補骨脂素調(diào)控SKP2/PTHrP/SIRT1軸緩解炎癥環(huán)境下髓核細胞退變的作用

岳宗進，劉汝銀，于露，王新立，馮仲鍇，王西彬

河南省中醫(yī)院脊柱科，鄭州 450000

約40%的椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)患者會出現(xiàn)下腰痛，其中10%的患者長期處于殘疾狀態(tài)，給正常生活帶來極大不便[1]。IDD發(fā)生時，椎間盤內(nèi)的細胞可分泌大量炎性因子[主要包括白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等]，促進椎間盤細胞自噬、衰老和凋亡，進一步加速IDD[2]。補骨脂素是中藥補骨脂的主要有效成分，有研究發(fā)現(xiàn)其對碘乙酸單鈉誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎療效顯著[3]，但對于IDD的療效尚未明確。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)是一種E3泛素連接酶，有研究發(fā)現(xiàn)其可抑制IDD時髓核細胞的凋亡[4]。采用補骨脂素干預(yù)晚期皮膚T細胞淋巴瘤細胞系可促進泛素特異性肽酶(USP)的表達[5]，且USP可激活SKP2而促進乳腺癌的進展[6]，由此推測，補骨脂素可能對SKP2具有調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein，PTHrP)在IDD的進展過程中表達增加[7]。在腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中，補骨脂素可降低PTHrP蛋白的表達[8]。本研究旨在探討補骨脂素對炎癥環(huán)境下髓核細胞退變的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 補骨脂素購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號：BP1041)；IL-1β、TNF-α和PTHrP重組蛋白購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)、MMP-13和IL-6 ELISA試劑盒購自德國Qiagen公司；兔抗人Ⅱ型膠原蛋白(collagen type 2，Col Ⅱ)和SKP2單克隆抗體一抗購自美國Invitrogen公司；兔抗人PTHrP、沉默信號調(diào)節(jié)子1(silent information regulator 1，SIRT1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體一抗以及兔抗Flag和Myc標簽單克隆抗體一抗購自英國Abcam公司；鼠抗人蛋白聚糖單克隆抗體一抗和辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠和山羊抗兔二抗購自美國Sigma公司；SKP2短發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體、SKP2慢病毒過表達載體(LV-SKP2)、PTHrP慢病毒過表達載體(LVPTHrP)以及對應(yīng)陰性對照雜亂干擾和空載體購自美國Merek公司；pRK5質(zhì)粒、Flag、HA和Myc標簽抗體購自美國Millipore公司；胎牛血清(FBS)購自美國IBM公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和HEK293T細胞購自美國Gibco公司；SIRT1激活劑SRT1720購自美國MedChemExpress公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液、ECL發(fā)光液和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒購自北京BioTeke公司。pRK5-Myc-SKP2、pRK5-Flag-PTHrP和pRK5-HA-Ubiquitin質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司構(gòu)建。凝膠成像分析儀購自廣州瑞豐實驗設(shè)備有限公司；LSM780激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2細胞培養(yǎng)及處理 人髓核細胞株(human nucleus pulposus cells，HNPCs)購自寧波明舟生物科技有限公司。HNPCs細胞在含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，1:3傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)試驗。設(shè)置對照組、IL-1β+TNF-α組、補骨脂素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)組、補骨脂素(25 μmol/L)+SKP2干擾或過表達組、補骨脂素+PTHrP重組蛋白(100 nmol/L)組與補骨脂素+PTHrP重組蛋白+沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)激活劑SRT1720(1 μmol/L)組。對照組：加入等體積Hanks'溶液；IL-1β+TNF-α組：使用10 ng/ml IL-1β和50 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h建立椎間盤退變細胞模型；補骨脂素組：在IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)后，分別加入10、25、50 μmol/L補骨脂素孵育72 h；補骨脂素+SKP2干擾或過表達組：分別與20 nmol/L SKP2 shRNA或5 μg/ml LV-SKP2轉(zhuǎn)染48 h后，加入補骨脂素、IL-1β和TNF-α共同孵育48 h，對應(yīng)的陰性對照加入等體積雜亂干擾或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h；補骨脂素+PTHrP重組蛋白組：在IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)后，加入25 μmol/L補骨脂素和100 nmol/L PTHrP重組蛋白共同孵育48 h；補骨脂素+PTHrP重組蛋白+SRT1720組：同補骨脂素+PTHrP重組蛋白組處理后，加入1 μmol/L SRT1720(溶于DMSO)孵育48 h。

1.3流式細胞術(shù)檢測髓核細胞凋亡情況 將HNPCs以2×105個/ml的密度接種于培養(yǎng)基中，孵育72 h，收集細胞。用預(yù)冷PBS洗滌3次，將細胞重懸在含有PI的緩沖液中，室溫培養(yǎng)15 min，使用BD LSRFortessa細胞分析儀檢測細胞凋亡情況。

1.4Western blotting檢測髓核細胞中SKP2、PTHrP、SIRT1、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白的表達水平 使用RIPA裂解液裂解細胞并提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。上樣30 μg，行10% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜；加入一抗SKP2(1:200)、PTHrP(1:500)、SIRT1(1:1000)、Col Ⅱ(1:2000)、鼠單克隆蛋白聚糖抗體(1:1000)和GAPDH(1:10000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠(1:1000)或山羊抗兔(1:25 000)二抗，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL顯色液顯色。以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.5ELISA法測定髓核細胞中MMP-3、MMP-13和IL-6的含量 將HNPCs接種于6孔板中(3×106個/孔)，待細胞處理完成后24 h，收集培養(yǎng)基，使用ELISA試劑盒測定MMP-3、MMP-13和IL-6的含量。

1.6DCFDA探針法檢測髓核細胞內(nèi)ROS水平 使用ROS檢測試劑盒，按照說明書步驟測定髓核細胞內(nèi)ROS水平。用無菌PBS洗滌細胞2次，將細胞在黑暗中于37 ℃下用10 μmol/L DCFDA染色20 min，然后每4 min混合1次。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以減少過量DCFDA的干擾。使用LSM780激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)檢測DCFDA熒光強度。

1.7蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)實驗分析SKP2與PTHrP蛋白的相互作用 使用在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser(http://ubibrowser.ncpsb.org/ubibrowser/home/index)預(yù)測SKP2與PTHrP蛋白的相互作用。HEK293T細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，待細胞長至80%融合時，分別加入1 mg/ml質(zhì)粒[帶有Myc標簽的SKP2(Myc-SKP2)質(zhì)粒和帶有Flag標簽的PTHrP(Flag-PTHrP)質(zhì)粒]在饑餓條件下進行轉(zhuǎn)染，24 h后吸取培養(yǎng)液，加入1 ml PBS并刮取細胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中；吸取100 μl作為input。將剩余的細胞懸液在室溫下6000 r/min離心2 min，去上清，加入1 ml細胞裂解緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、0.5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L DTT]充分混勻，4 ℃下3000 r/min離心1 min，去上清，加入預(yù)冷PBS重懸，重復(fù)3次，加入等體積PBS充分混勻，取適量預(yù)混液加入抗體[兔抗Flag標簽抗體一抗(1:30)、兔抗Myc標簽抗體一抗(5 μg/ml)和山羊抗兔二抗(1:50)]，采用Western blotting檢測。

1.8泛素化實驗檢測PTHrP泛素化水平HEK293T細胞轉(zhuǎn)染后，在變性緩沖液[6 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4(pH 8.0)、10 mmol/L咪唑]中收集細胞。裂解液與Ni-NTA瓊脂糖珠孵育3 h，然后用變性緩沖液洗滌4次，用低鹽緩沖液[25 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)、20 mmol/L咪唑]洗滌2次。加入50 μl含200 mmol/L咪唑的2×SDS蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴15 min。離心取上清，采用Western blotting檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey HSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1補骨脂素對炎癥環(huán)境下髓核細胞退變的影響

與對照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與IL-1β+TNF-α組比較，補骨脂素處理后髓核細胞凋亡率以劑量依賴的方式降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖1A、B)。與對照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細胞中IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平明顯升高，SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；與IL-1β+TNF-α組比較，補骨脂素處理后髓核細胞中IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平以劑量依賴的方式降低，SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平以劑量依賴的方式升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖1C–J)。

圖1 補骨脂素對炎癥環(huán)境下HNPCs退變的影響Fig.1 Effects of psoralen on HNPCs degeneration in an inflammatory environment

2.2補骨脂素調(diào)控SKP2蛋白表達對炎癥環(huán)境下髓核細胞退變的影響 與IL-1β+TNF-α組比較，補骨脂素+雜亂干擾組髓核細胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與補骨脂素+雜亂干擾組比較，補骨脂素+SKP2干擾組髓核細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IL-1β+TNF-α組比較，補骨脂素+雜亂干擾組髓核細胞中SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平明顯升高，IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與補骨脂素+雜亂干擾組比較，補骨脂素+SKP2干擾組髓核細胞中SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平明顯降低，IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

圖2 SKP2干擾對炎癥環(huán)境下HNPCs退變和細胞外基質(zhì)的影響Fig.2 Effects of SKP2 interference on HNPCs degeneration and extracellular matrix in an inflammatory environment

2.3SKP2與PTHrP蛋白的相互作用分析 在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser預(yù)測結(jié)果顯示，SKP2與PTHrP蛋白之間存在直接相互作用。Western blotting檢測結(jié)果顯示，Myc抗體和Flag抗體均檢測到SKP2和PTHrP蛋白的表達，進一步證實了SKP2與PTHrP蛋白的相互作用(圖3)。

圖3 SKP2與PTHrP蛋白的相互作用分析Fig.3 Analysis of the interaction between SKP2 and PTHrP proteins

2.4補骨脂素對SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化水平的影響 泛素化實驗結(jié)果顯示，IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)可降低SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化水平，而添加補骨脂素可升高SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化水平(圖4A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細胞中SKP2蛋白表達水平明顯降低，PTHrP蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與IL-1β+TNF-α組比較，補骨脂素+空載體組髓核細胞中SKP2蛋白表達水平明顯升高，PTHrP蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與補骨脂素+空載體組比較，補骨脂素+SKP2過表達組髓核細胞中SKP2蛋白表達水平明顯升高，PTHrP蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖4B–D)。

圖4 補骨脂素調(diào)控SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化Fig.4 Psoralen in regulation of SKP2-mediated PTHrP ubiquitination

2.5補骨脂素調(diào)控PTHrP對SIRT1活化和炎癥環(huán)境下髓核細胞退變的影響 與對照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細胞中SIRT1蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IL-1β+TNF-α組比較，補骨脂素組髓核細胞中PTHrP蛋白表達水平明顯降低，SIRT1蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與補骨脂素組比較，補骨脂素+PTHrP重組蛋白組髓核細胞凋亡率、ROS、IL-6、MMP-3、MMP-13和PTHrP蛋白表達水平明顯升高，SIRT1、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與補骨脂素+PTHrP重組蛋白組比較，補骨脂素+PTHrP重組蛋白+SRT1720組髓核細胞中PTHrP蛋白表達水平無明顯變化(P＞0.05)，SIRT1、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平明顯升高，細胞凋亡率、ROS、IL-6、MMP-3、MMP-13水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖5)。

3 討 論

下腰痛是臨床常見疾病，而IDD是導(dǎo)致此類疾病的主要原因[1,9]。椎間盤主要由髓內(nèi)核構(gòu)成，并被纖維環(huán)包圍。髓核細胞是髓內(nèi)核中的主要細胞類型，負責(zé)合成細胞外基質(zhì)(ECM)成分，包括Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白[10-11]，這些蛋白是維持椎間盤正常功能的重要因素。IDD發(fā)生時，髓核細胞可分泌大量炎性因子，如IL-1β和TNF-α等[2]。強烈的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致髓核細胞合成代謝與分解代謝失衡，如分解代謝因子MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生增加，合成代謝因子Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白的表達受到抑制，導(dǎo)致髓核細胞過度退變[12]，最終引發(fā)或加速IDD進展。

補骨脂素是中藥補骨脂的活性成分，既往研究表明其具有很強的抗炎作用，可有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞ECM降解和滑膜細胞炎癥反應(yīng)，減輕大鼠骨關(guān)節(jié)炎癥狀[3]。目前補骨脂素對炎癥環(huán)境下髓核細胞功能的影響尚不清楚。本研究采用補骨脂素干預(yù)IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的髓核細胞，結(jié)果顯示，細胞炎性因子IL-6、ROS水平及細胞凋亡率明顯降低，Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達水平明顯增高，表明髓核細胞ECM降解得到明顯改善。有研究使用補骨脂素與UVA光化學(xué)療法干預(yù)皮膚T細胞淋巴瘤細胞系，發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶2(USP2)的表達水平明顯升高[5]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在退化的椎間盤樣本中，SKP2的表達水平明顯降低，且SKP2過表達可抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞退變，促進髓核細胞增殖[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂素孵育能有效促進IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的髓核細胞中SKP2蛋白的表達，而SKP2下調(diào)后髓核細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及ECM降解明顯增強。有研究對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型小鼠灌服含有補骨脂的湯藥，發(fā)現(xiàn)小鼠骨轉(zhuǎn)移灶中細胞因子IL-8和PTHrP蛋白表達水平明顯降低[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IDD進展時PTHrP mRNA和蛋白表達水平均明顯升高[7]。本研究使用在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SKP2與PTHrP蛋白之間具有直接相互作用，且通過Western blotting發(fā)現(xiàn)二者可以結(jié)合，提示補骨脂素可促進SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化。

SIRT1通路能夠調(diào)節(jié)各種細胞生物學(xué)過程，包括凋亡、轉(zhuǎn)錄、血管生成和代謝等，參與防止細胞衰老和延長生物體壽命的一系列生命活動[13]。SIRT1通路在IDD進展中的保護作用已被證實[14]。據(jù)報道，SIRT1可抑制c-Fos和c-Jun的磷酸化，從而抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞退變[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，PTHrP基因敲入小鼠骨骼組織中SIRT1蛋白的表達水平降低[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在退變的髓核細胞中添加PTHrP重組蛋白可抑制SIRT1蛋白的表達，促進細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和ECM降解，而SIRT1通路激活可逆轉(zhuǎn)PTHrP重組蛋白的作用(圖6)。

圖6 補骨脂素緩解髓核細胞退變的機制Fig.6 The mechanism of psoralen alleviating the degeneration of HNPCs

綜上所述，本研究結(jié)果表明，補骨脂素可通過促進SKP2介導(dǎo)的PTHrP蛋白泛素化降解，激活SIRT1通路，緩解炎癥環(huán)境下髓核細胞的退變。