基于SRAP標(biāo)記的大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

李晉華, 冷家歸, 羅莉斯, 王少銘, 侯穎輝, 李德文

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料研究所, 貴陽(yáng) 550006; 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所， 貴陽(yáng) 550006)

大蒜(AlliumsativumL.)是百合科蔥屬一年生草本植物，具有較高的藥用和食用價(jià)值，用途廣泛、加工產(chǎn)品種類(lèi)多樣，深受人們的喜愛(ài)。我國(guó)是世界上最大的大蒜生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，大蒜品種資源豐富，種植區(qū)域廣泛。近年來(lái)，培育出了很多符合不同需求的新品種，但是由于定向選育與淘汰在增加了大蒜品種的同時(shí)，也降低了遺傳多樣性。為了更有效地保護(hù)和利用大蒜種質(zhì)資源，對(duì)大蒜的研究也越來(lái)越受重視[1-3]。

目前關(guān)于大蒜的研究主要集中在品種培育[4]、病蟲(chóng)害防治[5-6]、生化成分[7]、遺傳多樣性[8-9]等方面。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳多樣性已經(jīng)從形態(tài)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記發(fā)展到分子標(biāo)記技術(shù)?；诨蚪M水平的分子標(biāo)記技術(shù)在大蒜遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用，劉新雨等[10]從大蒜轉(zhuǎn)錄組序列中共鑒定出141 132個(gè)SSR位點(diǎn)，利用篩選到的6條SSR引物對(duì)35份供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)性條帶為26條，在遺傳相似系數(shù)0.756 9處35份材料被分為五類(lèi)。王海平等[11]用AFLP、SSR 和 InDel 三種標(biāo)記分析212份大蒜種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳背景，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種標(biāo)記的引物共獲得清晰可辯的位點(diǎn)502個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn) 492 個(gè)，不同引物揭示的大蒜基因多樣性指數(shù)分布在 0.17～0.38之間。王丹丹等[12]采用正交實(shí)驗(yàn)建立了大蒜近緣種的SRAP反應(yīng)體系，為大蒜近緣種進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplifiedpolymorphism,SRAP)是一種新型的基于 PCR 擴(kuò)增的標(biāo)記技術(shù)[14]。由于 SRAP 具有不需預(yù)知物種的序列信息、高效快速、多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[15]，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定[16]、遺傳多樣性與親緣關(guān)系等領(lǐng)域[17]。本研究以貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料研究所種植的96份大蒜種質(zhì)資源為材料，通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)探索其遺傳多樣性與群體的親緣關(guān)系，為大蒜種植資源的保護(hù)、利用及進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試的96份大蒜種質(zhì)資源種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料研究所貴陽(yáng)試驗(yàn)地香料資源圃(北緯26°，東經(jīng)106°，海拔1 127 m)，其中74份來(lái)自貴州省的9個(gè)市、自治州，其余22份分別來(lái)自重慶、云南、湖北等8個(gè)省、直轄市(表1)。主要試劑：dNTPs、10×TaqBuffer(Mg2+)、Taq酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，DL 1500 DNA Marker購(gòu)自中國(guó)高端生物試劑有限公司，瓊脂糖、30%聚丙烯酰胺、50×TAE Buffer等均購(gòu)自索萊寶生物工程(北京)有限公司。主要儀器：NanoDropTMND-1000核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo，美國(guó))、C 1000 Touch PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))、DYCZ-30 C型雙板夾芯式垂直電泳儀和DYY-6 C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源(北京六一生物有限公司)。

表1 供試材料的基本信息

1.2 基因組DNA提取與檢測(cè)

選取大蒜嫩葉，采用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA，在提取液中加入2% 的 β-巰基乙醇以除去酚類(lèi)物質(zhì)。DNA濃度在微量核酸濃度測(cè)定儀上測(cè)定，然后通過(guò)用1%的瓊脂糖凝膠95 V電泳30 min檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量與完整性。

1.3 PCR電泳

SRAP引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，從 864 對(duì)引物組合中篩選出22對(duì)擴(kuò)增清晰、重復(fù)性好的引物組合，采用降落PCR(touchdown PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP-PCR擴(kuò)增體系為10.0 μL：模板DNA 1.5 μL，dNTPs 0.2 μL，10×TaqBuffer(Mg2+)1 μL，Taq酶 0.2 μL，Me引物0.5 μL，Em引物 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至10.0 μL，每個(gè)PCR反應(yīng)體系設(shè)2個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃ 45 s，53～48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，退火溫度每循環(huán)下降0.5 ℃；94 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，恒壓 300 V，電泳1 h，用銀染法顯色，然后拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

電泳結(jié)束后進(jìn)行人工讀帶，在相同的位置上清晰的條帶記為1，沒(méi)有的條帶記為0，建立0，1原始矩陣。統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，其中，多態(tài)性條帶比率P(%)=(多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù))×100%。用Popgene 32軟件統(tǒng)計(jì)觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)。根據(jù)Popgene 32軟件計(jì)算出的遺傳一致度利用NTSYS pc-2.1軟件按非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

用篩選出的22對(duì)引物對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1～圖2)。從擴(kuò)增結(jié)果(表2)可以看出，22對(duì)引物共擴(kuò)出173條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)出7.86條，其中多態(tài)性條帶161條，多態(tài)性條帶比率為93.66%，不同的引物擴(kuò)出的總條帶數(shù)有差異，多態(tài)性條帶數(shù)介于5～10之間，平均每對(duì)引物檢測(cè)出的多態(tài)性位點(diǎn)為7.32條。擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多的引物組合是Me 26-Em 18，擴(kuò)出了10條帶；其次為Me 7-Em 13、Me 7-Em 17，擴(kuò)出9條帶；擴(kuò)增條帶最少的是Me 7-Em 22和Me 8-Em 20，都只擴(kuò)出了5條帶。PIC在0.635 7～0.889 7之間，引物組合Me 7-Em 22的PIC最低，為0.635 7，Me 26-Em 18的PIC最高，為0.889 7。無(wú)論是擴(kuò)增條帶的大小，還是擴(kuò)增條帶的多少，不同的引物在同一個(gè)采樣點(diǎn)大蒜樣品的擴(kuò)增結(jié)果存在差異，同一引物在不同材料之間的擴(kuò)增結(jié)果也不同。這說(shuō)明供試的大蒜種質(zhì)資源間存在豐富的多態(tài)性。因此，利用SRAP分子標(biāo)記可以從DNA水平檢測(cè)出大蒜種質(zhì)資源間的差異。

表2 SRAP 引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

2.2 大蒜種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

用Popgene 32軟件對(duì)96份大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，遺傳一致度范圍為0.347 8～0.819 9，遺傳距離范圍為0.035 1～0.802 4，Na為2.000，Ne為1.800 0，H為0.434 8，平均I為0.623 3，大蒜雖為無(wú)性繁殖植物，但具有一定的遺傳多樣性。

利用NTSYS-pc 2.1軟件對(duì) 96份大蒜材料進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到相應(yīng)的UPGMA樹(shù)狀圖(圖3)，在遺傳相似系數(shù)為0.58時(shí)將96份供試材料分為五類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)包含73份大蒜材料，第Ⅱ類(lèi)包含8份大蒜材料，第Ⅲ類(lèi)包含一份大蒜材料，第Ⅳ類(lèi)包含8份大蒜材料，第Ⅴ類(lèi)包含6份大蒜材料。

2.3 不同大蒜群體種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

利用Popgene 32軟件對(duì)18個(gè)大蒜群體之間的遺傳距離和遺傳一致度進(jìn)行計(jì)算(表3)，結(jié)果表明，遺傳一致度范圍為0.633 5～0.974 4，遺傳距離范圍為0.025 9～0.456 4。遺傳一致度最高的是畢節(jié)與凱里的供試大蒜材料，其遺傳距離為0.025 9，遺傳一致度最低的是江蘇與四川的供試材料，其遺傳距離值最大為0.456 4，說(shuō)明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表3 供試材料的遺傳一致度與遺傳距離

對(duì)供試的18個(gè)大蒜群體進(jìn)行遺傳多樣數(shù)參數(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。18個(gè)群體的Na在1.000 0～1.962 7之間，Ne在1.000 0～1.605 5之間，H介于0.144 1～0.355 7之間，I在0.210 3～0.529 7之間，N.P.B在56～155之間，PPB介于34.78%～96.27%之間。四川和江西這兩個(gè)地點(diǎn)都只有一份供試材料，因此Na和Ne都是1.000 0。H、I、N.P.B、PPB都是安順市的大蒜群體多樣性最低，說(shuō)明該地大蒜的遺傳多樣性最低，遵義市大蒜群體的各個(gè)遺傳多樣性指數(shù)均為最高，說(shuō)明其遺傳多樣性最高。

表4 18個(gè)供試大蒜群體的遺傳多樣性指數(shù)

96份供試大蒜種質(zhì)資源總的遺傳多樣性指數(shù)如表5所示，群體總基因多樣性Ht為0.363 3，群體內(nèi)基因多樣性Hs為0.232 3，Gst為0.360 4，Nm為0.887 4。整體來(lái)說(shuō)，96份供試大蒜資源的多樣性較豐富，群體內(nèi)的基因多樣性較高，群體間和群體內(nèi)的基因交流較為頻繁，供試材料豐富的遺傳多樣性可以為種質(zhì)資源的保護(hù)、利用和良種培育提供材料。

表5 96份供試材料的遺傳多樣性指數(shù)

2.4 UPGMA聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件對(duì)18個(gè)大蒜群體進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到相應(yīng)的UPGMA樹(shù)狀圖(圖4)，在遺傳相似系數(shù)為0.83時(shí)，將供試大蒜群體分為五類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)包含貴州省的遵義、六盤(pán)水、凱里、畢節(jié)、貴陽(yáng)、銅仁、黔西南、黔南、黔東南以及甘肅、山東、湖北、云南、重慶14個(gè)大蒜群體;第Ⅱ類(lèi)為湖南大蒜群體；第Ⅲ類(lèi)為貴州省安順市大蒜群體；第Ⅳ類(lèi)為江蘇省大蒜群體；第Ⅴ類(lèi)為四川省大蒜群體。

第一類(lèi)在遺傳系數(shù)為0.88時(shí)被分成七個(gè)亞類(lèi)。第一個(gè)亞類(lèi)包含貴州省5個(gè)市大蒜材料和甘肅省的4份大蒜材料，說(shuō)明甘肅省與貴州省5個(gè)市的大蒜材料遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近；第二個(gè)亞類(lèi)為山東的大蒜群體；第三個(gè)亞類(lèi)為湖北的大蒜群體；第四個(gè)亞類(lèi)為銅仁的大蒜群體；第五個(gè)亞類(lèi)為云南的大蒜群體；第六個(gè)亞類(lèi)為重慶的大蒜群體；第七個(gè)亞類(lèi)為黔東南苗族侗族自治州的大蒜群體?？梢?jiàn)，大蒜種質(zhì)資源聚類(lèi)結(jié)果主要由品種差異決定，受地域影響較小。

3 結(jié)論與討論

SRAP 分子標(biāo)記具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析研究。王少銘等[18]利用 SRAP 分子標(biāo)記對(duì)48份薄荷種質(zhì)資源進(jìn)行了親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試薄荷種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)范圍為0.67～0.97；張穎聰?shù)萚19]利用28 對(duì) SRAP 引物，對(duì) 20 份番木瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。此外，SRAP 分子標(biāo)記在香蕉[20]、菠蘿[21]、菠蘿蜜[22]等作物上都有相關(guān)應(yīng)用。由此說(shuō)明，SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)能較好地反映種質(zhì)資源的遺傳變異，可用于開(kāi)展大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

本研究以收集的18個(gè)群體96份大蒜種質(zhì)資源為材料，分析其遺傳多樣性。PCR反應(yīng)中，引物的退火溫度直接影響擴(kuò)增結(jié)果，因此在實(shí)驗(yàn)中需要花費(fèi)大量的時(shí)間來(lái)摸索最適的退火溫度，利用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置溫度區(qū)間進(jìn)行降溫?cái)U(kuò)增，在不需要摸索退火溫度的前提下就可以到達(dá)最好的擴(kuò)增效果。從擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，22對(duì)引物共擴(kuò)出161條多態(tài)性條帶，引物的PIC在0.64～0.89之間，SRAP 標(biāo)記的遺傳相似性系數(shù)范圍為 0.67～0.97, 表明 96 份大蒜種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。對(duì) 96 份大蒜種質(zhì)資源的 SRAP 分子標(biāo)記進(jìn)行聚類(lèi)分析，在遺傳相似系數(shù)約為 0.83 時(shí)96 份大蒜種質(zhì)資源分成 5 個(gè)群集。引物的多態(tài)性不僅反映了大蒜種質(zhì)基因組的多態(tài)性，也反映了遺傳變異的差異性。

目前，有關(guān)大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析研究已有報(bào)道。劉新雨等[10]隨機(jī)選擇的14對(duì)SSR引物中有12對(duì)引物能進(jìn)行有效擴(kuò)增，其中有6對(duì)具有良好的多態(tài)性，多態(tài)率達(dá)50%，平均每對(duì)多態(tài)性引物可擴(kuò)增得到4.33條帶，低于本研究的7.63條，表明SRAP標(biāo)記對(duì)大蒜種質(zhì)資源的多態(tài)性檢出率高于SSR。對(duì)35份大蒜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣分析，結(jié)果顯示35份種質(zhì)可聚為五大類(lèi)群，遺傳相似系數(shù)為0.67～0.97, 高于本研究的0.70～0.97，說(shuō)明本研究所采用的大蒜種質(zhì)資源遺傳背景相對(duì)較窄，今后應(yīng)加強(qiáng)大蒜種質(zhì)資源的引進(jìn)與利用。

本研究中大蒜的 SRAP 分子標(biāo)記聚類(lèi)分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類(lèi)結(jié)果基本相同，但也存在差異，可能與取樣過(guò)程中量的多少、基因組 DNA 的提取方法、PCR 擴(kuò)增體系的異同等有一定的關(guān)系。自然環(huán)境條件的復(fù)雜性、多樣性也可能是造成這種差異的原因。隨著標(biāo)記技術(shù)的不斷成熟與應(yīng)用，更多的分子生物學(xué)方法將被應(yīng)用于大蒜種質(zhì)資源的鑒定和親緣關(guān)系的研究中，如SSR[23]、ISSR、AFLP 等。在今后的研究工作中，應(yīng)進(jìn)一步采取多種分子標(biāo)記法對(duì)同一大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析。