/孔），實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、10μg/mL C2S組和50μg/mL C2S組，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基7d后，冰上裂解細(xì)胞，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，100℃金屬浴加熱5min，每組取等質(zhì)量蛋白質(zhì)，與loading buffer混合均勻，10% SDS-PAGE 80V恒壓電泳，20V恒壓濕轉(zhuǎn)17h，室溫下5%脫脂奶粉浸泡，封閉1h；按照1∶1000稀釋目標(biāo)基因一抗，置于搖床上，4℃過夜，次日反復(fù)洗膜后稀釋兔二抗（1∶2000）、洗膜、顯影，最后進(jìn)行條帶灰度值定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)組間差異采用One-Way ANOVA檢測(cè)方差齊性，使用t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異，并記錄結(jié)果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 不同濃度C2S對(duì)hDPSCs增殖和遷移能力的影響 分別用含有0、1、5、10、50、100μg/mL C2S的培養(yǎng)基對(duì)hDPSCs實(shí)行1、3、5、7d共培養(yǎng)。于第一天，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示各濃度C2S對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。從第3d開始，在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖能力隨C2S濃度增強(qiáng)，其中50μg/mL C2S的促進(jìn)作用最強(qiáng)（圖1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，一定濃度范圍內(nèi)的C2S對(duì)hDPSCs遷移能力有一定的促進(jìn)作用，通過使用Image J軟件分析染色細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果表明50μg/mL C2S的促進(jìn)作用最強(qiáng)（圖2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。基于以上增殖與遷移的實(shí)驗(yàn)，初步篩選出0、10、50μg/mL濃度的C2S用于進(jìn)一步探究其促進(jìn)細(xì)胞骨向分化的能力。

圖1 C2S促進(jìn)hDPSCs的增殖

圖2 A-C2S促進(jìn)hDPSCs的遷移；B-遷移細(xì)胞數(shù)定量分析

2.2 C2S對(duì)hDPSCs骨向分化能力的影響 分別用含有0、10、50μg/mL C2S的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理hDPSCs 7d，通過ALP染色及定量實(shí)驗(yàn)測(cè)定ALP活性。我們發(fā)現(xiàn)50μg/mL C2S可以顯著提高h(yuǎn)DPSCs的ALP活性（圖3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在處理21d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，染色及定量分析的結(jié)果顯示，在50μg/mL C2S作用下，hDPSCs的體外礦化能力顯著提高（圖4），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 A,B,C-C2S增強(qiáng)hDPSCs ALP的活性；D-ALP活性定量分析

圖4 A,B,C-C2S促進(jìn)hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成；D-礦化結(jié)節(jié)定量分析

2.3 C2S對(duì)hDPSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，在10、50μg/mL的C2S刺激后第7d，10、50μg/mL的C2S均促進(jìn)成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2和OPN的RNA表達(dá)，且隨著C2S濃度的提高，ALP、RUNX2和OPN的RNA表達(dá)也與之上調(diào)（圖5）。蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，hDPSCs中的ALP、RUNX2、OPN等成骨相關(guān)蛋白在加入50μg/mLC2S處理后表達(dá)水平顯著升高（圖6A，B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖5 10、50μg/mL的C2S上調(diào)hDPSCsALP、RUNX2以及OPN的RNA表達(dá)水平

圖6 A-C2S上調(diào)hDPSCs成骨蛋白ALP、RUNX2、OPN的表達(dá)；B-蛋白表達(dá)定量分析

3.討論

牙髓在牙齒組織中起到營養(yǎng)、調(diào)節(jié)、感覺等左右，使牙齒能更好、更長(zhǎng)久地在我們的口腔中行使功能［8］。堅(jiān)硬的牙本質(zhì)包繞著牙髓組織，由于牙體組織具有不可讓性、缺乏有效的側(cè)支循環(huán)等特點(diǎn)，因此，牙髓損傷后易導(dǎo)致強(qiáng)烈的疼痛，且難以自愈。如何能更好地保存牙髓的功能，成為了口腔內(nèi)科醫(yī)生追求的重要目標(biāo)?？谇粌?nèi)科常見的活髓保存治療包括：直接蓋髓術(shù)、間接蓋髓術(shù)以及活髓切斷術(shù)［9］。直接蓋髓術(shù)是在已暴露的牙髓創(chuàng)面上覆蓋有保護(hù)牙髓組織功能的材料，常見有氫氧化鈣、MTA等。于20世紀(jì)30年代，氫氧化鈣便開始被用作蓋髓劑，該材料的弱堿性，使其能夠防止口腔內(nèi)多種細(xì)菌導(dǎo)致的感染，并擁有誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成的潛能［10，11］。但氫氧化鈣易溶解于口腔環(huán)境［12］，且在蓋髓治療中的遠(yuǎn)期效果并不理想［13-15］。MTA在活髓保存治療中也存變色效應(yīng)的缺陷［16］，且與現(xiàn)有牙體粘接系統(tǒng)不兼容，影響復(fù)合樹脂的粘接性能［17，18］。因而在使用MTA蓋髓治療的情況下，患牙不可直接進(jìn)行樹脂充填修復(fù)操作。因此，不少學(xué)者專注研發(fā)新型的直接蓋隨材料，其中備受關(guān)注的就是硅酸鈣類的蓋髓材料，如Biodentine、BioAggregate、TheraCal、calcium-enriched mixture cement和endosequence root repair material等［19-23］。

C2S作為硅酸鈣材料的家族成員，引起了學(xué)者的關(guān)注。C2S是一種硅基生物玻璃材料，除了具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移的作用之外，Li HW等人還發(fā)現(xiàn)C2S能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞中成骨相關(guān)RNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨向分化［24，25］。課題組前期研究表明，50μg/mL C2S可以通過調(diào)控mRNA和circRNA之間的相互作用促進(jìn)BMSCs的成骨向分化［26］，20μg/mLC2S浸提液培養(yǎng)72h后能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的ALP表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成［27］。C2S顆粒還可用于組織工程復(fù)合支架的制作，向支架中加入C2S后可顯著促進(jìn)小鼠前體成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和骨向分化［28］。也有研究報(bào)道稱，C2S涂層與模擬體液混合后會(huì)形成類似于碳酸羥基磷灰石的表面結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與骨組織形態(tài)非常接近，這種C2S涂層可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化［29］。

本研究結(jié)果顯示培養(yǎng)3d以上時(shí)，濃度為10、50μg/mL的C2S能夠促進(jìn)hDPSCs的增殖，而過高濃度（100μg/mL）使用時(shí)則可能會(huì)影響hDPSCs增殖能力。細(xì)胞遷移能力也是hDPSCs修復(fù)活動(dòng)的重要指標(biāo)之一，良好的遷移能力顯示細(xì)胞活力較好，對(duì)局部組織的修復(fù)能力較強(qiáng)［30，31］，本研究中通過Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了50μg/mL C2S對(duì)hDPSCs遷移能力有顯著促進(jìn)作用。ALP是成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)的標(biāo)志物，ALP活性升高表明骨形成正處于活躍的階段。RUNX2在成骨細(xì)胞分化中具有重要作用，它的升高提示存在成骨祖細(xì)胞增殖，間充質(zhì)細(xì)胞成骨向分化。在成骨細(xì)胞分化過程中，RUNX2在早期弱表達(dá)，其表達(dá)量在前成骨細(xì)胞中提高，在未成熟的成骨細(xì)胞時(shí)為最高水平，而在成熟的成骨細(xì)胞中則下調(diào)。OPN是骨組織中發(fā)現(xiàn)的第一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其中的OPN會(huì)從成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中釋放出來，具有調(diào)節(jié)骨細(xì)胞粘附、破骨細(xì)胞功能和基質(zhì)礦化作用，并在抑制過度礦化中具有重要意義［32］。可見在成骨的整個(gè)時(shí)期，一定濃度的C2S可以促進(jìn)hDPSCs成骨向分化并促進(jìn)其形成鈣化顆粒。本研究結(jié)果顯示，hDPSCs在50μg/mL C2S的環(huán)境中，其ALP活性有顯著增強(qiáng)。茜素紅染色定量分析結(jié)果顯示，在加入50μg/mL C2S礦化培養(yǎng)21d后，hDPSCs的體外礦化能力顯著增強(qiáng)。本研究分別從RNA水平與蛋白水平檢測(cè)hDPSCs骨向分化能力。其中成骨早期標(biāo)志物ALP、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和骨橋蛋白OPN是細(xì)胞成骨活動(dòng)的重要標(biāo)志物［33-35］。在歷時(shí)7d的骨向分化誘導(dǎo)后，ALP、RUNX2和OPN的RNA表達(dá)水平及蛋白水平均發(fā)生顯著上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了C2S具有良好的成骨誘導(dǎo)性能。

綜上所述，C2S在適當(dāng)濃度時(shí)不僅對(duì)hDPSCs的增殖、遷移有促進(jìn)作用，并且能顯著促進(jìn)其成骨礦化能力，具有成為直接蓋髓劑的潛能。但本研究?jī)H在體外環(huán)境探討了C2S于hDPSCs中的功能作用，體內(nèi)環(huán)境中C2S的功能作用尚未得到驗(yàn)證，其成骨誘導(dǎo)的機(jī)制亦有待于進(jìn)一步探討。