雙功能碳點(diǎn)用于葡萄糖的比色/比率熒光測定

袁春玲，姚曉條，徐遠(yuǎn)金，覃 秀，石 睿，成詩琦，王益林

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西電化學(xué)能源材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530004）

葡萄糖是生物活動(dòng)中主要的能量來源和代謝中間體，在生命運(yùn)行過程中起著重要作用，血糖水平異常通常被認(rèn)為與糖尿病、低血糖及代謝紊亂等疾病有關(guān)［1，2］.因此，快速和準(zhǔn)確測定血清中葡萄糖的濃度對(duì)疾病診斷具有重要意義.目前，色譜分析［3，4］、電分析［5，6］和光分析［7，8］等檢測技術(shù)已被應(yīng)用于葡萄糖的測定.因具有響應(yīng)快、成本低和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，比色和熒光等光分析技術(shù)備受關(guān)注［7］.隨著納米科技的不斷發(fā)展，各種納米材料在光分析領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛.一些金屬氧化物［9］、金屬硫化物［10］及貴金屬［11］納米材料因具有類過氧化物酶特性，可催化H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）而用于葡萄糖的比色測定.因吸收譜帶寬和摩爾吸光系數(shù)大，MnO2納米片可有效猝滅稀土納米顆粒（NaYF4∶Yb，Tm＠NaYF4nanoparticles）［12］及銅納米簇（Copper nanoclusters）［13］的熒光；而H2O2的加入可將MnO2還原為Mn2+，使被猝滅的熒光得到恢復(fù).結(jié)合葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成H2O2的原理，上述納米材料已用于構(gòu)建測定葡萄糖濃度的“off-on”型熒光探針.迄今，采用比色或熒光法測定葡萄糖的研究報(bào)道較多，但鮮見同時(shí)用這2種方法測定葡萄糖的報(bào)道［14，15］.研究［14，15］表明，ZnFe2O4磁性微球、Pd納米顆粒能催化H2O2氧化鄰苯二胺（OPD）生成能發(fā)熒光的黃色產(chǎn)物2，3-二氨基吩嗪（DAP）；DAP的存在會(huì)導(dǎo)致硼和氮共摻雜的碳點(diǎn)（B，N-CDs）、C3N4納米片的熒光猝滅.據(jù)此，Li［14］和Qiu課題組［15］分別發(fā)展了一種基于比色和比率熒光的雙信號(hào)葡萄糖測定新方法，均用到了2種納米（或微米）材料.

與其它納米材料相比，CDs具有制備簡單、穩(wěn)定性高、生物相容性好及發(fā)光能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［16］.作為類過氧化物酶或熒光納米材料，CDs在生化分析及細(xì)胞成像等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［17～22］，但同時(shí)具有類過氧化物酶活性和熒光發(fā)射特性的雙功能CDs的報(bào)道較少［23～25］.采用苦楝樹葉（Azadirachta indica leaves）［23］和芥菜種子（Mustard seeds）［24］等生物質(zhì)材料制備的CDs既能發(fā)射熒光，也能催化H2O2氧化TMB，但相關(guān)研究只將其催化功能應(yīng)用于H2O2和抗壞血酸的測定；以有機(jī)胺和硝酸鐵為反應(yīng)物可制備雙功能的鐵、氮共摻雜CDs，該雙功能CDs可用于黃嘌呤的比色/比率熒光測定［25］.元素?fù)诫s不僅能夠提高CDs的熒光量子產(chǎn)率，而且可以改變CDs的內(nèi)部電子環(huán)境，賦予CDs新的功能，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域［26］.基于鐵元素在過氧化物酶中的關(guān)鍵作用和氮摻雜能改善CDs的熒光特性，本文以生物質(zhì)（合果芋葉片）、十二水合硫酸鐵銨和脲為起始物，通過水熱法制備了鐵、氮共摻雜的CDs（Fe，N-CDs），所得Fe，N-CDs既具有類過氧化物酶活性，也能在450 nm處產(chǎn)生強(qiáng)熒光發(fā)射（圖1）.基于Fe，N-CDs的雙功能特性，建立了一種比色/比率熒光測定葡萄糖濃度的方法，并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品分析.

Fig.1 Preparation and properties of Fe,N-CDs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

十二水合硫酸鐵銨［NH4Fe（SO4）2·12H2O］、脲（N2HCONH2）、三水合乙酸鈉、冰醋酸和過氧化氫（廣東光華科技股份有限公司）；葡萄糖、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、色氨酸和絲氨酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；鄰苯二胺（OPD，上海阿拉丁試劑有限公司）；葡萄糖氧化酶（北京索萊寶科技有限公司）.所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；UV-4802型紫外-可見分光光度計(jì)（上海龍尼柯公司）；Tecnai G2 F20 S-Twin型透射電子顯微鏡（美國FEI公司）；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛世爾公司）；FLS1000型熒光光譜儀（英國愛丁堡公司）.

1.2 Fe,N-CDs的制備

將合果芋葉片洗凈，晾干表面的濕存水后剪碎，稱取2.0 g置于75 mL反應(yīng)釜中，加入0.8 g NH4Fe（SO4）2·12H2O，0.2 g N2HCONH2和25 mL去離子水，混合均勻后密封；將反應(yīng)釜置于180℃恒溫干燥箱中加熱6 h.待自然冷卻至室溫后，先用漏斗過濾，得深棕色溶液；再用0.22μm微濾膜去除溶液中的大顆粒聚集物；將反應(yīng)溶液透析24 h以除去未反應(yīng)的試劑，收集袋內(nèi)溶液并定容到25 mL，保存于4℃冰箱中備用.

1.3 H2O2和葡萄糖的測定

H2O2的測定：在系列比色管中，依次加入0.5 mL不同濃度的H2O2溶液、0.5 mL 17.5 mmol/L OPD溶液和100μL Fe，N-CDs溶液，混合均勻后，用pH=5.4的HAc-NaAc（0.2 mol/L）緩沖溶液定容到5.0 mL，置于40℃水浴中反應(yīng)25 min.分別在330～550 nm范圍內(nèi)掃描其吸收光譜，在360 nm波長光的激發(fā)下記錄熒光光譜，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次.

葡萄糖的測定：在系列比色管中，依次加入0.5 mL 10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（pH=7.0）緩沖溶液、0.5 mL不同濃度的葡萄糖溶液和0.1 mL 2.0 mg/mL葡萄糖氧化酶，混合均勻后，在37℃水浴中培育30 min使之產(chǎn)生H2O2；隨后，加入0.5 mL 17.5 mmol/LOPD溶液和100μL Fe，N-CDs溶液，并用0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液（pH=5.4）定容到5.0 mL，混合均勻，后續(xù)過程與H2O2的測定相同，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe,N-CDs的表征

采用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)Fe，N-CDs的形貌和顆粒尺寸進(jìn)行表征.由圖2（A）可見，F(xiàn)e，N-CDs呈近似球狀，分散性好；從高分辨透射電子顯微鏡照片（插圖）中可見清晰的晶格條紋，間距為0.23 nm，與石墨烯（100）面相對(duì)應(yīng)［27］.根據(jù)Nano Measurer軟件分析表明［圖2（B）］，F(xiàn)e，N-CDs的粒徑主要分布在1.34～3.68 nm范圍內(nèi)，平均粒徑約為2.51 nm.

Fig.2 TEMimage(A)and particle size distribution diagram(B)of Fe,N-CDsInset of(A)is the relative HRTEM image.

在365 nm紫外燈照射下，F(xiàn)e，N-CDs發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光［圖3（A）插圖］.當(dāng)激發(fā)波長從310 nm增加到440 nm時(shí)，F(xiàn)e，N-CDs的熒光發(fā)射峰從427 nm紅移到472 nm；熒光強(qiáng)度呈先升后降趨勢；用360 nm波長的光激發(fā)時(shí)，熒光發(fā)射最強(qiáng)［圖3（A）］.這種激發(fā)依賴的發(fā)射行為與顆粒的表面缺陷及顆粒大小有關(guān)［27］.Fe，N-CDs溶液在紫外區(qū)具有較強(qiáng)的光吸收，270 nm處的吸收峰歸因于C=C或C=N的π-π*躍遷［28］（見本文支持信息圖S1）.采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析了Fe，N-CDs所含的基團(tuán)［圖3（B）］，3150 cm-1處的寬峰歸屬為O—H和N—H的伸縮振動(dòng)，1630 cm-1處的峰歸屬為C=O和C=C的伸縮振動(dòng)，1400和1120 cm-1處的峰分別歸屬為C—OH和C—O—C的伸縮振動(dòng).FTIR分析表明，F(xiàn)e，N-CDs表面存在—COOH，—OH和—NH2等親水基團(tuán)，從而使其具有良好的水溶性.

Fig.3 Emission spectra of Fe,N-CDs excited at 310—440 nm(A)and FTIR spectrum of Fe,N-CDs(B)

采用X射線光電子能譜（XPS）對(duì)Fe，N-CDs的元素組成和所含官能團(tuán)進(jìn)行了表征.從全掃描譜圖（圖4）可以看出，CDs主要由碳（44.02%）、氮（13.41%）、氧（39.98%）和鐵（2.59%）4種元素組成，結(jié)合能分別為284.8，401.3，531.5和710.7 eV.C1s的高分辨XPS譜圖含有284.7，286.1和288.3 eV 3個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)C=C，C=O和O—C=O官能團(tuán)［29］.N1s的高分辨XPS譜圖顯示出399.8和401.5 eV 2個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)C—N—C和N—H官能團(tuán)［30］.O1s的高分辨XPS譜圖中有531.3和532.4 eV2個(gè)峰，分別歸屬于C—OH/C—O—C和C=O鍵［31］.Fe2p譜圖含有710.7，714.1，724.7和727.6 eV 4個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于［見本文支持信息圖S2（A）～（D）］.以上結(jié)果表明，F(xiàn)e和N 元素確已摻雜到CDs中；Fe，N-CDs表面具有豐富的含O和含N官能團(tuán).

Fig.4 Survey spectrum of Fe,N-CDs

2.2 Fe,N-CDs的催化活性及葡萄糖雙信號(hào)測定機(jī)理

為研究Fe，N-CDs的類過氧化物酶活性，在pH=5.4的HAc-NaAc緩沖溶液中進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn).含F(xiàn)e，N-CDs和OPD的溶液呈無色，UV-Vis譜圖中無吸收峰［圖5（A）譜線a］；含H2O2和OPD的溶液在420 nm處有1個(gè)弱吸收峰［圖5（A）譜線b］，其溶液呈淡黃色，說明H2O2可以緩慢地將OPD氧化為DAP；當(dāng)Fe，N-CDs存在時(shí)，含H2O2和OPD的溶液在420 nm處有1個(gè)強(qiáng)吸收峰［圖5（A）譜線c］，其溶液呈深黃色.以上數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)e，N-CDs具有類過氧化物酶活性，能催化H2O2氧化OPD的反應(yīng).

DAP溶液呈黃色，其吸收峰位于420 nm處；在360 nm波長光的激發(fā)下，F(xiàn)e，N-CDs的熒光發(fā)射峰位于450 nm處.由圖5（B）可見，DAP的吸收光譜與Fe，N-CDs的熒光光譜有較大重疊；二者共存時(shí)，可通過熒光內(nèi)濾效應(yīng)（IFE）或熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FREF）導(dǎo)致Fe，N-CDs的熒光猝滅.加入Fe，N-CDs前后，DAP吸收峰的位置和吸收強(qiáng)度幾乎無變化［見本文支持信息圖S3（A）］，說明Fe，N-CDs與DAP之間并未形成配合物，即Fe，N-CDs與DAP之間不可能發(fā)生FRET［33］.此外，加入DAP前后，F(xiàn)e，N-CDs的熒光壽命未發(fā)生明顯變化［見本文支持信息圖S3（B）］，說明Fe，N-CDs與DAP之間無電荷轉(zhuǎn)移，故Fe，NCDs的熒光猝滅并非電荷轉(zhuǎn)移所致［14］.因此，二者共存時(shí)，F(xiàn)e，N-CDs的熒光猝滅是因IFE所致.

Fig.5 Absorbance spectra of different solutions in 0.2 mol/L HAc-NaAc buffer solution at pH=5.4(A)and absorbance spectrum of DAP and emission spectrum of Fe,N-CDs(B)Inset of(A)shows the corresponding photograph.

Fe，N-CDs可催化H2O2氧化OPD生成DAP；經(jīng)360nm波長光激發(fā)，DAP在550 nm處有1個(gè)熒光發(fā)射峰，而在同一波長光的激發(fā)下，F(xiàn)e，N-CDs在450 nm處也有熒光發(fā)射峰；DAP通過IFE而猝滅Fe，N-CDs的熒光.即在Fe，N-CDs/OPD體系中加入H2O2，不僅引起溶液顏色的變化，也會(huì)導(dǎo)致DAP和Fe，N-CDs相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化；隨著H2O2濃度的增加，DAP在420 nm處的吸光度和550 nm處的熒光強(qiáng)度均增加，而Fe，N-CDs在450 nm處的熒光強(qiáng)度則降低.通過測定DAP在420 nm處的吸光度及DAP與Fe，NCDs的熒光強(qiáng)度比（I550/I450）可確定H2O2濃度；而H2O2又是葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化的產(chǎn)物之一.據(jù)此，可進(jìn)一步建立比色/比率熒光雙信號(hào)葡萄糖測定方法（圖6）.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得最佳的信號(hào)響應(yīng)，以相對(duì)熒光強(qiáng)度I550/I450（其中I550和I450分別表示550和450 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度）為指標(biāo)，考察了pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間及OPD濃度等因素對(duì)Fe，N-CQDs催化H2O2氧化OPD反應(yīng)的影響.考慮到類過氧化物酶通常在弱酸性條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性，以HAc-NaAc緩沖液為介質(zhì)，在5.0～6.2的pH值范圍內(nèi)考察了介質(zhì)酸度對(duì)I550/I450值的影響.由圖S4（A）（見本文支持信息）可見，隨著pH的升高，I550/I450值呈現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律，且當(dāng)pH=5.4時(shí)，I550/I450值最大.因此，實(shí)驗(yàn)選擇在pH=5.4的HAc-NaAc緩沖液中進(jìn)行.常溫下，F(xiàn)e，N-CDs催化OPD氧化的速度較慢，反應(yīng)體系的顏色變化不明顯.圖S4（B）（見本文支持信息）示出了Fe，N-CDs/H2O2/OPD混合液經(jīng)30～60℃水浴孵育后，測得的I550/I450值與溫度變化的關(guān)系，可見，40℃是比較適宜的溫度.隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，I550/I450值也隨之增大，在25 min時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定［見本文支持信息圖S4（C）］，為保證獲得最大熒光比和穩(wěn)定的信號(hào)響應(yīng)，選擇25 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間.隨著OPD濃度的增大，I550/I450值逐漸增大，當(dāng)濃度為1.75 mmol/L時(shí)I550/I450值趨于平穩(wěn)［見本文支持信息圖S4（D）］.最終選定的實(shí)驗(yàn)條件為pH=5.4，溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間25 min，1.75 mmol/L OPD.

Fig.6 Schematic diagram of detection principle

2.4 H2O2和葡萄糖的比色/比率熒光雙信號(hào)檢測

在優(yōu)化的條件下，考察了H2O2濃度對(duì)體系吸收與熒光光譜的影響.紫外-可見吸收光譜測定結(jié)果表明，當(dāng)H2O2濃度從1.0μmol/L增加到300μmol/L時(shí)，DAP在420 nm處特征吸收峰的波長不變，吸收強(qiáng)度逐漸增大［見本文支持信息圖S5（A）］；且420 nm處的吸光度值（A420）與H2O2濃度呈良好的線性關(guān)系［見本文支持信息圖S5（B）］，線性方程為A420=0.0039cH2O2+0.0087，相關(guān)系數(shù)為0.996.熒光測定結(jié)果表明，隨著H2O2濃度的升高，DAP在550 nm處的熒光逐漸增強(qiáng)，而Fe，N-CQDs在450 nm處的熒光則逐漸減弱［見本文支持信息圖S5（C）］.H2O2濃度在1.0～80μmol/L范圍內(nèi)，I550/I450值與H2O2濃度之間呈良好的線性關(guān)系［見本文支持信息圖S5（D）］，線性方程為I550/I450=0.0039cH2O2+0.2606，相關(guān)系數(shù)為0.998.比色和比率熒光法的檢出限（3σ/k）分別為0.7和0.6μmol/L，表明方法具有較高的靈敏度.

葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶催化氧化后會(huì)產(chǎn)生H2O2，據(jù)此，可進(jìn)一步建立雙信號(hào)測定葡萄糖的方法.圖7（A）顯示了依賴于葡萄糖濃度的DAP的吸收光譜.隨著葡萄糖濃度的增加，420 nm處的吸光度逐漸增大；在1.0～100μmol/L濃度范圍內(nèi)，DAP的吸光度與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系［圖7（B）］，回歸方程為A420=0.0038cglucose+0.0142（R2=0.991）.從圖7（C）可以看出，隨著葡萄糖濃度的增加，DAP在550 nm處的熒光強(qiáng)度增大，而Fe，N-CDs在450 nm處的熒光強(qiáng)度降低；在1.0～100μmol/L濃度內(nèi)，I550/I450值與葡萄糖濃度成正比［圖7（D）］，回歸方程為I550/I450=0.0039cglucose+0.2237（R2=0.998）.比色和比率熒光法的檢出限分別為0.8和0.6μmol/L，表明方法具有較高的靈敏度.方法的線性范圍和檢出限優(yōu)于或可比于已報(bào)道的方法（表1）；且最終檢測液顏色隨葡萄糖濃度的升高而加深［圖7（B）插圖］，裸眼可辨別的最低濃度為5.0μmol/L，本方法可實(shí)現(xiàn)低濃度葡萄糖的可視化檢測.

Fig.7 Absorption(A)and emission(C)spectra of Fe,N-CDs-OPD with different concentrations of glucose,linear relationship between A420 and glucose concentration(B)and linear relationship between I550/I450 and glucose concentration(D)Inset of(B)is the photograph of the solutions corresponding to(A).

Table 1 Comparison of different methods for detecting glucose

2.5 方法的選擇性

為評(píng)價(jià)方法的選擇性，選取血清中常見的金屬離子如Na+，K+，Mg2+，Zn2+及系列氨基酸［苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、異亮氨酸（Ile）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、色氨酸（Trp）、纈氨酸（Val）和絲氨酸（Ser）］作為干擾物代替葡萄糖，經(jīng)培育、顯色后分別測定吸收與熒光信號(hào).圖8（A）和（B）分別示出了葡萄糖（Glu）濃度為0.1 mmol/L，各干擾物濃度均為1.0 mmol/L時(shí)的比色和比率熒光響應(yīng)情況.盡管各干擾物的濃度是葡萄糖濃度的10倍，但只有葡萄糖能引起2種分析信號(hào)的顯著變化，這與葡萄糖氧化酶的高選擇性有關(guān).因此，該方法的選擇性良好.

Fig.8 Selectivities of colorimetric(A)and ratio fluorescence for glucose detection(B)The concentration of glucose was 0.1 mmol/L,of other substances was 1.0 mmol/L.a.Glu;b.blank;c.Na+;d.K+;e.Zn2+;f.Mg2+;g.Phe;h.Glycine;i.Ile;j.Thr;k.Asp;l.Try;m.Val;n.Ser.

2.6 實(shí)際樣品分析

為驗(yàn)證方法的可行性，對(duì)人體血清中葡萄糖的含量進(jìn)行了測定.取0.8 mL血清樣品加入0.8 mL三氯乙酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，去除血清蛋白.向反應(yīng)體系中加入0.1 mL處理過的血清和不同濃度的葡萄糖，按1.3節(jié)步驟測定，結(jié)果見表2.樣品檢測液中葡萄糖濃度的比色法測定值分別為40.2和35.9μmol/L，根據(jù)稀釋比，計(jì)算得出原樣中葡萄糖的濃度分別為4.02和3.59 mmol/L，與臨床測定結(jié)果（4.53和3.86 mmol/L）基本吻合，均在正常值范圍內(nèi).此外，比色法與比率熒光法測定結(jié)果一致；回收率為93.3%～111.5%；RSD在0.4%～6.8%之間，說明方法的準(zhǔn)確度和精密度高，可應(yīng)用于實(shí)際樣品分析.

Table 2 Detection of glucose in human serum*

3 結(jié) 論

以生物質(zhì)（合果芋葉片）、含鐵和含氮物質(zhì)為起始物，制備了具有類過氧化物酶活性和熒光特性的雙功能Fe，N-CDs.在Fe，N-CDs和OPD混合溶液中加入H2O2后，F(xiàn)e，N-CDs能催化H2O2氧化OPD生成能發(fā)射熒光的DAP，DAP和Fe，N-CDs形成雙發(fā)射體系，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度及DAP的吸光度受H2O2濃度的調(diào)節(jié).結(jié)合葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化產(chǎn)生H2O2的原理，發(fā)展了一種比色/比率熒光雙信號(hào)測定葡萄糖的分析方法.該方法具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)，應(yīng)用于人體血清中葡萄糖的測定，其結(jié)果與臨床測定值相吻合.與已報(bào)道的雙信號(hào)葡萄糖測定方法相比，本方法只需制備一種納米材料.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210019.