超聲波對(duì)綠豆種子生長(zhǎng)發(fā)育的影響

閆延鵬， 鄭 杰， 張雪梅， 陳 宇， 李鴻淋， 崔建國(guó)，2

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶理工大學(xué) 藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400054)

超聲波是一種音調(diào)高于人類聽(tīng)覺(jué)的聲音，頻率超過(guò)20 kHz，在眾多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。低頻超聲作為快速增強(qiáng)各種生物活性的方法，在過(guò)去的十年中得到了越來(lái)越多的關(guān)注，通過(guò)改變超聲參數(shù)，可以達(dá)到不同的物理、化學(xué)和生物效果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞活性增強(qiáng)的目的[1]。低頻超聲波作用于生物體，具有多種生物效應(yīng)，其中最主要的有機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)[2]。已有研究表明，超聲可以通過(guò)多種途徑加速細(xì)胞生長(zhǎng)，如升高細(xì)胞pH值[3-4]或Ca2+濃度[5-6]，改變細(xì)胞膜的通透性[7-8]等。

超聲技術(shù)在植物研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。最早從Willian等[9]用超聲處理玉米種子使其產(chǎn)量增加35%，到后期關(guān)于黃精種子[10]、梭梭種子[11]和橫經(jīng)席種子[12]等各種植物，研究者們都進(jìn)行了大量的研究工作。但目前超聲對(duì)植物種子影響的研究大多缺少理論基礎(chǔ)，參數(shù)選擇存在一定的隨機(jī)性和盲目性，更多的是以實(shí)驗(yàn)測(cè)試來(lái)探究超聲對(duì)種子生長(zhǎng)的影響。

針對(duì)上述情況，從基礎(chǔ)理論出發(fā)研究超聲波對(duì)綠豆種子發(fā)芽率的影響，通過(guò)理論和頻率仿真得到了綠豆細(xì)胞的特征頻率，然后設(shè)計(jì)了一種超聲刺激裝置，該裝置可以對(duì)刺激環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)和控制，并且能夠及時(shí)調(diào)節(jié)超聲作用參數(shù)。利用該裝置分別研究了超聲頻率、刺激時(shí)間和正弦波信號(hào)激勵(lì)電壓對(duì)綠豆種子發(fā)芽指數(shù)的影響，在此基礎(chǔ)上研究了連續(xù)波和脈沖波超聲對(duì)綠豆發(fā)芽的影響，并創(chuàng)新性的提出了超聲協(xié)同低濃度氯化鈉對(duì)綠豆發(fā)芽影響的研究。

1 矩形細(xì)胞膜共振理論

綠豆種子多為矩形細(xì)胞[13]，設(shè)矩形細(xì)胞膜的長(zhǎng)和寬分別為a和b，則細(xì)胞膜的振動(dòng)值為[14]:

(1)

其中，Z為膜的位移，c為振動(dòng)傳播速度，F(xiàn)(x，y，t)為矩形膜遭受的外力。根據(jù)初始條件和邊界條件[15]，薄膜勢(shì)能增量為：

(2)

動(dòng)能表達(dá)式為：

(3)

(4)

設(shè)

(5)

(6)

其中，M為細(xì)胞膜單位面積的重量，T為細(xì)胞膜平均表面張力，所以

(7)

其中,σ為薄膜的表面密度。當(dāng)振頻指標(biāo)m=n=1時(shí)，細(xì)胞膜的基本特征頻率為：

(8)

2 矩形細(xì)胞特征頻率的仿真

使用COMSOL Multiphysics 5.4有限元仿真軟件對(duì)矩形細(xì)胞特征頻率進(jìn)行了仿真。細(xì)胞膜主要由蛋白質(zhì)、磷脂和碳水化合物組成，為了簡(jiǎn)易化仿真，本文將綠豆種子細(xì)胞等同于均勻的長(zhǎng)方體，根據(jù)各組分的平均密度，求解均值得到細(xì)胞膜的平均密度為1 080 kg·m-3，矩形細(xì)胞模型相關(guān)參數(shù)如表1所示[16-17]。

表1 細(xì)胞膜仿真材料參數(shù)

當(dāng)細(xì)胞膜的泊松比為0.25，楊氏模量為400 Pa時(shí)，通過(guò)仿真計(jì)算可知，矩形細(xì)胞模型最小特征頻率為41.202 kHz，為了簡(jiǎn)化仿真過(guò)程，超聲高次諧波產(chǎn)生的其余特征頻率暫時(shí)不予考慮。該特征頻率下的細(xì)胞模型振型如圖1所示，由于矩形的對(duì)稱性，圖1中的振型呈現(xiàn)對(duì)稱分布。

3 超聲刺激對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響

3.1 超聲細(xì)胞刺激系統(tǒng)

超聲細(xì)胞刺激系統(tǒng)共包括冷卻箱、水浴箱控制裝置和超聲刺激驅(qū)動(dòng)裝置三部分。冷卻箱主要是通過(guò)半導(dǎo)體制冷片進(jìn)行冷卻箱內(nèi)部循環(huán)水的降溫。超聲刺激驅(qū)動(dòng)裝置主要包括信號(hào)發(fā)生器(北京普源RIGOL DG 1012)，ATA-10功率放大器(西安安泰電子科技有限公司，內(nèi)部包括阻抗匹配器，機(jī)箱尺寸為260 mm×160 mm×60 mm)。

水浴箱控制裝置主要包括水浴槽、培養(yǎng)皿、顯示單元、壓電陶瓷超聲換能器(非聚焦型48 kHz、65 kHz和85 kHz)、溫度控制檢測(cè)單元、循環(huán)水控制單元以及中央控制單元等部分。綠豆種子最適生長(zhǎng)溫度約為25 ℃，為了得到良好的刺激環(huán)境，本裝置通過(guò)DS 18 B 20溫度傳感器實(shí)時(shí)進(jìn)行水溫檢測(cè)，溫度偏低時(shí)通過(guò)加熱片給予水溫補(bǔ)償，當(dāng)水溫超過(guò)25 ℃時(shí)通過(guò)循環(huán)水控制單元和冷卻箱對(duì)水浴槽進(jìn)行降溫。超聲換能器以陣列形式固定于水浴槽的底部背面，可以通過(guò)控制裝置對(duì)相應(yīng)頻率的換能器進(jìn)行選擇性激勵(lì)，因換能器在工作時(shí)會(huì)引起其正上方水槽底部水溫升高(當(dāng)水浴箱循環(huán)水關(guān)閉時(shí)，約升溫1.0 ℃)可能會(huì)影響該位置處細(xì)胞的生長(zhǎng)，如圖2所示，通過(guò)循環(huán)水控制單元驅(qū)動(dòng)水泵均勻水浴槽內(nèi)的水溫，并可起到一定的降溫作用。由于培養(yǎng)皿處于換能器上方10 mm左右處，經(jīng)測(cè)得該處水溫升高不足0.2 ℃，故忽略水溫對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響。

超聲細(xì)胞刺激系統(tǒng)如圖3所示。由信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生與換能器頻率匹配的具有特定激勵(lì)電壓的正弦信號(hào)，該信號(hào)傳輸?shù)焦β史糯笃?功率放大器增益×10,輸出阻抗為1Ω)產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)所需的超聲電功率，并最終驅(qū)動(dòng)換能器產(chǎn)生超聲波作用于綠豆種子。

3.2 材料與方法

1)材料：市售新鮮綠豆種子。

2)前期準(zhǔn)備：挑選實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量形態(tài)飽滿的綠豆種子，將綠豆種子用去離子水清洗兩次，并置于清水中浸泡3 h。使用清水浸泡綠豆可以提高種子含水量，解除休眠狀態(tài)，利于種子萌發(fā)，也可以增加種子內(nèi)膠體的親水性，提高原生質(zhì)的粘滯性。

3)實(shí)驗(yàn)步驟：將每組(30個(gè))綠豆置于培養(yǎng)皿中，分別放入水浴槽內(nèi)并固定于對(duì)應(yīng)換能器的上方10 mm左右處，調(diào)整好實(shí)驗(yàn)參數(shù)，最后對(duì)綠豆進(jìn)行規(guī)定時(shí)長(zhǎng)的超聲刺激。

4)后期處理：將超聲刺激后的實(shí)驗(yàn)組和空白超聲刺激的對(duì)照組綠豆種子在同一條件下統(tǒng)一培養(yǎng)。以12 h為一個(gè)周期統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的綠豆數(shù)目，以芽長(zhǎng)達(dá)到種子總長(zhǎng)的一半為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。每組評(píng)判指標(biāo)為種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)[18]：

(9)

本實(shí)驗(yàn)以第一周期種子的發(fā)芽個(gè)數(shù)進(jìn)行分析，以下統(tǒng)稱第一周期發(fā)芽率為初始發(fā)芽率。

(10)

其中，GI為發(fā)芽指數(shù)，Dt為發(fā)芽周期，Gt為一個(gè)周期內(nèi)發(fā)芽的種子個(gè)數(shù)。

3.3 超聲頻率對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響

在相同刺激時(shí)間和正弦波信號(hào)激勵(lì)電壓下，分別用頻率為48 kHz、65 kHz和85 kHz的超聲波換能器產(chǎn)生超聲作用于綠豆種子。挑選4組浸泡后的飽滿綠豆種子，每組種子為30顆，空白超聲刺激組作為無(wú)超聲作用的空白對(duì)照組(ck)，超聲頻率分別為48 kHz、65 kHz和85 kHz的刺激組作為實(shí)驗(yàn)組，每組刺激時(shí)間為35 min，信號(hào)激勵(lì)電壓為10 Vpp。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，如表2所示。依據(jù)表2數(shù)據(jù)得到經(jīng)48 h(4個(gè)周期)后種子的發(fā)芽指數(shù)和初始發(fā)芽率(圖4)。

根據(jù)表2和圖4可知，實(shí)驗(yàn)組種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均高于對(duì)照組，表明超聲刺激對(duì)種子的生長(zhǎng)活性和速度具有一定的促進(jìn)作用。頻率為48 kHz時(shí)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均高于其余各實(shí)驗(yàn)組，表明48 kHz超聲頻率相較于其他頻率更能夠使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)共振，從而促進(jìn)種子生長(zhǎng)，與仿真所得的矩形細(xì)胞特征頻率基本一致。

表2 不同超聲頻率下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)

3.4 刺激時(shí)間對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響

挑選6組綠豆種子，每組30顆，對(duì)照組(ck)施加空白超聲刺激，超聲刺激時(shí)間分別為25 min、30 min、35 min、40 min和45 min的刺激組作為實(shí)驗(yàn)組，各組超聲頻率為48 kHz，正弦波信號(hào)激勵(lì)電壓為10 Vpp，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，如表3所示。依據(jù)表3數(shù)據(jù)得到經(jīng)48 h(4個(gè)周期)后種子的發(fā)芽指數(shù)和初始發(fā)芽率(圖5)。

表3 不同刺激時(shí)間下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)

由表3和圖5可知，當(dāng)以最佳超聲頻率和一定信號(hào)激勵(lì)電壓刺激綠豆種子時(shí)，種子的初始發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)隨刺激時(shí)間的增加先升高后降低，在35 min時(shí)均達(dá)到最大。ck組、25 min組和45 min組的發(fā)芽指數(shù)差別不大，表明刺激時(shí)間較短對(duì)細(xì)胞活性影響不明顯，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。刺激時(shí)間為45 min時(shí)盡管發(fā)芽指數(shù)和ck組相一致，但初始發(fā)芽率有所下降，表明過(guò)度的超聲刺激會(huì)降低細(xì)胞活性，對(duì)種子的初期萌發(fā)速度產(chǎn)生抑制作用。

3.5 信號(hào)激勵(lì)電壓對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響

挑選4組綠豆種子，每組30顆，ck組給予空白超聲刺激，正弦波信號(hào)激勵(lì)電壓分別為5 Vpp、10 Vpp和15 Vpp的刺激組作為實(shí)驗(yàn)組，各組超聲頻率為48 kHz，刺激時(shí)間為35 min，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，如表4所示。依據(jù)表4數(shù)據(jù)得到經(jīng)48 h(4個(gè)周期)后種子的發(fā)芽指數(shù)和初始發(fā)芽率(圖6)。

表4 不同信號(hào)激勵(lì)電壓下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)

由表4和圖6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在最佳超聲頻率和刺激時(shí)間條件下，實(shí)驗(yàn)組綠豆發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均高于ck組，而5 Vpp組與ck組的發(fā)芽指數(shù)較為接近，表明超聲強(qiáng)度過(guò)低時(shí)不能對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生明顯影響。當(dāng)信號(hào)激勵(lì)電壓為10 Vpp時(shí)綠豆發(fā)芽指數(shù)最大，而當(dāng)超聲強(qiáng)度過(guò)大時(shí)綠豆生長(zhǎng)速度有所降低。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，超聲刺激綠豆的最佳參數(shù)是超聲頻率為48 kHz，刺激時(shí)間為35 min，信號(hào)激勵(lì)電壓為10 Vpp，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在此條件下進(jìn)行。

3.6 不同信號(hào)波形對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響

挑選8組綠豆種子，每組30顆，其中一組為對(duì)照組給予空白超聲刺激，標(biāo)記為ck，其余7組分別施加正弦信號(hào)、方波信號(hào)、三角波信號(hào)和不同占空比(20%、40%、60%和80%)的脈沖超聲信號(hào)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，如表5所示。依據(jù)表5數(shù)據(jù)得到經(jīng)48 h(4個(gè)周期)后種子的發(fā)芽指數(shù)和初始發(fā)芽率(圖7)。

由表5和圖7可知，不同波形條件下，經(jīng)超聲刺激的實(shí)驗(yàn)組初始發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均高于ck組，其中占空比為20%的脈沖信號(hào)綠豆發(fā)芽率最高，且高于ck組22%，表明脈沖波信號(hào)優(yōu)于連續(xù)波信號(hào)，而且不同波形的連續(xù)信號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有明顯差異。隨著脈沖信號(hào)占空比的升高，發(fā)芽率逐漸下降，表明強(qiáng)度過(guò)大的超聲脈沖信號(hào)會(huì)對(duì)綠豆細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定程度的抑制，減緩其發(fā)芽速度，但積極影響高于消極影響。

表5 不同信號(hào)波形下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)

3.7 不同NaCl鹽濃度下超聲刺激對(duì)綠豆生長(zhǎng)的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，植物種子的萌發(fā)會(huì)隨著鹽濃度的升高而降低，究其原因是因?yàn)殡x子的毒害作用。針對(duì)上述情況，本文創(chuàng)新性的選用低濃度NaCl溶液研究綠豆的萌發(fā)情況。挑選9組綠豆種子，每組30顆，其中一組為對(duì)照組，其余8組為實(shí)驗(yàn)組分別代表4種不同鹽濃度下(8.55 mmol·L-1、17.09 mmol·L-1、51.27 mmol·L-1和85.45 mmol·L-1)是否伴有超聲協(xié)同作用的情況，其中有超聲組標(biāo)記為“鹽濃度+U”。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，如表6所示。依據(jù)表6數(shù)據(jù)得到經(jīng)48 h(4個(gè)周期)后種子的發(fā)芽指數(shù)和初始發(fā)芽率(圖8)。

表6 不同NaCl鹽濃度下種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)

由表6和圖8可知，低濃度(8.55 mmol·L-1和17.09 mmol·L-1)鹽溶液對(duì)綠豆生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)鹽溶液濃度過(guò)高，則會(huì)由于鹽脅迫的影響使綠豆發(fā)芽速度減慢并遠(yuǎn)低于正常水平。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)超聲與鹽溶液協(xié)同作用時(shí)，綠豆種子生長(zhǎng)速度高于單一的鹽溶液條件，提高了種子的發(fā)芽率。當(dāng)鹽濃度為8.55 mmol·L-1時(shí)，有無(wú)超聲刺激對(duì)綠豆生長(zhǎng)影響不大，這可能是因?yàn)榫G豆種子適應(yīng)較低濃度鹽溶液，可以實(shí)現(xiàn)正常的離子交換而無(wú)需外力作用，當(dāng)鹽濃度為17.09 mmol·L-1時(shí)，在超聲的協(xié)同作用下可以極大地促進(jìn)綠豆發(fā)芽，并高于ck組41%。同樣，由于鹽脅迫的存在，即使給予超聲刺激，高濃度鹽溶液下種子發(fā)芽率會(huì)有所下降，雖然發(fā)芽率高于ck組，但長(zhǎng)勢(shì)(種子根長(zhǎng))明顯較差。

綜上所述，在超聲刺激細(xì)胞的過(guò)程中，適當(dāng)?shù)某晠?shù)能使細(xì)胞最大限度產(chǎn)生共振，經(jīng)超聲處理的種子表面呈現(xiàn)出許多小孔[19]，結(jié)合超聲的機(jī)械作用從而改變細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，提高種子的發(fā)芽速度與發(fā)芽率。

4 結(jié) 論

通過(guò)建立綠豆種子矩形細(xì)胞模型對(duì)其特征頻率進(jìn)行理論分析，并通過(guò)有限元仿真得到細(xì)胞特征頻率，從而確定超聲頻率的選擇范圍。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行設(shè)計(jì)了一種超聲刺激裝置，該裝置采用的超聲換能器以陣列形式固定于水浴槽底部背面，可實(shí)現(xiàn)水溫的檢測(cè)與控制、水流量調(diào)節(jié)以及超聲換能器頻率選擇等功能，該裝置集多功能于一體，操作簡(jiǎn)單，使用便捷。

使用自制裝置對(duì)綠豆種子進(jìn)行超聲刺激實(shí)驗(yàn)，分別研究了超聲頻率、刺激時(shí)間和信號(hào)激勵(lì)電壓對(duì)綠豆發(fā)芽的影響，并在此基礎(chǔ)上研究了連續(xù)波和脈沖波超聲以及超聲協(xié)同不同濃度的氯化鈉對(duì)綠豆發(fā)芽的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在適當(dāng)?shù)某曨l率范圍內(nèi)，刺激時(shí)間不足或信號(hào)激勵(lì)電壓過(guò)低不能對(duì)種子產(chǎn)生明顯影響，當(dāng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)超出一定范圍則會(huì)對(duì)種子初期生長(zhǎng)速度產(chǎn)生抑制作用。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)得到綠豆發(fā)芽的最優(yōu)方案為當(dāng)脈沖波占空比為20%時(shí)，在48 kHz、35 min、10 Vpp條件下綠豆發(fā)芽率最高，最佳頻率與仿真計(jì)算所得的矩形細(xì)胞特征頻率(41.202 kHz)基本一致，而且體積摩爾濃度為17.09 mmol·L-1的NaCl協(xié)同超聲處理可以極大地加速綠豆發(fā)芽。對(duì)于陳年種子來(lái)說(shuō)，由于儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致種子活力損失，發(fā)芽率大幅下降，不利于后期的培育。因此，本研究提供了一種新的思路，通過(guò)超聲與低濃度的NaCl溶液協(xié)同作用，以實(shí)現(xiàn)種子的高發(fā)芽率。