MTHFR MTRR基因多態(tài)性及血同型半胱氨酸水平與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性

許小偉 謝海洋 秦延昆 邵祥忠 曹 建

腦梗死是臨床常見的一種腦血管病癥，主要是由于腦供血突然中斷引起，可由動(dòng)脈粥樣硬化誘發(fā)。血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)是影響Hcy代謝水平的關(guān)鍵作用酶。目前，關(guān)于MTHFR基因及MTRR基因、血漿Hcy水平、頸動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死三者的關(guān)系尚存在一定的爭議，部分學(xué)者認(rèn)為MTHFR基因及MTRR基因發(fā)生突變，可導(dǎo)致血漿Hcy水平顯著提高，而高水平Hcy可引發(fā)頸動(dòng)脈內(nèi)彈力層斷裂，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移增殖，改變血小板功能及凝血系統(tǒng)，最終誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。亦有學(xué)者認(rèn)為MTHFR基因突變雖然可導(dǎo)致血漿Hcy水平提高，但其和動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死并無顯著相關(guān)性。因此，本研究主要探究MTHFR、MTRR基因多態(tài)性及血Hcy水平與ACI的相關(guān)性，旨在為ACI的臨床防治提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2020年10月就診于海安市人民醫(yī)院的45例ACI患者作為觀察組，另選取同期于海安市人民醫(yī)院進(jìn)行健康體檢、并經(jīng)頸動(dòng)脈彩超檢查證實(shí)無動(dòng)脈粥樣硬化的非ACI體檢者40例作為對照組。兩組研究對象性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、吸煙、飲酒、糖尿病及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患病情況，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，觀察組高脂血癥及高血壓比例高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

續(xù)表1

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察組患者均確診為腦梗死；②參照急性卒中治療低分子肝素試驗(yàn)(trial of org 10172 in acute stroke treatment，TOAST)分型標(biāo)準(zhǔn)和經(jīng)頸動(dòng)脈彩超檢查，觀察組患者均確診為大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死；③臨床資料完整的受試者；④受試者或家屬均簽定知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤、惡性貧血、甲狀腺疾病、肝腎功能障礙、慢性胃腸道疾病等影響Hcy水平的疾?。虎诤喜?yán)重心臟疾??；③近期服用過葉酸、茶堿、甲氨蝶呤等；④中途退出研究者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本DNA的采集和基因分型 所有研究對象抽取空腹肘靜脈血1 mL，置于抗凝管中，采用基因組DNA提取試劑盒(上海博升生物科技有限公司)，按照操作說明提取受試者DNA。采用Taqman-MGB探針法對MTHFR 677C/T(rs1801133)、MTHFR 1298A/C(rs1801131)、MTRR 66A/G(rs1801394)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，所用試劑和儀器均由上海恒斐生物科技有限公司提供。再分別對上述三個(gè)位點(diǎn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，其反應(yīng)體系的總體積均為10 μL，包括了1 μL 20 ng/μL DNA模板、5 μL 2×TaqMan Universal Master Mix、0.5 μL 20×TaqManMGB探針、3.5 μL去離子水。在95℃ 10 min條件下反應(yīng)，95℃ 15 s、60℃ 1 min條件下擴(kuò)增，共20個(gè)循環(huán)；最后在89℃ 15 s、60℃ 90 s條件下擴(kuò)增，共30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束，即在熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)儀(美國ABI公司，型號：7900)對樣本孔終點(diǎn)熒光進(jìn)行讀取，通過分析軟件對各樣本基因分型的結(jié)果進(jìn)行確定。

1.3.2 血Hcy的檢測 所有研究對象入組后，抽取空腹肘靜脈血4 mL，置于EP管內(nèi)，在常溫下靜置1 h后，采用離心法分離血清，于-80℃保存待測。采用自動(dòng)生化分析儀(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司)檢測Hcy水平。

1.4 資料整理和觀察指標(biāo) 收集兩組研究對象一般資料，包括性別、年齡、吸煙、飲酒、高脂血癥、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、血Hcy水平，以及MTHFR、MTRR基因型分布情況等。①比較兩組MTHFR和MTRR基因型分布情況；②比較兩組血Hcy水平；③分析ACI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象MTHFR和MTRR基因型比較 觀察組對象MTHFR rs1801133基因型、MTRR rs1801394基因型與對照組存在差異(

P

<0.05)，而兩組對象MTHFR rs1801131基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象MTHFR和MTRR基因型分布情況比較[例(%)]

2.2 兩組研究對象血Hcy水平的比較 觀察組血Hcy水平為(18.02±0.62)μmol/L，對照組為(7.35±0.10)μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=13.864，

P

<0.001)。2.3 ACI發(fā)生的多因素分析 將單因素分析有差異的因素納入多因素logistic回歸分析中，包括高脂血癥、高血壓、血Hcy水平、MTHFR rs1801133基因型、MTRR rs1801394基因型，賦值見表3。結(jié)果顯示，高脂血癥、高血壓、血Hcy水平>15 μmol/L、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是ACI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

P

<0.05)。見表4。

表3 ACI危險(xiǎn)因素logistic回歸分析變量賦值表

表4 ACI危險(xiǎn)因素logistic回歸分析

3 討論

我國ACI發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人民群眾身體健康和生命安全。高水平Hcy是多種心腦血管疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，當(dāng)Hcy水平異常升高、MTHFR和MTRR發(fā)生基因突變時(shí)，即會(huì)引發(fā)高水平Hcy。本研究就MTHFR和MTRR基因多態(tài)性及血Hcy水平與ACI疾病發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為預(yù)防ACI的發(fā)生提供參考。

目前，關(guān)于ACI發(fā)病的危險(xiǎn)因素研究較多，但不同學(xué)者結(jié)果不盡相同，笪正等通過回顧性分析446例急性腦梗死患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)急性腦梗死發(fā)病與患者年齡、基線收縮壓、卒中嚴(yán)重程度、C反應(yīng)蛋白以及責(zé)任動(dòng)脈閉塞關(guān)系密切。劉磊等通過分析78例急性腦梗死的臨床資料，發(fā)現(xiàn)血清超敏C反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原、低密度脂蛋白是急性腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素，其中血清超敏C反應(yīng)蛋白可作為急性腦梗死患者病情嚴(yán)重程度的判定指標(biāo)。然而大多數(shù)研究并未將MTHFR和MTRR基因型納入急性腦梗死危險(xiǎn)因素分析中。本研究結(jié)果顯示，高脂血癥、高血壓是ACI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中高血脂是動(dòng)脈內(nèi)斑塊形成、動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈管腔狹窄的重要原因，而高血壓可加大動(dòng)脈壁環(huán)狀擴(kuò)展范圍，提高顱內(nèi)動(dòng)脈壁剪應(yīng)力，進(jìn)而改變張應(yīng)力和血流，最終誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化形成，針對ACI發(fā)病高危人群，應(yīng)當(dāng)平穩(wěn)的控制血壓及血脂水平。

本研究結(jié)果顯示，血Hcy水平>15 μmol/L、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因亦是ACI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Hcy是機(jī)體蛋氨酸代謝過程中所產(chǎn)生的一種含硫氨基酸，雖然目前發(fā)現(xiàn)血漿Hcy水平與腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度、腦梗死分型無明顯相關(guān)性，但證實(shí)高水平Hcy是腦血栓形成獨(dú)立危險(xiǎn)因素。高水平的Hcy引發(fā)ACI的機(jī)制較為復(fù)雜，包括損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、增加顱內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端阻力、影響凝血纖溶系統(tǒng)、促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖等。而MTHFR是Hcy再甲基化成為蛋氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，MTHFR C677T基因突變的純合子TT可降低MTHFR活性，引起血Hcy水平的升高，促進(jìn)高水平Hcy的發(fā)生及發(fā)展，最終誘導(dǎo)ACI的發(fā)生。其等位基因與動(dòng)脈中彈力層的斷裂發(fā)生密切相關(guān)，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中，T基因能夠?qū)⑵交〖?xì)胞遷至內(nèi)膜，對ACI的發(fā)生及發(fā)展起到了促進(jìn)作用。MTRR基因位于5p15.2～15.3，主要多態(tài)性即為66A→G，即異亮氨酸取代了蛋氨酸，MTRR參與了蛋氨酸合成酶(methionine synthase，MS)活性的恢復(fù)，其能夠有效維持細(xì)胞中四氫葉酸和蛋氨酸水平，而MS又是機(jī)體代謝Hcy的關(guān)鍵酶，因此MTRR發(fā)生基因突變也會(huì)引起Hcy水平異常升高，繼而促進(jìn)ACI的發(fā)生。

綜上所述，高脂血癥、高血壓、高水平Hcy、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是ACI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床應(yīng)采取針對性預(yù)防干預(yù)措施，以降低ACI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而本研究樣本量較小，結(jié)果仍需大樣本、高質(zhì)量、多中心研究進(jìn)一步證實(shí)。此外MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是否能通過其他途徑影響ACI的發(fā)生及發(fā)展仍需進(jìn)一步探索。