一鍋法合成去甲基麻黃素

羅 磊，穆曉清，吳 濤，聶 堯，徐 巖

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122；2.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,宿遷 223800）

去甲基麻黃素（NE）是一種多功能的手性胺化合物，不僅可作為藥物活性分子［1］用于合成新型硫脲類(lèi)和噻唑烷類(lèi)抗癌藥物［2］，還可作為有機(jī)合成中的配體和手性助劑［3］，如合成抗艾滋病藥物依非韋倫的關(guān)鍵手性助劑（1R，2S）-N-吡咯烷基去甲麻黃素［4］.研究發(fā)現(xiàn)，NE在5000種不同的反應(yīng)中被用作反應(yīng)物［5］.NE的合成路線具有挑戰(zhàn)性，目前報(bào)道的生產(chǎn)方法主要包括提取法、化學(xué)法、化學(xué)酶法和生物法.提取法直接從麻黃原料中提取NE，但其絕對(duì)含量低［6］，工業(yè)應(yīng)用受到限制.化學(xué)法反應(yīng)步驟冗長(zhǎng)，環(huán)境污染嚴(yán)重［7］.化學(xué)酶法首先利用丙酮酸脫羧酶（PDC）［8，9］、乙醛羥酸合成酶（ASAHI）［10～12］或麻黃堿脫氫酶（EDH）［13］生物催化合成中間體L-苯基乙酰基甲醇（R-PAC），再經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)制備N(xiāo)E［14］.ASAHI因其活力高、轉(zhuǎn)化率和選擇性高且副產(chǎn)物少被廣泛應(yīng)用.雖然，上述方法可大規(guī)模生產(chǎn)獲得NE［15］，但產(chǎn)物為外消旋體，需進(jìn)一步拆分，分離過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，并產(chǎn)生大量有機(jī)廢物.生物法具有環(huán)境友好和選擇性高等特點(diǎn)，已經(jīng)成為合成NE的研究熱點(diǎn).目前，生物法制備N(xiāo)E主要以苯基乙?；状迹≒AC）和有機(jī)胺為底物，通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶選擇性合成光學(xué)純NE，但PAC價(jià)格昂貴.2013年，Pohl等［16］以苯甲醛、丙酮酸和丙氨酸為廉價(jià)底物經(jīng)二步法合成了NE，但采用一鍋法反應(yīng)策略時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶會(huì)催化苯甲醛產(chǎn)生副產(chǎn)物苯甲胺，從而降低了產(chǎn)率.2014年，Pohl等［17］又通過(guò)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)氨酶和醇脫氫酶，以1-苯基-1，2-丙二酮為底物，經(jīng)二步法合成NE，但反應(yīng)效率較低；同時(shí)，為了克服轉(zhuǎn)氨酶存在的反應(yīng)平衡問(wèn)題，需添加過(guò)量的輔助底物有機(jī)胺供體，增加了產(chǎn)物分離難度.目前，生物法合成NE普遍存在底物載量較低和反應(yīng)效率低等問(wèn)題.因此，構(gòu)建高效的PAC制備N(xiāo)E的生物合成途徑尤為重要.

目前，可用于PAC制備N(xiāo)E的酶主要包括轉(zhuǎn)氨酶［18，19］、亞胺還原酶［20～23］和胺脫氫酶等［24］.轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)需要有機(jī)胺供體，增加了產(chǎn)物的分離難度，且存在反應(yīng)平衡問(wèn)題；亞胺還原酶催化反應(yīng)活力較低，限制了其應(yīng)用；而胺脫氫酶則以廉價(jià)的無(wú)機(jī)氨為氨基供體，副產(chǎn)物僅為水，原子效率高，因此被認(rèn)為是更加綠色的高效合成途徑.由于天然胺脫氫酶來(lái)源少，底物譜狹窄，限制了其工業(yè)應(yīng)用.近年來(lái)，隨著定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展［25，26］，越來(lái)越多的工程化胺脫氫酶被發(fā)掘.2012年，Bommarius等［27，28］定向進(jìn)化了來(lái)源于Bacillusstereothermophilus的亮氨酸脫氫酶和來(lái)源于Bacillusbadius的苯丙氨酸脫氫酶，獲得的胺脫氫酶（BsAmDH和BbAmDH）可用于催化手性胺的合成.2020年，Zheng等［29］首次報(bào)道了源于Geobacillus kaustophilus的胺脫氫酶（GkAmDH）可催化外消旋底物PAC的還原反應(yīng)，并進(jìn)一步對(duì)78位和276位進(jìn)行飽和突變，提高了對(duì)外消旋底物PAC的催化活力.

本文通過(guò)級(jí)聯(lián)ASAHI催化縮合反應(yīng)和BbAmDH催化還原胺化反應(yīng)，以廉價(jià)底物苯甲醛、丙酮酸和NH4Cl為原料，構(gòu)建了合成NE的新途徑（Scheme 1），并通過(guò)反應(yīng)過(guò)程控制策略，有效解除了ASAHI的底/產(chǎn)物抑制，提高了底物苯甲醛的載量和轉(zhuǎn)化效率.

Scheme 1 Cascade reaction of synthetizing norephedrine catalyzed by the ASAHI and Bb AmDH

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

重組表達(dá)菌株E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）和咪唑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；卡那霉素和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）購(gòu)于上海索萊寶生物科技有限公司；引物合成和質(zhì)粒測(cè)序由無(wú)錫天霖生物科技有限公司完成；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega公司；DNA Marker，蛋白Marker，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ，BamHⅠ，EcoRⅠ和高保真DNA聚合酶（PrimeSTAR Max DNA Polymerase）購(gòu)于大連Takara公司；同源重組試劑盒（ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit）購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；L-苯基乙?；状迹≧-PAC）購(gòu)于江蘇艾康公司.AKTA PURIFIER 100型全自動(dòng)蛋白層析系統(tǒng)，美國(guó)General Electric Company公司；FC型酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；C1000 Touch型基因擴(kuò)增（PCR）儀，美國(guó)Bio-Rad公司；VCX750型超聲破碎儀，美國(guó)Sonic公司；Waters ACQUITY UPLC-MS/MS型液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用儀，沃特世科技（上海）有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 重組菌株的誘導(dǎo)與表達(dá) 將重組菌E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)接到700 mL相同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8；向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，于20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜后，收集菌體，于-20℃冷藏保存，用于催化反應(yīng).

1.2.2 蛋白純化 將細(xì)胞重懸于緩沖液A（100 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl+20 mmol/L咪唑，pH=7.5）中，超聲破碎，于4℃，12000 r/min條件下離心30 min；上層清液用0.22μm水系濾膜過(guò)濾后，上樣至Ni-NTA親和層析預(yù)裝柱中，然后用緩沖液A洗滌，再用緩沖液B（100 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl+500 mmol/L咪唑，pH=7.5）進(jìn)行梯度洗脫，收集目的蛋白；將目的蛋白用超濾管脫鹽濃縮，并添加終體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油，于-80℃保存，備用.

1.2.3 酶活力的測(cè)定E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI酶活測(cè)定體系包括100 mmol/L磷酸緩沖溶液，40 mmol/L苯甲醛，80 mmol/L丙酮酸，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，10%（體積分?jǐn)?shù)）DMSO和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI，液相測(cè)定苯甲醛消耗.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI酶活力單位（U）定義為每分鐘催化反應(yīng)1μmol苯甲醛的酶活力.酶比活力（U/g）定義為每克E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI細(xì)胞所含的酶活力單位數(shù).

BbAmDH酶活力測(cè)定體系總體積為200μL，包括NH4Cl/NH4OH（pH=9.5，0.7 mol/L），R-PAC（10 mmol/L），NADH（0.2 mmol/L）及適量純酶液，檢測(cè)340 nm處吸光值的變化.酶活力單位（U）定義為每分鐘催化氧化1μmol NADH的酶活力.酶比活力（U/g）定義為每克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù).

1.2.4 分析方法 苯甲醛和PAC的HPLC分析：Diomansil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），進(jìn)樣量10μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫40℃.0～6 min，10%～13%乙腈（體積分?jǐn)?shù)）；6～15 min，13%～30%乙腈；15～30 min，30%乙腈；31～35 min，10%乙腈；PAC在17.3 min出峰，苯甲醛在23 min出峰.R-PAC手性分析：氣相色譜（GC-FID），Agilent J＆W CP-Chiralsil-DEX CB色譜柱（25 m×0.32 mm×0.25 μm），升溫程序：起始溫度100℃，以5℃/min速率升溫至200℃；NE采用LC-MS檢測(cè)［30］.

2 結(jié)果與討論

2.1 ASAHI和Bb AmDH的表達(dá)與活力測(cè)定

以R-PAC為底物對(duì)本實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了具有催化R-PAC活力的胺脫氨酶BbAmDH.對(duì)ASAHI和BbAmDH重組菌株進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，ASAHI和BbAmDH在目的分子量60000和40000附近分別有明顯條帶（圖1），表明ASAHI和BbAmDH均能可溶性表達(dá).酶活力測(cè)定結(jié)果表明，E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI對(duì)苯甲醛的活力為11.7 U/mg；BbAmDH對(duì)R-PAC的活力為3.2 U/mg.進(jìn)一步在BbAmDH中引入突變K78S/N276C［29］，突變株對(duì)R-PAC的活力提高至4.3 U/mg，是原始株的1.34倍.

2.2 NE前體物質(zhì)R-PAC的生物合成

2.2.1E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化合成R-PAC的條件優(yōu)化 通過(guò)考察反應(yīng)溫度對(duì)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化縮合反應(yīng)效率的影響發(fā)現(xiàn)，合成R-PAC的最適反應(yīng)溫度在30～40℃間，當(dāng)溫度超過(guò)45℃時(shí)，R-PAC產(chǎn)率下降，50℃時(shí)R-PAC產(chǎn)率不足50%［圖2（A）］.通過(guò)考察反應(yīng)pH值對(duì)縮合反應(yīng)效率的影響發(fā)現(xiàn)，最適反應(yīng)pH值為7，酸性條件不利于催化；在堿性條件下，隨著pH值的升高，催化效率下降，當(dāng)pH=11時(shí)，細(xì)胞喪失催化活力［圖2（B）］.已有研究表明，高濃度的苯甲醛和R-PAC會(huì)抑制ASAHI催化縮合反應(yīng)的效率［31］.通過(guò)考察不同濃度苯甲醛對(duì)縮合反應(yīng)效率的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)苯甲醛濃度低于40 mmol/L，其轉(zhuǎn)化率為99%，R-PAC產(chǎn)率為93%，此時(shí)苯甲醛對(duì)反應(yīng)無(wú)抑制；當(dāng)苯甲醛濃度超過(guò)40 mmol/L，其轉(zhuǎn)化率逐漸下降，表明苯甲醛濃度超過(guò)40 mmol/L會(huì)對(duì)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI產(chǎn)生底物抑制［圖2（C）］.通過(guò)考察R-PAC濃度對(duì)縮合反應(yīng)效率的影響發(fā)現(xiàn)，在初始反應(yīng)體系中添加不同濃度R-PAC均會(huì)對(duì)該反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，隨著添加的R-PAC濃度的增加，抑制作用加強(qiáng)，當(dāng)添加的R-PAC濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí)，R-PAC產(chǎn)率僅為5%［圖2（D）］，表明E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI對(duì)R-PAC反饋抑制較敏感.

Fig.1 SDS-PAGE analysisM：protein marker；lanes 1 and 2：crude enzyme/cell-free extracts for ASAHI；lanes 3 and 4：crude enzyme/cell-free extracts for Bb AmDH；lanes 5 and 6：purified Bb AmDH/Bb AmDHK78S/N276C.

Fig.2 Optimization of the enzymatic production of R-PAC（A）pH=7.0；（B）30℃；（C）pH=7.0，30℃；（D）pH=7.0，30℃.Reaction conditions：100 mmol/L PBS buffer，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I.

2.2.2E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化合成R-PAC 為了避免E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI產(chǎn)生底物抑制，研究了底物苯甲醛濃度為40 mmol/L時(shí)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI催化縮合反應(yīng)制備R-PAC的反應(yīng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)初始階段反應(yīng)速率較快，反應(yīng)1 h時(shí)苯甲醛轉(zhuǎn)化效率達(dá)到94.3%，R-PAC產(chǎn)率達(dá)到87.5%；反應(yīng)2 h時(shí)，苯甲醛轉(zhuǎn)化率為99%，R-PAC產(chǎn)率為93%.此外，在反應(yīng)過(guò)程中，R-PAC的對(duì)映體過(guò)量（e.e.，%）值維持在99%（圖3）.

Fig.3 Carboligation of BA with pyruvate by E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ASAH IReaction conditions：100 mmol/L PBS buffer（pH=7），5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO（volume fraction），40 mmol/L benzaldehyde，30℃and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I.

2.3 NE的生物轉(zhuǎn)化

2.3.1BbAmDH催化R-PAC還原胺化反應(yīng)合成NE的條件優(yōu)化 通過(guò)考察反應(yīng)溫度和pH值對(duì)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化R-PAC還原胺化反應(yīng)的影響發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)溫度的升高；R-PAC轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，R-PAC轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值99%；繼續(xù)升高溫度，R-PAC轉(zhuǎn)化率反而下降［圖4（A）］.因此，最適反應(yīng)溫度為40℃.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化還原胺化反應(yīng)最適的反應(yīng)pH值為9.5，當(dāng)反應(yīng)pH值在8.5～10范圍內(nèi)時(shí)，PAC的轉(zhuǎn)化率高于80%，pH值為7時(shí)，轉(zhuǎn)化率僅約為20%［圖4（B）］，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶的分子構(gòu)象［32］，從而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化率下降.

Fig.4 Optimization of the enzymatic production of norephedrine（A）pH=9.5；（B）40℃.Reaction conditions：37 mmol/L R-PAC，0.7 mol/L NH4Cl，60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

2.3.2 分步法合成NE反應(yīng)進(jìn)程E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化反應(yīng)的最適pH值分別為7和9.5，由于兩者反應(yīng)最適pH值相差較大，故采用分步法進(jìn)行反應(yīng).首先，通過(guò)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI在pH=7條件下合成中間體R-PAC，再通過(guò)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C在pH=9.5條件下合成NE.通過(guò)對(duì)分步法合成NE的研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)2 h時(shí)縮合反應(yīng)（Step 1）結(jié)束，40 mmol/L苯甲醛完全轉(zhuǎn)化，生成37 mmol/LR-PAC；在縮合反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中補(bǔ)加NH4Cl和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH=9.5，進(jìn)行催化反應(yīng)；還原胺化反應(yīng)（Step 2）的前2 h反應(yīng)較快，R-PAC轉(zhuǎn)化率達(dá)到62%，隨著底物濃度的下降，反應(yīng)速率逐漸降低，反應(yīng)10 h時(shí)R-PAC轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%（圖5）.由于第一步反應(yīng)受到底物抑制，分步法底物載量被限制在40 mmol/L.

Fig.5 Enzymatic production of norephedrine in the two stepsReaction conditions of step 1：100 mmol/L PBS buffer（pH=7），5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO（volume fraction），40 mmol/L benzaldehyde，30℃and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I；step 2：NH4Cl/NH3H2O buffer（0.7 mol/L，pH=9.5）37 mmol/L R-PAC，40℃and 60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

2.4 一鍋法合成NE

2.4.1 一鍋法反應(yīng)條件的優(yōu)化 由于ASAHI存在底/產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致分步法底物載量受到限制.將縮合反應(yīng)和還原胺化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行（一鍋法）能夠避免中間產(chǎn)物R-PAC的積累，從而解除抑制，提高批次反應(yīng)底物濃度和反應(yīng)效率.首先測(cè)定了BbAmDHK78S/N276C對(duì)苯甲醛和丙酮酸的活力，發(fā)現(xiàn)BbAmDHK78S/N276C對(duì)這2個(gè)底物均無(wú)活力，因此，能有效避免一鍋法中副產(chǎn)物苯甲胺的形成.E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C催化反應(yīng)的最適溫度分別為30～40℃和40℃，所以選取40℃進(jìn)行反應(yīng).E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI和E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C的最適反應(yīng)pH值分別為7和9.5，pH值會(huì)影響兩步反應(yīng)效率.通過(guò)研究pH值對(duì)一鍋法反應(yīng)效率的影響發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的升高，NE的產(chǎn)率升高，當(dāng)pH=8.5時(shí)，產(chǎn)率最高，繼續(xù)升高pH值，產(chǎn)率反而下降，表明一鍋法最適合反應(yīng)pH值為8.5［圖6（A）］.NH4Cl作為BbAmDHK78S/N276C的輔底物，NH4Cl濃度會(huì)影響其反應(yīng)效率，通過(guò)考察NH4Cl濃度對(duì)E.coliBL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C反應(yīng)效率的影響發(fā)現(xiàn)，隨著NH4Cl濃度的增加，NE產(chǎn)率升高，當(dāng)NH4Cl濃度為0.7 mol/L時(shí)，NE產(chǎn)率達(dá)到最高.隨著NH4Cl濃度的進(jìn)一步升高，NE產(chǎn)率下降［圖6（B）］，因此NH4Cl最適反應(yīng)濃度為0.7 mol/L.

Fig.6 Optimization of the enzymatic production of norephedrine in one-pot（A）40℃，0.7 mol/L NH4Cl；（B）40℃，pH=8.5.Reaction conditions：5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L ThDP，0.5 mmol/L DTT，80 mmol/L pyruvate，10%DMSO（volume fraction），40 mmol/L benzaldehyde，60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I and 60mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

2.4.2 一鍋法制備N(xiāo)E 在0.7 mol/L NH4Cl，40℃，pH=8.5的最適反應(yīng)條件下，監(jiān)測(cè)了一鍋法合成NE的反應(yīng)過(guò)程.由圖7可見(jiàn)，反應(yīng)前2 h，苯甲醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到65%，R-PAC緩慢積累，隨著底物苯甲醛被消耗，反應(yīng)速率降低，積累的R-PAC也被緩慢消耗；反應(yīng)12 h時(shí)，苯甲醛轉(zhuǎn)化率為83%.與分步法相比，一鍋法由于pH值始終維持在8.5，導(dǎo)致苯甲醛轉(zhuǎn)化速率下降；但中間產(chǎn)物R-PAC一直低于6 mmol/L.

2.4.3 補(bǔ)料策略在一鍋法中的應(yīng)用 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一鍋法反應(yīng)過(guò)程中R-PAC濃度保持在較低水平（圖7），這為流加底物苯甲醛解除底物抑制提供了可行性.通過(guò)研究一鍋法反應(yīng)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)4 h內(nèi)苯甲醛的反應(yīng)速率較快，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%.因此，選擇每隔4 h補(bǔ)加苯甲醛至約40 mmol/L.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)4 h苯甲醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%，R-PAC濃度維持在5 mmol/L，此時(shí)進(jìn)行第一次補(bǔ)料，隨后苯甲醛被快速轉(zhuǎn)化，R-PAC濃度仍然維持在5 mmol/L，反應(yīng)8 h進(jìn)行第二次補(bǔ)料，反應(yīng)12 h，中止反應(yīng)，最終苯甲醛濃度為10 mmol/L，R-PAC濃度為4 mmol/L（圖8）.一鍋法反應(yīng)通過(guò)補(bǔ)料策略，在反應(yīng)12 h內(nèi)補(bǔ)料，底物濃度從40 mmol/L提高到100 mmol/L，苯甲醛轉(zhuǎn)化率從83%提高到90%，時(shí)空轉(zhuǎn)化率提高2.7倍，反應(yīng)過(guò)程中R-PAC始終維持在約5 mmol/L，解除了底產(chǎn)物抑制，實(shí)現(xiàn)了NE的高效合成.

Fig.7 Enzymatic production of norephedrine in one-potReaction conditions：40 mmol/L benzaldehyde+80 mmol/L pyruvate+0.7 mol/L NH4Cl+5 mmol/L MgCl2+1 mmol/L ThDP+0.5 mmol/L DTT+10%DMSO（volume fraction）+60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I，40℃，pH=8.5 and 60mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.

Fig.8 The one-pot enzymatic production of norephedrine in fed-batchReaction conditions：5 mmol/L MgCl2+1 mmol/L ThDP+0.5 mmol/L DTT+80 mmol/L pyruvate+10% DMSO+40 mmol/L benzaldehyde+0.7 mol/L NH4Cl，40℃，pH=8.5，60 mg/mL E.coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAH I and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDH K78S/N276C.Feeding strategy：feeding of 30 mmol/L benzaldehyde and 30 mmol/L pyruvate every 4 h.

3 結(jié) 論

以L-苯基乙?；状迹≧-PAC）為底物對(duì)本實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得具有R-PAC活力的胺脫氫酶（BbAmDH），通過(guò)引入突變K78S/N276C，使其對(duì)R-PAC的活力提高到4.2 U/mg.通過(guò)級(jí)聯(lián)ASAHI和BbAmDH，構(gòu)建了NE的生物合成新途徑.優(yōu)化分步法反應(yīng)條件，確定了E.coliBL21（DE3）/pET-28a-ASAHI的最適反應(yīng)條件為pH=7，30℃，且底物苯甲醛濃度超過(guò)40 mmol/L時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)底物抑制；同時(shí)產(chǎn)物R-PAC也會(huì)對(duì)ASAHI產(chǎn)生產(chǎn)物抑制.利用分步法在最適反應(yīng)條件下制備N(xiāo)E，40 mmol/L底物苯甲醛和中間產(chǎn)物R-PAC轉(zhuǎn)化率均達(dá)到99%以上.通過(guò)對(duì)一鍋法反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用底物補(bǔ)料策略，有效解除了ASAHI的底/產(chǎn)物抑制作用，底物濃度從40 mmol/L提高到100 mmol/L，苯甲醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%，苯甲醛時(shí)空轉(zhuǎn)化率提高2.7倍，實(shí)現(xiàn)了NE的綠色高效合成，為其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).