抑癌基因PBRM1在腎細胞癌中的作用研究進展

唐余，辛慧，潘有福,2*

1遵義醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學教研室，貴州遵義 563003；2貴州省基因檢測與治療重點實驗室，貴州遵義 563003

腎癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生率占全部腫瘤的3%～5%，全世界每年報告腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)病例超過30萬，且呈逐年增長的趨勢[1]。男性的腎癌發(fā)病率約是女性的2倍，且其生存率較低[2]。腎癌有多種組織病理學類型，根據2004年世界衛(wèi)生組織的分類，腎癌可分為10種類型，腎細胞癌在其中最為常見。腎細胞癌主要包括透明腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)、乳頭狀腎細胞癌(papillary renal cell carcinoma，PRCC)、嫌色腎細胞癌(chromophobe renal cell carcinoma，ChRCC)、腎集合管癌(collecting duct carcinoma，CDC)、腎髓質癌(renal medullary carcinoma，RMC)、腎黏液樣小管狀和梭形細胞癌(mucinous tubular and spindle cell carcinoma，MTSCC)等[3]。2016年世界衛(wèi)生組織的腎細胞癌分類中又增加了一些新的類型。在腎細胞癌中，CCRCC占65%～70%，PRCC占15%～20%，ChRCC占5%～7%，其余占3%～15%[4]。由此可見，CCRCC不僅是主要的腎細胞癌亞型，也是腎癌最常見的類型。

腎癌的發(fā)生發(fā)展機制十分復雜，遺傳、肥胖、吸煙、高血壓等均為其危險因素。大多數患者早期無癥狀，最常見的中晚期癥狀為腰痛、血尿、腹部腫塊等[5]。由于腎癌早期不易診斷，因此，明確其發(fā)生機制和遺傳背景，以及鑒定有效的分子標志物，對改進診斷和治療方案具有積極意義。本文對腎細胞癌的主要癌相關基因尤其是抑癌基因PBRM1的研究現狀、分子機制及臨床轉化研究進展進行綜述，以期為SWI/SNF與腎細胞癌及其他相關腫瘤的基礎和臨床轉化研究提供參考。

1 CCRCC中主要的癌相關基因

腎細胞癌的發(fā)生和發(fā)展是一個十分復雜且較為長期的過程，涉及許多遺傳學事件的發(fā)生，典型的如基因突變和拷貝數改變。不同類型的腎細胞癌基因突變譜并不相同。查詢癌癥基因組圖譜數據庫發(fā)現，CCRCC中突變率居于前10位的基因包括VHL(41.3%)、PBRM1(38.1%)、SETD2(12.2%)、BAP1(9.5%)、MTOR(7.7%)、KDM5C(5.0%)、PCLO(3.7%)、KMT2C(3.7%)、ARID1A(3.5%)、SPEN(3.5%)。見圖1。

圖1 CCRCC樣本中的前10位突變基因Fig.1 The top 10 mutant genes in CCRCC sample

這些突變基因大致可分為泛素化修飾系統(tǒng)基因、表觀遺傳調控基因及其他基因。泛素化修飾系統(tǒng)基因主要是von Hippel-Lindau(VHL)。VHL基因定位于人類染色體3p25.2，是CCRCC中突變率最高的基因[6]，其CpG島甲基化可見于20%的腎細胞癌臨床樣本中[7]。VHL的突變或失活可導致多種腫瘤的易感性升高，如嗜鉻細胞瘤、胰島細胞腫瘤、內淋巴囊腫瘤和子宮腺瘤等，尤其是近70%的患者會罹患腎細胞癌或腎囊腫[8-9]。缺乏VHL基因使低氧誘導因子(HIF)α不能被泛素化并降解[10]，進而在細胞核中積累。HIF調控的基因(如VEGF)表達增加，導致血管生成；同時，一些與代謝和炎癥相關的信號轉導通路也常常失調，進而加速腫瘤的進展[11]。

CCRCC中大多數突變基因屬于表觀遺傳調控基因，包括PBRM1、SETD2、BAP1、KDM5C、KMT2C、ARID1A、SPEN。PBRM1是CCRCC中第二大突變基因，定位于3號染色體短臂(3p)上，突變率為38.1%。SETD2基因也位于染色體3p上，在10%～15%的CCRCC中發(fā)生突變[12]。BAP1定位于3p21.1，編碼一種去泛素化酶[13]，最初被鑒定為與乳腺癌基因1(breast cancer gene 1，BRCA1)的RNG結構域相互作用的蛋白質[14]，通過去泛素化作用參與表觀遺傳調控、DNA損傷修復等過程，從而發(fā)揮抑癌作用[15-17]。BAP1失活可導致多梳抑制復合體(polycomb repressive complex，PRC)的調控功能失調，以及部分miRNAs表達的改變，從而使CCRCC進展到晚期[18-19]。

KDM5C基因編碼一種從組蛋白H3(H3K4me3)上去除甲基的脫甲基酶，而H3K4me3是活躍轉錄基因的標志[20]。組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2C(KMT2C)是組蛋白甲基化修飾蛋白KMT2家族的一員，在調控發(fā)育途徑中發(fā)揮重要作用，KMT2C突變不僅存在于CCRCC中，還存在于管囊性腎細胞癌中[21-22]。ARID1A是SWI/SNF染色質重塑復合體的一個亞單位，其突變可影響SWI/SNF復合物的活性，進而使部分信號通路蛋白轉錄表達發(fā)生異常[23]，如增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的敏感性及抑制蛋白激酶B的活性[24]。ARID1A表達降低與CCRCC預后不良相關[25]，提示其可作為CCRCC預后的一個評估指標。SPEN編碼的SMRT/HDAC1蛋白是一種大型核蛋白，在轉錄調控及X染色體失活中發(fā)揮重要作用，也可影響乳腺癌初級纖毛形成及癌細胞遷移[26]，但SPEN在CCRCC中的作用及機制尚未見報道。

CCRCC中其他突變率較高的基因有mTOR、PCLO。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K相關激酶，也是細胞生長及增殖的重要調節(jié)因子[27]。PI3K/mTOR直接通過控制糖酵解相關基因的轉錄及糖酵解酶的翻譯后修飾[28]來調控腫瘤的Warburg效應。CCRCC的特征之一是糖酵解的增加及PI3K信號通路的激活[29]，提示mTOR在CCRCC進程中可能發(fā)揮著重要功能。PCLO是一種新發(fā)現的420 ku鋅指蛋白，其突變與突觸前細胞瘤、神經膠質母細胞瘤相關，還與小細胞肺癌耐藥及肝癌等的發(fā)生相關[30-34]。PCLO在CCRCC中的作用也未見相關報道。

除上述突變率較高的基因外，在CCRCC中還存在部分突變率較低的基因如KDM6A。KDM6A(UTX)定位于人類染色體Xp11.2，編碼一種轉移H3K27甲基化的蛋白酶，在1%的CCRCC中發(fā)生突變[20]，并參與了表觀遺傳調控過程。KDM6A缺陷細胞的增殖依賴于甲基化H3K27的PRC2成員EZH2，提示抑制EZH2可能是治療KDM6A突變腫瘤的有效方法[35]。此外，microRNA是一種長約22nt的短鏈非編碼RNA，在許多癌癥中均發(fā)現了microRNA表達的失調，腎癌中也不例外。miR-205-5p、miR-143及miR-184均顯示出了抗CCRCC的作用[36-38]，對這些microRNA進行研究可為CCRCC的治療提供潛在的靶點。

2 PBRM1的研究進展

PBRM1是不久前才發(fā)現的CCRCC中的高頻突變基因，其突變率可達41%左右[39](圖1)。近年來研究發(fā)現，SWI/SNF各個成員在多種腫瘤中的突變率可超過20%[40]，表明SWI/SNF在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。SWI/SNF染色質重塑復合體可分為3種：經典的cBAF，多溴蛋白結合的PBAF(polybromo-associated BRG1-associated factor)，以及近年來鑒定的含有GLTSCR1或GLTSCR1L和BRD9的GBAF[41]。PBRM1編碼BAF180蛋白，為PBAF的特異性組成部分，也是該SWI/SNF染色質重塑復合體靶向染色質的重要亞基[42]。PBAF復合體介導的染色質重塑與DNA的復制、轉錄、修復，以及細胞增殖、分化的控制有關[42]。PBAF 的活動依賴于各結構域功能的發(fā)揮，PBRM1在CCRCC中的高突變率使其成為了近年的研究熱點。

2.1PBRM1的結構及各結構域的功能 PBRM1定位于染色體3p21，其編碼產物BAF180蛋白全長1689個氨基酸。BAF180由6個參與組蛋白尾上乙?；嚢彼釟埢Y合的溴結構域(BrD)、2個參與蛋白質-蛋白質相互作用的溴鄰同源結構域(BAH)和1個與DNA結合的高遷移率族結構域(HMG)組成[43](圖2)：(1)BAF180蛋白的BrD可特異性識別組蛋白乙酰化(Histone Ac)；(2)BAH有募集效應蛋白的作用；(3)HMG可結合到DNA的凹槽中。

圖2 BAF180蛋白的結構域及其主要功能Fig.2 The domains and main function of BAF180 protein

BrD是在染色質重塑復合體的亞基及許多組蛋白乙酰轉移酶(HATS)中發(fā)現的與乙?；嚢彼?acetylated lysine)結合的結構域。BAF180的不同BrD與組蛋白的不同乙?；稽c有不同的親和性，表明它們可能有助于組蛋白“密碼”的“解讀”[44]。最近的研究發(fā)現，在細胞內染色質重塑和轉錄激活等過程中，溴結構域-乙酰化識別是調節(jié)蛋白質與蛋白質相互作用的關鍵機制[43]。

BAH最早是在脊椎動物多溴蛋白中發(fā)現的130個氨基酸區(qū)，能夠募集其他可結合的蛋白質[44]。在BAF180蛋白中，串聯的BAH結構域可能有助于錨定PBAF復合體中的亞基。在酵母細胞中，含有BAH結構域的起始點識別復合體1(the origin recognition complex 1，Orc1)可與沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulation 2 homolog 1，Sirt1)相互作用[45]。

HMG是由約80個氨基酸組成的區(qū)域，存在于各種真核生物染色體蛋白及核小體結合蛋白中，其主要作用是結合到DNA的小凹槽中。HMG結合DNA后可使后者的結構發(fā)生改變，從而調節(jié)染色質功能及基因表達[43]。

2.2PBRM1的突變類型 PBRM1是CCRCC中第二常見的突變基因(圖1)。有趣的是PBRM1突變主要發(fā)生于CCRCC，在其他RCC亞型中突變很少或未觀察到，如PRCC(4%)和ChRCC(0%)[46]。在CCRCC中PBRM1的突變大多數是截短突變(137個)，其次是錯義突變(23個)，移碼突變較少(2個)[47]。PBRM1突變位點沿整個基因分布，影響B(tài)rD、BAH及HMG[47](圖3)。此類突變可使PBRM1蛋白的結構域發(fā)生變化，從而引起細胞的生理學改變，以至引發(fā)癌癥。

圖3 BAF180蛋白的常見突變位點Fig.3 Common mutation sites of BAF180 protein

2.3PBRM1的抑癌機制及主要相關信號通路PBRM1突變被認為是癌變的早期事件，已有不少研究對其抑癌機制進行了探討。Ibragimova等[48]通過分析TCGA的CCRCC Infinium數據庫中與染色質修飾相關基因啟動子的甲基化狀態(tài)，發(fā)現在所有腫瘤及正常標本中KDM5C、ARID1A、PBRM1、KDM6A、SETD2及BAP1的啟動子均未甲基化。此外，由于VHL、PBRM1、SETD2及BAP1均位于染色體3p上，染色體3p的缺失可能會賦予腫瘤細胞更強的生長優(yōu)勢[48]。在乳腺癌中，PBRM1可增強p21的表達，進而抑制細胞增殖[49]。此外，PBRM1還可能是細胞衰老所必需的基因，可通過調節(jié)p53介導特異性基因轉錄[50]。由于PBRM1既可影響p21的表達，也可影響p53的轉錄活性，而已知p21是p53的下游靶基因，因此，在CCRCC中PBRM1是直接調控p21的轉錄水平，還是通過p53影響p21的轉錄水平，或兩者皆有目前尚不清楚。最近Cai等[51]提供了PBRM1通過p53調控p21的證據，他們發(fā)現，在CCRCC患者中僅約3%存在TP53突變，但是BAF180的BrD4可通過特異性識別p53的K382賴氨酸殘基乙?；癄顟B(tài)，增加p53與CDKN1A(編碼p21)啟動子的結合能力，最終使p21的表達水平上升。

PBRM1對DNA雙鏈斷裂(DSBs)誘導的轉錄沉默也具有重要作用，并可促進受損部位的修復，而PBRM1突變體則不能發(fā)揮此功能[52]。PBRM1還可能通過促進著絲粒凝聚和基因組穩(wěn)定性來阻止腫瘤的發(fā)生[53]，敲除PBRM1基因后，參與染色體不穩(wěn)定及細胞增殖的基因表達上調，尤其是RNAi介導的PBRM1降低可促進CCRCC的細胞增殖、細胞克隆形成及遷移，這與其腫瘤抑制因子的作用一致[54]，提示在腎細胞癌中，PBRM1也可能通過以上機制發(fā)揮抑癌作用。

PBRM1表達升高可導致部分腎細胞癌細胞黏附、碳水化合物代謝、凋亡過程和缺氧反應相關基因表達上調，以及部分參與細胞分裂不同階段的基因表達下調[55-56]，提示PBRM1可能作為一個上游主導基因來調控腫瘤細胞的黏附性，從而影響腫瘤細胞在體內的轉移。

PBRM1的突變或缺失還可能導致細胞中幾種關鍵的信號通路失調。Gu等[57]通過建立PBRM1及BAP1突變的腎癌小鼠模型，發(fā)現PBRM1缺失可激活mTORC1信號通路，促進腎癌的發(fā)生。Miao等[58]通過對PBAF缺陷型CCRCC細胞株基因表達的分析，發(fā)現PBRM1缺乏可導致JAK/STAT通路相關蛋白的基因轉錄發(fā)生改變。沉默PBRM1基因可使RIG-Ⅰ樣受體(RLR)信號通路相關蛋白的表達上升[59]，后者是一個典型的與炎癥相關的免疫信號通路，提示PBRM1缺失還可能與免疫信號通路相關。

在VHL缺失的CCRCC中，PBRM1失活可降低干擾素刺激基因因子3(ISGF3)的表達，影響干擾素的生成。VHL丟失后可造成STAT3信號通路激活，PBRM1的進一步丟失或失活又增強了HIF1的表達和STAT3通路的激活，活化的STAT3可能抑制CCRCC細胞中ISGF3的表達[60-61]。這些結果提示ISGF3和STAT3有可能是PBRM1缺失的CCRCC的潛在治療靶點。

綜上所述，PBRM1作為許多腫瘤的抑癌基因，其突變/失活可以擾動腫瘤細胞內多種信號通路相關基因的表達，進而影響腫瘤細胞的生長特性和腫瘤的發(fā)展進程。以上PBRM1抑癌機制的探索無疑將有助于鑒定一些有效的治療靶點，并可為控制腫瘤的浸潤和轉移提供對策。

2.4PBRM1在腎細胞癌中的臨床轉化研究 Nam等[62]通過對657例CCRCC患者的癌組織樣本進行PBRM1免疫組化分析發(fā)現，PBRM1表達降低的患者腫瘤特異性生存率(CSS)及無進展生存期(PFS)明顯降低(P＜0.001)；在多因素分析中，PBRM1表達是PFS較短的獨立預測因子(P=0.007)。研究還發(fā)現，在癌癥早期(Ⅰ期和Ⅱ期)組PBRM1的表達明顯下降，CSS及PFS明顯降低(P＜0.001)，而在晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)組中則無明顯變化，因此認為PBRM1可以作為早期腎細胞癌患者的一個預后及診斷指標。但Kim等[63]對腎細胞癌Ⅳ期患者的PBRM1表達譜進行分析后得出了與此不一致的結論。他們比較了53例腎細胞癌患者的生存期及mTOR抑制劑的治療效果，發(fā)現腎細胞癌Ⅳ期患者PBRM1高表達組總生存期(OS)明顯低于低表達組[(23.0±8.3)個月vs.(45.0±4.8)個月，P=0.022]，即PBRM1的表達升高與OS降低相關，且晚期腎細胞癌患者對mTOR抑制劑的應答效果較差(P=0.101)。導致這種不一致的原因可能與腫瘤分期及樣本量不同有關，也可能與患者對藥物的敏感性變化有關，因此，其中的機制仍需進一步研究。

在治療方面，腎細胞癌的傳統(tǒng)治療方式為手術切除和基于細胞因子的治療，但存在復發(fā)率高、毒性高及應答率低等風險[64]。對于VHL失活的腎細胞癌而言，臨床上使用的舒尼替尼、HIF拮抗劑等藥物已取得良好的治療效果[65-66]。對于PBRM1突變的腎細胞癌而言，雖然Fay等[67]發(fā)現，PBRM1突變在抗VEGF治療的患者中有所富集，但Beuselinck等[68]發(fā)現，PBRM1突變與蘇尼替尼治療反應無明顯關系。此外，Miao等[58]通過分析35例轉移性CCRCC的全外顯子測序結果，以及臨床抗PD-1或阻斷PD-L1的免疫治療結果，發(fā)現PBRM1雙等位基因失活(loss of function，LOF)與臨床免疫治療效果的相關性較好，隨后在63例CCRCC患者中得到了驗證。Braun等[69]在對803例臨床腎細胞癌患者進行分析，探討PBRM1突變是否可以作為免疫檢查點抑制劑的標志物時也得出了類似的結論。最近有研究發(fā)現，一種新的EZH2抑制劑L501-1669可抑制PBRM1失活的癌細胞增殖，促進其凋亡[70]。

以上研究結果表明，PBRM1基因的突變情況、表達水平及下游關鍵分子的鑒定均對腎細胞癌患者的分型分期、治療和預后有著重要作用，且PBRM1失活所引起的腎細胞癌可通過特異性藥物進行干預。

3 總結與展望

腎癌作為常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，對人類的健康威脅極大。目前關于腎細胞癌中的VHL突變機制和臨床轉化的研究已經取得了豐碩成果，但對腎細胞癌的第二大突變基因PBRM1的研究仍較少。雖然目前的實驗數據已表明PBRM1在臨床上對腎細胞癌的分期、治療、預后等均有影響，且已有研究揭示了PBRM1的部分抑癌機制，還提出了以PBRM1為靶點的治療方案，但是PBRM1在腎細胞癌中的作用機制尚未闡明，許多問題仍需進一步探討，如基因組水平PBRM1調控的靶基因有哪些，PBAF與哪些轉錄因子協同調控此類基因，其失活影響了哪些miRNA，對代謝的影響，以及腫瘤微環(huán)境發(fā)生的變化等。因此，PBRM1的功能和分子機制仍需進一步深入研究，這對腎細胞癌以及PBRM1缺陷的相關腫瘤的預防、個性化治療和預后有著積極的理論意義和臨床轉化價值。