珍珠層用于成骨研究中的進(jìn)展*

楊艷蘭 徐普

珍珠層在人類醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用由來(lái)已久。早在1931年考古學(xué)發(fā)現(xiàn)，瑪雅人頭骨中珍珠層制成的牙齒可以與周圍的骨骼實(shí)現(xiàn)完美的結(jié)合［1］。而使用珍珠層作為骨移植替代物取得的重大突破是在1992年，Lopez［2］等人發(fā)現(xiàn)來(lái)自貝母珠的珍珠層同時(shí)具有生物相容性和骨誘導(dǎo)性。自此以后，珍珠層作為天然材料應(yīng)用于骨組織工程的研究就倍受關(guān)注。

1.珍珠層的組成

珍珠層是一種有組織的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合材料，由軟體動(dòng)物外套膜組織上皮細(xì)胞分泌的晶體前體（Ca2+和CO32-）和無(wú)定形碳酸鈣，以及由蛋白質(zhì)和多糖組成的有機(jī)基質(zhì)分子［3］。

在化學(xué)成分組成上，珍珠層是由95%的無(wú)機(jī)碳酸鈣和5%多種有機(jī)成分的無(wú)機(jī)-有機(jī)復(fù)合的結(jié)晶形式，無(wú)機(jī)碳酸鈣有三種多晶型，即方解石、文石和球霰石。方解石是這些多晶中最具熱力學(xué)穩(wěn)定性的，而文石和球霰石則不穩(wěn)定，在溶液中很容易分解為方解石［4］。熱分解有機(jī)基質(zhì)釋放出的空間在很大程度上促進(jìn)了珍珠文石的重構(gòu)相變。而有機(jī)部分包括蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、幾丁質(zhì)、脂類和色素的混合物［4］。迄今為止，已鑒定出50多種來(lái)自珍珠層的蛋白質(zhì)和50種肽，有機(jī)分子可以用水和有機(jī)溶劑如乙醇來(lái)萃取，可以提取為水溶性基質(zhì)（Water Soluble Matrix，WSM）、酸溶性基質(zhì)（Acid Soluble Matrix，ASM）和酸不溶性基質(zhì)（Acid Insoluble Matrix，AIM）［5-7］。雖然珍珠層中的有機(jī)基質(zhì)只有5%的重量，但它在晶體成核、生長(zhǎng)空間、化學(xué)控制、微觀結(jié)構(gòu)和韌性增強(qiáng)等方面起著重要作用。

2.珍珠層的機(jī)械性能

珍珠層是一種天然復(fù)合材料，由碳酸鈣晶體包裹在有機(jī)基質(zhì)中形成的高度有組織的“磚混”或“磚墻”微觀結(jié)構(gòu)組成［8，9］。在“磚墻結(jié)構(gòu)”中，文石片和有機(jī)基質(zhì)薄片交替排列，文石片為堆疊的“磚墻”，有機(jī)大分子為“砂漿”，文石片和基質(zhì)的分層組裝結(jié)構(gòu)賦予了珍珠層優(yōu)異的拉伸強(qiáng)度和韌性［5，8］。巧妙的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)同時(shí)賦予珍珠層優(yōu)秀的強(qiáng)度和斷裂韌性協(xié)同作用，從而使珍珠層復(fù)合材料具有優(yōu)越的力學(xué)性能。精確幾何排列是珍珠層穩(wěn)健力學(xué)行為的重要原因之一，這種特殊的微結(jié)構(gòu)賦予了比地質(zhì)文石更高3000倍的抗斷裂能力，蛋白質(zhì)是無(wú)機(jī)納米顆粒之間的強(qiáng)力膠，蛋白質(zhì)與文石納米顆粒之間的強(qiáng)靜電相互作用以及蛋白質(zhì)的高塑性是礦物-蛋白質(zhì)復(fù)合材料高斷裂韌性的主要原因［10］。珍珠層的斷裂韌性為3.3-9兆帕，它大約是整體文石的3到9倍［11］。珍珠層的楊氏模量或彈性模量分別為30-40gpa和20gpa，而骨的分別為185-200mpa和140mpa［12，13］。

然而，只有磚混結(jié)構(gòu)不足以解釋珍珠層的力學(xué)性能。此外，還有微米和納米級(jí)結(jié)構(gòu)特征，如微觀顯示一些文石片燕尾狀特征即相鄰片劑之間的聯(lián)鎖和文石片的波紋會(huì)產(chǎn)生額外的抗片劑滑動(dòng)的阻力［14］。納米尺度上顯示，納米微凸體、礦物橋和珍珠母的礦物片劑的波狀幾何結(jié)構(gòu)已被證實(shí)在機(jī)械性能方面起增強(qiáng)作用［8］。

由于珍珠層優(yōu)越的力學(xué)性能，常被加工制備成具有適當(dāng)生物力學(xué)特性的矯形器械，如鋼板或螺釘［15］。除骨組織工程外，珍珠層非凡的機(jī)械性能激發(fā)了研究者們開發(fā)模擬珍珠層的合成納米復(fù)合材料，如珍珠層結(jié)構(gòu)樣陶瓷材料。珍珠層的仿生結(jié)構(gòu)也應(yīng)用于復(fù)合材料、涂層、薄膜，其中珍珠層模擬紙具有輕質(zhì)、形狀持久、優(yōu)異和可調(diào)的機(jī)械性能以及隔熱和防火性能［16-18］。

3.生物相容性

研究顯示，人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞中加入WSM后細(xì)胞的形態(tài)沒有發(fā)生改變，沒有觀察到細(xì)胞的死亡和或凋亡情況［19，20］。珍珠層的乙醇可溶性基質(zhì)（Ethanol Soluble Matrix，ESM）的提取物利于MC3T3-E1的增殖、分化，也證明其在體外細(xì)胞有生物相容性［21］。

珍珠層植入物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其較好的生物相容性［1］。Libouban［15］用珍珠層制備直徑3.5mm骨科螺釘，將螺紋螺釘植入綿羊脛骨上端干骺端，結(jié)果顯示在3個(gè)月和6個(gè)月均沒有出現(xiàn)局部炎癥反應(yīng)。Rousseau［22］將綿羊模型膝關(guān)節(jié)軟骨下區(qū)放置珍珠層塊，三個(gè)月后觀察未見植入處有炎癥反應(yīng)。

4.珍珠層用于成骨實(shí)驗(yàn)的效果

4.1 體外成骨 研究顯示，珍珠層的表面形態(tài)特征有利于成骨，將其復(fù)制到聚己內(nèi)酯上，檢測(cè)骨骼干細(xì)胞在聚己內(nèi)酯的成骨能力，結(jié)果顯示珍珠質(zhì)表面的骨骼干細(xì)胞面積增加，成骨標(biāo)記物堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）和骨鈣蛋白（Osteocalcin，OCN）表達(dá)增加［23］。

通過不同方法從珍珠中分離出的可溶性有機(jī)基質(zhì)能夠刺激各類骨細(xì)胞的分化和增殖以及生物礦化。David［19］等研究發(fā)現(xiàn)用珍珠層培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Mesenchymal Stem Cells，hBMSCs）比用最有效的骨誘導(dǎo)因子（Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2，rhBMP-2）治療時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)分化反應(yīng)。

珍珠層除了成骨分化、增殖，還促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化。珍珠層還可誘導(dǎo)下頜骨來(lái)源的人骨細(xì)胞（Human Bone Cells，HBCs）合成更多的骨基質(zhì)礦化標(biāo)志物骨唾液酸蛋白（Bone Sialic Acid Protein，BSP）［24］。珍珠層乙醇溶性基質(zhì)（ESM）可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎患者成骨細(xì)胞礦化能力。研究顯示100μg/ml ESM處理OA成骨細(xì)胞14d后，茜素紅染色顯示成骨細(xì)胞中存在鈣沉淀，而200μg/ml只需要7d。掃描電鏡拉及曼光譜表征均顯示ESM處理后有磷酸鹽納米顆粒，qPCR檢測(cè)高劑量的ESM比低劑量的ESM能更快、更持久地刺激成骨標(biāo)志物ColⅠ、骨橋蛋白、骨鈣素和Runx2基因表達(dá)［21］。

4.2 體內(nèi)成骨 不僅體外，珍珠層可以促進(jìn)體內(nèi)成骨。在過去幾十年中，珍珠層被設(shè)計(jì)成可棒狀、滑車狀、螺釘和鋼板，粉末狀包括微米級(jí)、納米級(jí)，以滿足骨科的臨床需要。并在不同體內(nèi)的不同植入部位進(jìn)行了不同用途的測(cè)試。研究顯示珍珠層的種植部位幾乎包括所有的骨質(zhì)，有上頜骨、下頜骨、股骨中段或股骨骨骺、第一跖骨、腰椎或橫突之間，均可以促進(jìn)大鼠、綿羊、兔和豬缺損處新骨的形成［25-29］。

在骨缺損臨床治療方面，Atlan［30］等人將珍珠層粉與8名上頜骨丟失患者的血液混合成泥漿，將泥漿注入上頜骨缺失的組織中。6個(gè)月后，活檢顯示珍珠層已被局部組織接受，微觀顯示新形成的骨緊密地焊接到珍珠層顆粒上，沒有軟組織或纖維組織鑲?cè)?，成骨?xì)胞被激活，新的健康骨在整個(gè)植入物中形成，而珍珠層顆粒慢慢地逐漸向心溶解，被未成熟的編織骨和成熟的板層骨取代。

在骨質(zhì)疏松方面，Kim［31］通過切除雌鼠雙側(cè)卵巢（ovariectomized，OVX），制作其脛骨近端骨質(zhì)疏松模型，術(shù)后3d開始，每天口服WSNF 25mg/kg，連續(xù)30d。CT結(jié)果顯示口服WSNF組骨密度（Bone Mineral Density，BMD）、骨體積占總骨體積的百分比（trabecular bone volume as a percentage of total bone volume，BV/TV）和 骨 小 梁 數(shù) 目（Trabecular Number，Tb.N）較空白對(duì)照組明顯增高；鈣黃綠素雙標(biāo)記法顯示骨礦化沉積率（Mineral Apposition Rate，MAR）和 骨 形 成 率（Bone Formation Rate，BFR）較對(duì)照組增高；蘇木精-伊紅染色檢測(cè)顯示，每毫米骨小梁表面的成骨細(xì)胞（Numbers of Osteoblasts，NOb）增多而破骨細(xì)胞（Numbers of Osteoclasts，NOc）減少。這表明珍珠層粉可以預(yù)防OVX誘導(dǎo)的小鼠骨丟失所致的骨質(zhì)疏松。

4.3 珍珠層成骨的成分 珍珠層具有良好的成骨潛力，但珍珠層為復(fù)雜的混合物，而且有成骨效果的可溶性有機(jī)基質(zhì)蛋白質(zhì)成分構(gòu)成復(fù)雜，成骨的活性分子的化學(xué)特性仍然未知。已有許多研究通過不同的方法萃取及鑒定提取物中的成骨活性成分，如水溶性基 質(zhì)（WSM）［32］、純化蛋 白PFMG3［33］、N16［34，35］、P10［36］、P60［37］、三種gigasin-2亞型和半胱氨酸蛋白酶抑制劑A2［38］。另外，珍珠母似乎含有分子量不同的蛋白酶抑制劑，這可能有助于保存對(duì)礦化等過程起重要作用的蛋白質(zhì)［35］。目前這些單一蛋白對(duì)成骨是否有協(xié)同作用，有待于進(jìn)一步研究。

除了蛋白，Ammar等［39］發(fā)現(xiàn)珍珠層的脂質(zhì)（Lipids extracted from Nacre，LN）誘 導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞參與激活骨組織特定基因的啟動(dòng)子，如Col1a1、Bglap、Spp1和Runx2，與成骨前分化密切相關(guān)，還具有調(diào)節(jié)骨礦化和潛在骨沉積的作用。

除此之外，珍珠層被認(rèn)為含有不明的可擴(kuò)散的生物活性因子，這些生物活性因子能夠通過刺激種植區(qū)附近成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成來(lái)啟動(dòng)成骨，而這些因子的成分有待于進(jìn)一步研究。

5.珍珠層有效成分的促成骨機(jī)制

5.1 珍珠層中的N16抑制RANKL減少破骨細(xì)胞骨吸收促進(jìn)骨的形成 骨不斷經(jīng)歷復(fù)雜的重塑，以取代舊骨，保持骨骼的質(zhì)量。破骨細(xì)胞吸收骨量，成骨細(xì)胞在吸收過程中產(chǎn)生新骨。核因子κB受體活化因子配體（Receptor Activator Of NF-KB Ligand，RANKL）有助于促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟，提高破骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)的吸收。RANKL通過與破骨細(xì)胞的受體，受體激活劑結(jié)合，對(duì)于破骨細(xì)胞的形成、融合、活化和存活是必不可少的［40，41］。研究顯示單一的珍珠蛋白N16顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞破骨細(xì)胞分化，減少多核破骨細(xì)胞的形成、肌動(dòng)蛋白環(huán)數(shù)目和大小，抑制破骨細(xì)胞對(duì)成骨的吸收，促進(jìn)成骨，且抑制作用隨N16濃度的增加而增強(qiáng)［34，35］。

5.2 珍珠層通過JNK信號(hào)通路調(diào)控Fra1蛋白表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化c-Jun-NH2末端激酶（C-Jun N-Terminal Kinase，JNK）活化對(duì)于成骨細(xì)胞前期分化至關(guān)重要［42］，F(xiàn)os相關(guān)抗原-1（Fra-1）為參與骨基質(zhì)形成的必需轉(zhuǎn)錄因子［43］，二者活性增強(qiáng)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。WSNF可以促進(jìn)JNK的磷酸化進(jìn)而增強(qiáng)JNK活性；WSNF還可以增強(qiáng)Fra-1的活性，而Fra-1是JNK信號(hào)的下游靶點(diǎn)，這些表明，JNK-Fra-1軸的激活可能在WSNF對(duì)成骨細(xì)胞礦化過程的刺激作用中發(fā)揮中心作用［31］。

5.3 珍珠層通過Bcl-2促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖Bcl-2蛋白存在于有絲分裂細(xì)胞核的染色體中，并與細(xì)胞周期相關(guān)。研究顯示W(wǎng)SM可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞胞漿中Bcl-2含量明顯增加，從而延長(zhǎng)成熟成骨細(xì)胞的壽命；WSM可能通過一些細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，導(dǎo)致過量Bcl-2蛋白從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核；WSM還可通過Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性，并通過Bcl-2抗凋亡作用促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖［44］。

5.4 珍珠層通過抑制破骨細(xì)胞組織蛋白酶K減少骨吸收的作用促進(jìn)成骨 組織蛋白酶K主要存在于破骨細(xì)胞中，是破骨細(xì)胞分泌的主要半胱氨酸蛋白酶，并在骨吸收過程中對(duì)降解骨基質(zhì)蛋白起重要作用［45］。珍珠層有機(jī)基質(zhì)中含有組織蛋白酶K抑制劑。以從珍珠層中提取的WSM為載體，在牛皮質(zhì)骨片上培養(yǎng)兔破骨細(xì)胞，通過定量測(cè)定牛骨片上破骨細(xì)胞的吸收表面積，測(cè)定破骨細(xì)胞的吸收活性。研究發(fā)現(xiàn)，WSM在不影響破骨細(xì)胞存活的情況下降低了骨吸收，連續(xù)透析分離發(fā)現(xiàn)，分子量大于1000da和500-1000da的低分子量WSM作用最強(qiáng)，在WSM濃度增加的情況下，人組織蛋白酶K活性呈劑量依賴性抑制［46］。

5.5 珍珠層通過抗氧化促進(jìn)成骨分化 自由基與許多生物分子如脂類、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應(yīng)并對(duì)其造成損害［47］。研究發(fā)現(xiàn)，WSM以劑量依賴的方式清除自由基并促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化［48］。

綜上所述，珍珠層是一種有機(jī)基質(zhì)與碳酸鈣耦合結(jié)構(gòu)的天然生物材料，由軟體動(dòng)物產(chǎn)生，具有許多利于成骨的優(yōu)異特性，是一種天然的、多用途的骨移植替代材料。通過對(duì)其結(jié)構(gòu)特性、機(jī)械強(qiáng)度、良好的生物相容性和成骨能力等性能的綜述，可以認(rèn)為，珍珠層作為骨替代材料的生理特性和生物學(xué)特性合適，有作為骨移植材料的應(yīng)用前景。