衍生于咔唑的雙氰基二苯代乙烯型雙光子熒光脂筏探針

黃池寶，康 帥，潘 淇，呂國嶺

（1.遵義師范學(xué)院信息工程學(xué)院,遵義 563002；2.韶關(guān)大學(xué)英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,韶關(guān) 512005）

脂筏（Lipid raft，10～100 nm的膜片）是質(zhì)膜中富含鞘糖脂和膽固醇［1，2］的剛性隔膜（有序液相，lo），漂浮在甘油磷脂（無序液相，ld）的海洋中［3～7］.脂筏的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與組分適于蛋白質(zhì)間的相互作用與構(gòu)象轉(zhuǎn)化，參與許多細(xì)胞過程，如信號傳導(dǎo)、病原體侵入、膽固醇穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮ＤY和朊病毒病）等.甘油磷脂由與磷酸基團(tuán)相結(jié)合的極性頭部（親水端）和2個非極性尾部（脂肪酸鏈、親脂端）組成，鞘磷脂為鞘氨醇的衍生物，這2類脂極性較強(qiáng)；含有4個碳環(huán)且分子剛性很強(qiáng)的膽固醇帶有1個親水頭部（含1個羥基），極性很弱，黏度很大.因此，脂筏的極性要比甘油磷脂的海洋小得多，且黏度相對較大.使用2個近紅外光子激發(fā)的雙光子顯微鏡（TPM）［8～11］可以實(shí)現(xiàn)對微觀客體的實(shí)時動態(tài)三維（3D）成像［12］，為脂筏的生物研究提供有利工具［13～17］.本課題組［18，19］最近報道了2個溶劑生色（極性）探針（供體-橋-受體和D-π-A），其寬的溶劑生色范圍與高的雙光子發(fā)射截面（Φδ）成為脂筏成像的首選工具.進(jìn)一步對原探針分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造與修飾，引入了一個親脂性長碳鏈（C8H17），旨在提高探針與細(xì)胞質(zhì)膜（雙脂分子層）的相容性.另外，用稠環(huán)咔唑替換苯環(huán)以增大分子平面剛性，不僅可以提高探針分子的雙光子吸收截面，發(fā)出更強(qiáng)的熒光，增加靈敏度，而且可以縮小水溶液極性（或細(xì)胞液極性）對探針熒光的影響［20］，顯著提高探針對脂筏的特異性識別，增強(qiáng)檢測的準(zhǔn)確度.基于上述兩點(diǎn)，本文在雙光子熒光母體4-甲基-2，5-二氰基-4′-氨基二苯乙烯（DCS）［20］的基礎(chǔ)上制備了一個“開-關(guān)”雙光子熒光脂筏探針（E）-2-甲基-5-｛2-［9-正辛基（3-咔唑基）］乙烯基｝對苯二甲腈（DLR，結(jié)構(gòu)見Scheme 1）.DLR的雙光子發(fā)射截面是已報道的同類探針中最大的.探針的發(fā)射截面越大，則其靈敏度、準(zhǔn)確度、成像清晰度與分辨率越高；DLR具有寬廣的溶劑生色范圍，從環(huán)己烷中的422 nm到二甲基亞砜（DMSO）中的581 nm，顯著提高了DLR對介質(zhì)極性響應(yīng)的靈敏度，從而提高對脂筏特異識別的靈敏度與精準(zhǔn)性；DLR的親脂性長碳鏈（C8H17）可以顯著提高其對脂筏的親和力.

Scheme 1 Molecular structure of DLR

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

二油酰磷脂酰膽堿（DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、膽固醇（Cholesterol）和鞘磷脂（Sphingomyelin）購于西安瑞禧生物科技有限公司；甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）購于淄博千匯生物科技有限公司；霍亂毒素B-Alexa 594［CTxB-Alexa 594（C594）］購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司.

Varian Inova 400 MHz型核磁共振儀（1H NMR），美國Varian公司；HP 8453型紫外-可見分光光度儀(UV-Vis)，美國惠普公司；RF-5000型熒光分光光度儀，日本島津公司；Spectra-max190型全波長酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；GC-TOFMS(EI)型氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀（EIMS），美國Waters公司；XT-4型雙目顯微熔點(diǎn)測定儀；HP1100LC/ESI-MSD型電噴霧質(zhì)譜儀，美國Agilent Technologies公司；FT/IR-4700型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），掃描范圍為350～7800 cm-1，KBr壓片法，日本Jasco公司；Perkin2400(Ⅱ)型元素分析儀，美國Perkin公司；Mira 900-F型鎖模飛秒鈦藍(lán)寶石激光器，美國Coherent公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 巨型單層囊泡的制備 參照文獻(xiàn)［21］的電形成法制備巨型單層囊泡（GUVs）及DPPC+DLR，DOPC+DLR和DOPC/鞘磷脂/膽固醇（摩爾比1∶1∶1，Raft mix，也稱模擬脂筏）+DLR 3種巨型囊泡，一般脂質(zhì)濃度為1 mmol/L，脂質(zhì)與探針的摩爾比為200∶1，工作液用氯仿/甲醇（體積比為9∶1）配制.

1.2.2 中間體2，3，4和5的合成 參照文獻(xiàn)［22］方法合成化合物2和3，參照文獻(xiàn)［23］方法合成化合物4和5（Scheme 2）.化合物2：白色針狀晶體，m.p.73.5～75℃，EI-HRMS（C33H31N5S2計算值），m/z：263.9207（263.9571）；化合物3：白色針狀晶體，m.p.210～212℃，EI-HRMS（C10H8N2計算值），m/z：156.0723（156.0687）；化合物4：白色粉末，m.p.126～127℃，EI-HRMS（C10H7BrN2計算值），m/z：233.9747（233.9793）；化合物5：白色晶體，EI-HRMS（C14H17N2O3P計算值），m/z：292.0977（292.0977）.

Scheme 2 Synthetic route of DLR

1.2.3 中間體7的合成 將5 g（30 mmol）咔唑和3 g（53.6 mmol）氫氧化鉀加入盛有30 mL二甲基亞砜（DMSO）的100 mL干燥單口燒瓶中，將4 mL 1-溴辛烷置于恒壓滴液漏斗中并安裝于燒瓶上；將燒瓶置于80～85℃的油浴中，攪拌下滴入1-溴辛烷，反應(yīng)3 h；冷卻后加入100 mL蒸餾水混合，靜置后有淡黃色固體析出，過濾，干燥；用無水乙醇重結(jié)晶，得到5.7 g中間體7白色針狀晶體，收率68%，熔點(diǎn)68～70℃.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：8.07（d，J=7.6 Hz，2H），7.43（t，J1=J2=7.6 Hz，2H），7.35（d，J=8.0 Hz，2H），7.20（t，J1=7.6 Hz，J2=7.2 Hz，2H），4.22（t，J1=J2=7.2 Hz，2H，NCH2），1.81（m，2H），1.28（m，10H），0.85（t，J1=6.4 Hz，J2=7.2 Hz，3H）（圖S1，見本文支持信息）；13C NMR（400 MHz，CDCl3），δ：140.6，125.7，123.0，120.5，118.8，108.8，43.2，32.0，29.5，29.3，29.1，27.5，22.8，14.2（圖S2，見本文支持信息）；MS（C20H25N1計算值），m/z：279.1987（279.1987）［M+］.

1.2.4 中間體8的合成 在冰水浴中，將6 mL干燥的二甲基甲酰胺（DMF）加入100 mL干燥單口燒瓶中，滴入5 mL三氯氧磷；準(zhǔn)確稱取4 g（14.3 mmol）中間體7溶于40 mL氯苯中，轉(zhuǎn)移至恒壓滴液漏斗內(nèi)，并安裝于燒瓶上；0.5 h后，將9-辛基咔唑的氯苯溶液緩緩滴入單口燒瓶中，在70～75℃的油浴中攪拌反應(yīng)6 h；反應(yīng)完全后冷卻，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至中性，用氯仿萃取，再用無水硫酸鈉干燥，減壓脫去溶劑，用無水乙醇重結(jié)晶，得到4.17 g中間體8白色晶體，收率95%.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：10.06（s，1H），8.55（s，1H），8.11（d，J=8 Hz，1H），7.91（d，J=8.4 Hz，1H），7.51（t，J1=J2=8 Hz，1H），7.41（d，J=8.4 Hz，2H），7.28（t，J1=J2=7.6 Hz，1H），4.26（t，J1=J2=7.6 Hz，2H），1.84（m，2H），1.28（m，10H），0.85（t，J1=J2=6.4 Hz，3H）（圖S3，見本文支持信息）；13C NMR（400 MHz，CDCl3），δ：191.9，144.2，141.3，128.7，127.3，126.9，124.1，123.2，123.2，120.9，120.5，109.6，109.1，43.6，32.0，29.5，29.3，29.1，27.4，22.8，14.3（圖S4，見本文支持信息）；MS（C21H25NO計算值），m/z：307.1938（307.1936）［M+］.

1.2.5 目標(biāo)化合物DLR的合成 將446 mg（1 mmol）中間體8和30 mg（1.25 mmol）氫化鈉置于25 mL干燥單口燒瓶中，將292 mg（1 mmol）中間體5溶于10 mL四氫呋喃中，轉(zhuǎn)移至恒壓加料器中，將恒壓加料器裝在單口燒瓶上，并抽真空用氬氣保護(hù)；將燒瓶置于冰水浴中，在強(qiáng)烈攪拌和避光條件下，將中間體5的四氫呋喃溶液逐滴加入混合液中（滴加時間40～50 min）；滴加完畢后，室溫攪拌反應(yīng)24 h；反應(yīng)結(jié)束后，抽真空脫除四氫呋喃（THF），用二氯甲烷萃取提純（15 mL×3），用水洗滌（10 mL×3），用無水硫酸鎂干燥，過濾，抽真空脫除溶劑.粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離［洗脫液：V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=12∶1］，得到303 mg（0.68 mmol）DLR黃色粉末，產(chǎn)率68%.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：8.26（s，1H），8.14（d，J=7.2 Hz，1H），8.03（s，1H），7.72（d，J=8.8 Hz，1H），7.56（s，1H），7.49（t，J1=J2=7.2 Hz，2H），7.44（d，J=11.6 Hz，1H），7.39（d，J=10.4 Hz，1H），7.32（d，J=16.4 Hz，1H，CH=C H），7.26（d，J=16.4 Hz，1H，CH=C H），4.30（t，J1=J2=7.2 Hz，2H，NCH2），2.56（s，3H，CH3），1.88（m，2H），1.356（m，2H，NCH2C H2），1.32［m，10H，（CH2）5］，0.86（t，J1=J2=6.8 Hz，3H，CH2C H3）（圖S5和S6，見本文支持信息）；13C NMR（CDCl3，100 MHz），δ：141.1，140.5，139.8，139.6，136.2，134.5，129.1，126.7，126.4，125.1，123.512，121.4，120.8，120.3，119.6，118.9，117.6，117.1，114.2，109.4，43.5，32.0，29.5，29.3，29.2，27.5，23.7，22.8，20.1，14.2（圖S7，見本文支持信息）；MS（C31H31N3計算值），m/z：445.2518（445.2507）［M+］.

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑極性對發(fā)射光譜的影響

DLR的最大吸收波長幾乎不隨溶劑變化（圖S8和表S1，見本文支持信息），DLR的發(fā)射最大波長（λEM）與溶劑極性呈正相關(guān)，在環(huán)己烷（cHex）和二甲亞砜（DMSO）中分別為422和581 nm［圖2（A）和表S1］，即隨著溶劑極性經(jīng)驗(yàn)參數(shù)π*［24］遞增，具有寬廣的溶劑生色范圍，即從422 nm（環(huán)己烷）到581 nm（DMSO）.DLR在cHex中只有400～480 nm處的定域激發(fā)（LE），在DMF與DMSO中于400～480 nm處的定域發(fā)射強(qiáng)度遠(yuǎn)小于480 nm以上區(qū)域（＞480 nm）的離域激發(fā)（DE）的發(fā)射強(qiáng)度，而在THF中則沒有顯示LE峰.DLR的發(fā)射強(qiáng)度按DPPC，Raft mix和DOPC的順序顯著減弱，強(qiáng)度比例為20∶12.8∶1，且有較小的紅移［圖2（B）］.DPPC與DOPC分別類似于脂筏（lo）和甘油磷脂（ld），表明DLR在lo中的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于ld中的，親脂性長碳鏈C8H17賦予DLR很強(qiáng)的脂相容性，因此，DLR可用于脂筏的識別檢測.

DLR屬于D-π-A型分子（D為電子供體，A為電子受體，π為共軛橋，此處為C=C），在激發(fā)態(tài)時伴隨分子的供體端與分子主體間的扭轉(zhuǎn)，發(fā)生電荷分離，即電子從供體端咔唑氮原子上遷移至氰基端，形成部分的偶極.極性介質(zhì)有利于偶極電荷分散，穩(wěn)定偶極狀態(tài)，亦即偶極激發(fā)態(tài)能量降低，相應(yīng)發(fā)出能量較低的熒光，表現(xiàn)為發(fā)射波長紅移.由于非偶極激發(fā)態(tài)躍遷至偶極激發(fā)態(tài)是一個非輻射躍遷，發(fā)生能量衰減甚至坍陷，因此，熒光強(qiáng)度自然減弱.

Fig.2 Normalized(A)and relative(B)emission spectra of DLR in various solvent(A)Arranged in the order of increasingπ*value were 0,0.58,0.88,1.00 in cHex,THF,DMF,DMSO,respectively,as empirical parameter of solvent polarity.

2.2 雙光子發(fā)射截面與激發(fā)波長的關(guān)系

參照文獻(xiàn)［25，26］方法測定DLR的雙光子發(fā)射截面和激發(fā)波長，結(jié)果示于圖3，圖S9和表S1（見本文支持信息）.可見，Φδ按DPPC，Raft mix和DOPC的順序遞減，分別為1350，975和67 GM，是已報道的同類探針中雙光子發(fā)射截面最大的［13～17］；最大雙光子激發(fā)波長（λTPEM）分別為780，790與800 nm.可見，當(dāng)介質(zhì)極性增大時Φδ減小，DPPC中的Φδ是DOPC中的20多倍，因此DLR足以區(qū)分lo（類似于DPPC）和ld（類似于DOPC）.這歸功于激發(fā)態(tài)分子在極性較大介質(zhì)中（或較小黏度介質(zhì)中）發(fā)生分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)，分子共平面性減弱，導(dǎo)致Φδ減小.

Fig.3 Two-photon action spectra of DLR(c=1μmol/L)in DPPC(a),raft mixture(b)and DOPC(c)n(lipid)∶n(DLR)=100∶1,these data were measured at(25±0.5)℃.

2.3 時間分辨熒光譜

參照文獻(xiàn)［17］方法測定時間分辨熒光譜（TRFs），結(jié)果見圖4和表S2（本文支持信息）.探針DLR在DPPC和細(xì)胞中的熒光壽命（3.6～4.5 ns）均大于在DOPC中的（1.7～1.9 ns）（表S2中的τ3），且超過1倍（≥4.1/1.9≈2.2），這歸因于剛性平面分子DLR在剛性脂筏中難以發(fā)生激發(fā)態(tài)分子扭轉(zhuǎn)而熒光衰減較弱；在DOPC中的LE態(tài)的時間衰減常數(shù)為65 ps（支持信息表S2中的440 nm處對應(yīng)的τ1）；而DE態(tài)的則為21 ps（表S2中的580 nm處對應(yīng)的τ1），前者是后者的3倍以上.以上數(shù)據(jù)表明，DLR在DOPC中的熒光很弱，且強(qiáng)度衰減迅速.因此，無論是熒光強(qiáng)度還是熒光壽命，都隨介質(zhì)極性遞減.細(xì)胞中的TRFs與Raft mix中的很相似，表明DLR的熒光能清晰地將凝膠相（脂筏lo）和流體相（甘油磷脂ld）區(qū)分開，這源于DLR對凝膠相的親和力遠(yuǎn)大于對流體相的，且極性介質(zhì)中的熒光更弱.

2.4 雙光子熒光成像

DLR標(biāo)記的GUVs（DPPC，Raft mix和DOPC）在790 nm激光激發(fā)下可獲得TPM圖像（圖S10，見本文支持信息），顯示出斜向上方向的弱熒光區(qū)域.由圖S10可知，熒光強(qiáng)度按DPPC，Raft mix和DOPC的順序依次減小，特別是DOPC中的熒光強(qiáng)度相當(dāng)微弱，表明熒光強(qiáng)度與脂質(zhì)體極性呈負(fù)相關(guān)，且DLR更易親和DPPC，亦即更易與lo結(jié)合.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和了解DLR識別檢測脂筏的可行性及相應(yīng)的應(yīng)用性能，將其應(yīng)用于細(xì)胞與組織成像研究.小鼠成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)［27］與小鼠腦組織切片的制備［28］均參照文獻(xiàn)方法操作.小鼠成纖維細(xì)胞成像結(jié)果如圖5（A）～（D）所示，可以看出，在未加MβCD時，細(xì)胞脂筏區(qū)域顯示較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，強(qiáng)度越大的細(xì)胞區(qū)域的脂筏含量越高［圖5（A）］；當(dāng)加入MβCD處理細(xì)胞后，細(xì)胞脂筏區(qū)域熒光變得微弱，原來熒光較強(qiáng)的細(xì)胞區(qū)域甚至難以看到熒光［圖5（C）］，這是由于MβCD為脂筏抑制劑，能破壞膽固醇和磷脂，從而破壞細(xì)胞中的脂筏，脂筏含量顯著減小，熒光相應(yīng)大大減弱；當(dāng)再用膽固醇（50μmol/L）處理細(xì)胞后，熒光強(qiáng)度又幾乎恢復(fù)到加入MβCD前的狀態(tài)［圖5（D）］.這些現(xiàn)象證明DLR能夠用于檢測細(xì)胞質(zhì)膜中的脂筏.

Fig.4 Time resolved fluorescence of DLR in DPPC(A),DOPC/sphingomyelin/cholesterol(molar ratio:1∶1∶1)(B),DOPC(C)and cell(mouse fibroblast)(D)

Fig.5 Pseudo colored TPM images of 1.0μmol/L DLR(A,C,D),5.0μmol/L DLR(E,G,H),1.0μmol/L C594(B)and 5.0μmol/L C594(F)-labelled mouse fibroblast/mouse brain tissue slices before(A,E)and after(C,G)treatment with 10 mmol/L MβCD for 30 min at 37℃,respectively(D,H)TPM images of mouse fibroblast after repletion with 50μmol/L cholesterol for 1 h at 37℃and the removal of the remaining cholesterol.The TPEF images were collected at 450—550 nm upon excitation at 790 nm with fs pulses.

為了驗(yàn)證探針DLR對脂筏的特異性親和，用DLR與商業(yè)化公認(rèn)的脂筏探針C594分別標(biāo)記細(xì)胞，進(jìn)行成像對比研究.結(jié)果表明，C594標(biāo)記的細(xì)胞的熒光只是零星地分布且比較暗弱［圖5（B）］，而DLR標(biāo)記的細(xì)胞［圖5（A）］不但熒光強(qiáng)、細(xì)胞膜輪廓清晰可見，而且有些熒光區(qū)域是C594標(biāo)記的細(xì)胞所不具有的，說明某些脂筏區(qū)域C594根本感應(yīng)不到，其對脂筏的特異性比DLR的特異性低.圖5（E）～5（H）給出組織成像結(jié)果，其情況與細(xì)胞成像類似.當(dāng)鼠腦組織切片用DLR孵育后，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光［圖5（E）］，不同組織區(qū)域熒光強(qiáng)度差別較大，反映出脂筏濃度的非均勻分布；當(dāng)加入MβCD處理后，熒光強(qiáng)度急劇減弱［圖5（G）］，表明脂筏絕大部分被破壞；當(dāng)加入膽固醇后熒光幾乎恢復(fù)到未加入MβCD時的狀態(tài)［圖5（H）］，證實(shí)DLR能成像組織中脂筏的分布動態(tài).為進(jìn)一步證明DLR對脂筏的特異性識別，用DLR與C594分別對鼠腦組織切片染色.對比圖5（E）與（F）可知，DLR染色切片的熒光比C594染色的要強(qiáng)得多，C594染色的切片照片缺失部分熒光區(qū)域［圖5（F）］，而這些缺失的區(qū)域在DLR染色的切片中清晰可見［圖5（E）］.此結(jié)果再次證明組織中某些區(qū)域的脂筏不被C594感應(yīng)，其對脂筏的特異性低于DLR，DLR優(yōu)良的特異性也是親脂性長碳鏈C8H17與分子整體構(gòu)造的結(jié)果.DLR探針與脂筏主成分膽固醇均為4個碳環(huán)（1個五元環(huán)和3個六元環(huán)）的 D-π-A型分子，體現(xiàn)出高度平面剛性.

3 結(jié) 論

衍生于咔唑的雙氰基二苯代乙烯型雙光子熒光脂筏探針（E）-2-甲基-5-｛2-［9-辛基（3-咔唑基）］乙烯基｝對苯二甲腈（DLR）顯示出雙光子吸收、對脂筏的特異性親和及生物成像等優(yōu)良性能，其雙光子發(fā)射截面在二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）中高達(dá)1350 GM，且熒光強(qiáng)度隨介質(zhì)極性遞減，而最大發(fā)射波長卻隨溶劑極性遞增.DLR在DPPC中的發(fā)射強(qiáng)度是二油酰磷脂酰膽堿（DOPC）中的20倍，在DPPC中的熒光壽命是DOPC中的2倍多.DLR能夠很好地識別脂筏，成像脂筏在細(xì)胞與組織中的分布動態(tài).DLR探針的優(yōu)良性能首先得益于雙氰基二苯代乙烯的高雙光子吸收的分子架構(gòu)，咔唑的大平面共軛體系對探針的雙光子吸收亦發(fā)揮了不小的貢獻(xiàn)；其次是探針與脂筏主成分膽固醇均屬D-π-A型分子，且都有4個碳環(huán)（1個五元環(huán)與3個六元環(huán)），探針為稠環(huán)，膽固醇為橋環(huán)，都具高度平面剛性.此外，因探針與脂筏主成分膽固醇均有1條含8個碳原子的脂肪長鏈，引入1個柔性正辛基不但有助于提高探針對脂筏的特異性親和能力，而且能提高探針對細(xì)胞膜脂雙分子層的吸附滲透.這些策略為開發(fā)新的脂筏探針提供了借鑒經(jīng)驗(yàn)，亦豐富了雙光子熒光探針的設(shè)計理論.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210140.