寧都黃公雞不同冠型組織學(xué)及BMP2 表達(dá)定位研究

貢繼尚，周 敏*

（1.南昌師范學(xué)院，江西南昌 330032；2.江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330032；3.中國(guó)科學(xué)院家禽分子育種技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330032）

雞冠是家禽繁殖中重要的表型性狀之一，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期高度自然選擇，產(chǎn)生多種冠型[1]。雞冠表型與生產(chǎn)性能具有較密切的關(guān)聯(lián)性，且雞冠發(fā)育也是衡量性成熟程度的指標(biāo)[2]。因此，雞冠表型是家禽遺傳選育及繁殖育種的重要指標(biāo)之一。BMP2基因是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族的成員之一，具有調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、遷移以及胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)的作用[3]。目前該基因在雞冠發(fā)育過(guò)程中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。Johnsson 等[4]發(fā)現(xiàn)BMP2和羥基酸氧化酶1（Hydroxyacid Oxidase 1，HAO1）的基因間區(qū)域有一個(gè)緊密連鎖的多效性QTL，并共同影響著雞冠發(fā)育與骨骼沉積。王琨等[5]通過(guò)高通量測(cè)序及對(duì)候選基因的表達(dá)分析認(rèn)為雞冠的發(fā)育與BMP2具有一定的關(guān)聯(lián)，通過(guò)分析不同周齡的雞冠中BMP2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)雞冠發(fā)育具有調(diào)控作用[6]，但是對(duì)于性成熟的公雞不同冠型中BMP2的表達(dá)研究還未見(jiàn)報(bào)道。在野生型雞群體中，是否具有優(yōu)質(zhì)冠型是雌性作為選擇交配的先決條件，同時(shí)也是雄性在群體中等級(jí)的標(biāo)志。許多研究表明，雄性對(duì)于雌性的吸引力與子代的質(zhì)量具有正相關(guān)性[7]，可能是雌性更易被較大冠型的雄性吸引，以此獲得更優(yōu)秀的遺傳性狀并傳遞給子代。關(guān)于雞冠質(zhì)量性狀與雞產(chǎn)蛋量和骨質(zhì)質(zhì)量等調(diào)控位點(diǎn)的分布都具有明顯的重疊，所以研究雞冠發(fā)育調(diào)控機(jī)制，可以間接研究家禽優(yōu)質(zhì)的遺傳性狀在遺傳育種中的應(yīng)用。

寧都黃雞無(wú)論公母都具有典型的早熟性[8]，并且具有多種冠型。Mukhtar 等[9]提出16 周齡公雞會(huì)出現(xiàn)性早熟現(xiàn)象，尤其是較大雞冠的公雞最明顯。本研究選取16 周齡寧都黃公雞為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)6 種不同冠型的雞冠進(jìn)行表達(dá)定位分析，進(jìn)一步揭示BMP2 蛋白在雞冠不同表型中的作用，旨在為家禽的遺傳改良提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基地（江西南師科技有限公司），為同一飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)的寧都黃公雞，共17 只。

1.2 主要試劑與儀器 4% 組織細(xì)胞固定液，DAB 顯色試劑盒，蘇木素伊紅（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）染色試劑盒，免疫組織化學(xué)染色試劑盒（P1110，DA1010，G1120，G1120，北京索萊寶）；Anti-多克隆BMP2 抗體（GB11252，武漢塞維爾）；SLEE 半自動(dòng)石蠟切片機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將采集的雞冠組織置入4%組織細(xì)胞固定液中。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋和制作石蠟切片。免疫組織化學(xué)染色方法見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

采用Image J 計(jì)算機(jī)輔助圖像分析軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別選取不同冠型免疫組化切片各3 張，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)0.148 cm2區(qū)域，并在視野內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)比例一致的橫截面，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 24 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，相對(duì)表達(dá)水平和陽(yáng)性細(xì)胞比率用X±SE（n=3）表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冠型的雞冠發(fā)育性狀 由表1 可知，倒冠和肥厚冠冠高顯著高于其他冠型，肥厚冠冠長(zhǎng)與其他冠型相比較長(zhǎng)（P＜0.05），且細(xì)齒冠冠長(zhǎng)與其他冠型相比較短（P＜0.05）。冠厚測(cè)量結(jié)果顯示，細(xì)齒冠與其他冠型相比較短（P＜0.05），其他冠型之間冠厚差異不顯著。細(xì)齒冠和齒數(shù)顯著多于正常、倒冠、肥厚、三叉冠，與雙叉冠差異不顯著。

2.2 不同冠型組織形態(tài)學(xué)變化 通過(guò)對(duì)不同冠型的比較組織學(xué)觀察（圖1），細(xì)齒冠相對(duì)于其他幾種冠型，外周層中小靜脈較少，多為管徑較小的毛細(xì)血管，血管中為單一紅細(xì)胞。在正常雞冠的外周真皮層中觀察到許多構(gòu)成血管內(nèi)皮細(xì)胞的大和小的毛細(xì)血管。而肥厚冠、三叉冠和雙叉冠的外周層中小靜脈呈擴(kuò)大狀態(tài)，周?chē)恼嫫哟蟛糠直粩U(kuò)張的血管占據(jù)，并與鄰近的血管擴(kuò)張吻合形成竇狀血管網(wǎng)，血管中還觀察到許多紅細(xì)胞。細(xì)齒冠的外周層和中間層都比其他冠型致密，HE 染色呈深染狀，梭型纖維細(xì)胞最為豐富，而其他冠型外周層由于膠原纖維網(wǎng)較多和成纖維細(xì)胞減少呈松散狀，染色呈淡染。從圖1 中觀察正常冠和倒冠中間層經(jīng)染色呈透明的膠原纖維組織及粘多糖，HE 染色較淺。

圖1 寧都黃公雞不同冠型組織形態(tài)比較

2.3 BMP2 在不同冠型中的表達(dá)分布 如圖2 所示，BMP2 在不同冠型中均有表達(dá)，細(xì)齒冠陽(yáng)性率極顯著高于其他冠型，且陽(yáng)性率較高（圖3）。幾種冠型中BMP2 均在生發(fā)層高表達(dá)，除細(xì)齒冠BMP2 陽(yáng)性表達(dá)呈由深層向淺層逐漸降低趨勢(shì)，其他幾種冠型生發(fā)層BMP2 表達(dá)均勻，陽(yáng)性表達(dá)具體體現(xiàn)在真皮層的血管內(nèi)皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞中。肥厚冠與雙叉冠的血管管腔中有明顯BMP2 陽(yáng)性，但與正常冠的陽(yáng)性率無(wú)顯著差異。正常冠、倒冠與三叉冠中BMP2 的表達(dá)分布差異不大，但是正常冠的陽(yáng)性率顯著低于三叉冠與倒冠。

圖2 BMP2 在不同冠型組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖3 不同冠型組織BMP2 陽(yáng)性比率

3 討 論

雞冠作為雞重要的表型性狀之一，與繁殖和生長(zhǎng)等性狀具有重要聯(lián)系[11]，可作為品種選育的重要指標(biāo)之一。寧都黃雞是江西省地方雞種，具有早熟性狀，在16 周齡就可以性成熟[8]。目前對(duì)于早熟型性狀的家禽雞冠組織學(xué)及對(duì)相關(guān)表型的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)不同冠型性狀進(jìn)行比較組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除細(xì)齒冠外，其他幾種冠型真皮層中小靜脈形成血管網(wǎng)，有的形成靜脈竇，管腔內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)較多，這與Yoshioka[12]觀察的結(jié)果一致；細(xì)齒冠外周層比其他幾種冠型的薄，且有豐富的纖維細(xì)胞，而其他幾種冠型外周層膠原纖維網(wǎng)比較疏松，尤其以正常冠與倒冠明顯。與性晚熟品種青腳麻雞26 周齡性成熟公雞雞冠組織相比[6]，雞冠中都具有豐富的血管數(shù)量網(wǎng)，在真皮層中膠原纖維網(wǎng)疏松，不同的是性早熟寧都黃雞真皮層成纖維細(xì)胞并未像青腳麻雞一樣減少，而是保持與青腳麻雞相近的數(shù)量。性早熟品種雞冠組織學(xué)特性兼具了性晚熟品種性成熟前成纖維細(xì)胞多和性成熟后膠原纖維疏松的特點(diǎn)。

BMP2 被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的成骨因子[13]，并可影響雞冠的發(fā)育。王琨[5]和Liu[14]等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定出BMP2參與雞冠發(fā)育并對(duì)其進(jìn)行了群體驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)BMP2基因在高冠和矮冠組織中差異表達(dá)，在較大群體的定量分析中發(fā)現(xiàn)矮冠中表達(dá)量要顯著高于高冠組，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)齒冠顯著低于其他冠型，并且BMP2的表達(dá)顯著高于其他高冠冠型，雞冠表面具有明顯的角質(zhì)層，BMP2 在矮冠中高表達(dá)具有明顯的促進(jìn)角化的作用，而角化過(guò)程中也存在鈣化。BMP2 是成骨因素中重要的因子，對(duì)成骨細(xì)胞鈣化具有重要意義，從側(cè)面說(shuō)明細(xì)齒冠BMP2 的高表達(dá)使組織逐漸趨近于角質(zhì)化。相對(duì)于矮冠，高冠組織中BMP2 呈低表達(dá)，在雞冠外周層及中心層的纖維細(xì)胞中具有少量的表達(dá)，并形成多樣的高冠冠型，說(shuō)明BMP2 高表達(dá)對(duì)于雞冠的生長(zhǎng)起到抑制作用，可形成低矮的細(xì)齒冠。推測(cè)是由于BMP2 過(guò)于集中的表達(dá)對(duì)于雞冠的角質(zhì)化過(guò)程具有促進(jìn)作用，而高表達(dá)對(duì)于雞冠分化發(fā)育方面起到了負(fù)調(diào)控作用。有實(shí)驗(yàn)表明BMP2 可以對(duì)牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及管腔形成發(fā)揮作用[15]，成熟個(gè)體的新血管形成是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的各種蛋白酶破壞血管基底膜或其周?chē)h(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)而開(kāi)始的，隨后，血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行遷移和增殖。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMP2 在雞冠血管內(nèi)皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，可能是BMP2 通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對(duì)維持外周真皮層的血管穩(wěn)態(tài)具有一定影響，這也可能是造成雞冠膨大的因素之一。作為內(nèi)皮細(xì)胞中的主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，BMP 途徑十分復(fù)雜，結(jié)合的配體數(shù)量較多，功能具有多樣性，會(huì)激活不同程度的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)并形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]。雞冠屬于皮膚衍生物，并且血管比較豐富，可以直接表現(xiàn)環(huán)境變化帶來(lái)的應(yīng)激，并不斷產(chǎn)生一定的表型，這種復(fù)雜的途徑對(duì)于內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)以及對(duì)正常應(yīng)激源和異常應(yīng)激源的響應(yīng)都是必不可少的。在應(yīng)激過(guò)程中，BMP2 作為疏水性酸性分泌性糖蛋白[17]，通常會(huì)增加和誘導(dǎo)內(nèi)皮的運(yùn)動(dòng)性和侵襲，并通過(guò)促進(jìn)增殖來(lái)引起血管生成[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)血管腔中BMP2也有微量表達(dá)，這可能是由于內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的BMP2通過(guò)分泌作用進(jìn)入到血管腔中，作用于血管腔結(jié)構(gòu)，管腔經(jīng)歷反復(fù)的發(fā)芽和吻合然后形成新血管網(wǎng)絡(luò)，可能對(duì)竇狀血管網(wǎng)的形成具有促進(jìn)作用，間接對(duì)雞冠的形成起到了塑形的影響。

4 結(jié) 論

細(xì)齒冠不同于其他冠型，真皮層中主要是以致密的纖維細(xì)胞為主，而其他冠型真皮層中生發(fā)層具有較多的竇狀血管網(wǎng)，且外周層多膠原纖維，呈松散狀。BMP2的高表達(dá)對(duì)雞冠的分化發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用，且對(duì)雞冠的血管分化具有一定影響，從而影響雞冠組織中血管網(wǎng)的形成以及雞冠多叉、高低及肥厚的表型等。本研究結(jié)果將為早熟性狀家禽的遺傳選育提供理論依據(jù)。