兩種測(cè)定人血漿中維生素E 方法的比較分析

謝寶英

維生素E 具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的作用,是人體必須的微量物質(zhì)之一。體、內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,維生素E 是非常重要的阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的抗氧化劑,不但能夠預(yù)防和減輕體內(nèi)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物的破壞,保持組織的完整性,而且在生命活動(dòng)中起著極其重要的作用,具有防癌、抗衰老等功能。維生素E 由8 種異構(gòu)體構(gòu)成,其中α-生育酚的生理活性和抗氧化能力最強(qiáng)。近幾年已應(yīng)用維生素E 作為一些疾病輔助治療及抗衰老的藥物,市場(chǎng)上維生素E 制品基本以α-生育酚醋酸酯形式出現(xiàn)。目前維生素E 的測(cè)定方法主要包括氣相色譜法［1,2］、高效液相色譜法［3-5］、紫外光譜法等［6］。紫外光譜法專(zhuān)屬性不強(qiáng),故使用導(dǎo)數(shù)光譜法,但操作非常復(fù)雜。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多采用專(zhuān)屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速的色譜法測(cè)定,中國(guó)藥典中維生素E 及其制劑的測(cè)定方法為氣相色譜法。色譜法還可應(yīng)用到血漿中維生素E 的測(cè)定中。本試驗(yàn)擬比較毛細(xì)管氣相色譜法和高效液相色譜法測(cè)定人血漿中維生素E 濃度的準(zhǔn)確性、靈敏度等,確定適用于維生素E 血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法并探討其原因?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

GC-2010 氣相色譜儀包括氫火焰離子化檢測(cè)器,Labsolutions GC solution 色譜工作站(日本島津)。LC-10A 高效液相色譜儀包括SPD-10A 紫外檢測(cè)器,Chromato-solution Light 色譜工作站(日本島津)?？瞻籽獫{由廈門(mén)市中心血站提供。維生素E 對(duì)照品(98.9%)為蒂斯曼(上海)有限公司產(chǎn)品,正三十二烷(99.9%)為日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水,甲醇為色譜級(jí)試劑,正己烷、無(wú)水乙醇等為分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

2.1.1 氣相色譜法 色譜柱為Rtx-1 毛細(xì)管柱(30.00 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為氮?dú)?流速為10 ml/min,氣化室溫度為300℃,柱溫為290℃,FID 溫度為300℃。精密量取100 μl 血漿,置塑料離心管中,分別加入150 μl 水和350 μl 無(wú)水乙醇,渦旋1 min,精密加入500 μl 內(nèi)標(biāo)溶液(取正三十二烷適量,精密稱(chēng)定,加正己烷溶解,稀釋成10 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液),渦旋1 min 后,于4000 r/min 離心5 min,吸取上清液,氮?dú)獯蹈?精密加入100 μl 正己烷,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取2 μl 上清液注入氣相色譜儀進(jìn)行分析。

2.1.2 高效液相色譜法 色譜柱為島津VP-ODS C18柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇,流速為1.5 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,柱溫為室溫。精密量取100 μl 血漿,置塑料離心管中,分別加入150 μl 水和350 μl 無(wú)水乙醇,渦旋1 min,加500 μl 正己烷,渦旋1 min 后,于4000 r/min 離心5 min,吸取全部上清液,氮?dú)獯蹈?精密加入100 μl 甲醇,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取10 μl 上清液注入液相色譜儀進(jìn)行分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取維生素E 對(duì)照品12.5 mg,精密稱(chēng)定,置50 ml 容量瓶中,加無(wú)水乙醇溶解,稀釋至刻度,搖勻,即得0.25 mg/ml 的維生素E 貯備液,置冰箱中保存。臨用時(shí)精密吸取貯備液,用無(wú)水乙醇稀釋至刻度,配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取兩份空白血漿100 μl 按兩種前處理方法操作,另取兩份空白血漿80 μl,精密加入維生素E 標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl,渦旋混勻,分別按兩種前處理方法操作,在各自的色譜條件下血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物的測(cè)定,專(zhuān)屬性較好。氣相色譜條件下,維生素E 的保留時(shí)間(tR)為17.4 min,內(nèi)標(biāo)tR為17.9 min,兩者分離度為1.4。高效液相色譜條件下,維生素E 的tR為11.55 min。見(jiàn)圖1。

圖1 氣相色譜法和高效液相色譜法的色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 取塑料離心管數(shù)支,加入空白血漿80 μl,分別精密加入維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl,渦旋混勻,配制系列含藥血漿。其血漿藥物濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml。分別按兩種前處理方法操作,在各自的色譜條件下進(jìn)樣,記錄色譜圖。

氣相色譜法以維生素E 的濃度C 為橫坐標(biāo),維生素E 的峰面積As 與內(nèi)標(biāo)物的峰面積Ar 的比值f為縱坐標(biāo),求回歸方程,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為f=0.039C+0.005,r=0.9985,在0.5～10.0 μg/ml 范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。根據(jù)信號(hào)噪音比值,得血漿中最低定量限為0.501 μg/ml,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為11.3%(n=5)。高效液相色譜法以維生素E 的濃度C 為橫坐標(biāo),峰面積A 為縱坐標(biāo),求回歸方程。由于靈敏度較低,血漿藥物濃度兩個(gè)低濃度點(diǎn)沒(méi)有信號(hào),故未計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.5 提取回收率試驗(yàn) 取空白血漿80 μl,精密加入不同濃度的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其成為血漿藥物濃度為0.8、2.5、10.0 μg/ml 的低、中、高三種濃度的血漿樣品,每個(gè)濃度平行配制6 份,分為兩組,分別按兩種前處理方法操作,在各自的色譜條件下進(jìn)樣,記錄色譜圖。

用氣相色譜法時(shí)計(jì)算維生素E 峰面積As 與內(nèi)標(biāo)的峰面積Ar 的比值f。另取塑料離心管數(shù)支,分別精密加入相應(yīng)濃度的維生素E 溶液,內(nèi)標(biāo)溶液500 μl,氮?dú)獯蹈?再精密加入100 μl 正己烷,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取上清液2 μl 進(jìn)樣,計(jì)算維生素E 峰面積As’與內(nèi)標(biāo)的峰面積Ar’的比值f’。以f 與f’之比計(jì)算提取回收率。高效液相色譜法的維生素E 峰面積為A,另取塑料離心管數(shù)支,分別精密加入相應(yīng)濃度的維生素E 溶液,氮?dú)獯蹈?精密加入100 μl 甲醇,渦旋混勻1 min,于10000 r/min 離心3 min,取上清液10 μl 進(jìn)樣,維生素E 峰面積為A’。以A 與A’之比計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1,氣相色譜法提取回收率較好,高效液相色譜法的提取回收率低,影響方法的準(zhǔn)確度。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.6 氣相色譜法精密度試驗(yàn) 取空白血漿80 μl,精密加入不同濃度的維生素E 標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其成為血漿藥物濃度為0.8、2.5、10.0 μg/ml 的低、中、高三種濃度的血漿樣品,每個(gè)濃度平行配制3 份,共9 份作為一批,在同日內(nèi)按氣相色譜法的前處理方法和色譜條件測(cè)定,計(jì)算日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d,重復(fù)同樣的操作,測(cè)定三批血漿樣品,計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2,RSD均＜15%,分析精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.7 氣相色譜法穩(wěn)定性試驗(yàn) 將血漿樣品在-20℃冷凍前、冷凍24 h 后于室溫自然解凍、室溫放置8 h、冷凍30 d 以及在-20℃和室溫下反復(fù)凍融3 次后按氣相色譜法的前處理方法和色譜條件測(cè)定,計(jì)算血漿藥物濃度。結(jié)果維生素E 含量基本不變,表明血漿中維生素E 在-20℃冷凍儲(chǔ)存、解凍8 h 以及反復(fù)凍融的情況下是穩(wěn)定的。

3 討論

本試驗(yàn)比較了兩種測(cè)定血漿中維生素E 的方法,從結(jié)果上看氣相色譜法優(yōu)于高效液相色譜法。分析其原因,認(rèn)為是血漿樣品的前處理方法以及定量方法造成的。血漿樣品的分析一般采取一次萃取的方式,故提取率不高。本試驗(yàn)中高效液相色譜法的定量方法是外標(biāo)法。外標(biāo)法簡(jiǎn)便,但進(jìn)樣量須十分準(zhǔn)確,并且前處理方法必須能夠完全將藥物從基質(zhì)中提取出來(lái),否則將會(huì)造成分析方法誤差,得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。高效液相色譜法本身的進(jìn)樣是準(zhǔn)確的,但在該血漿樣品的前處理時(shí)損失了藥物,最終該方法的準(zhǔn)確度低。RSD值偏大,說(shuō)明提取效果不穩(wěn)定。本試驗(yàn)的另一方法氣相色譜法使用內(nèi)標(biāo)法定量,即在分析測(cè)定時(shí),從樣品的前處理開(kāi)始加入一內(nèi)標(biāo)物,通過(guò)測(cè)量被測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值來(lái)進(jìn)行計(jì)算,以消除操作條件(包括萃取、進(jìn)樣等操作)的波動(dòng)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響,提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。由于氣相色譜法本身進(jìn)樣的不準(zhǔn)確性,一般采用內(nèi)標(biāo)法定量。在本試驗(yàn)中,內(nèi)標(biāo)的使用同時(shí)還消除了萃取過(guò)程的誤差,所以氣相色譜法回收率、精密度等指標(biāo)均符合要求。由于氣相色譜法更適合該樣品的測(cè)定,本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了氣相色譜法的測(cè)定條件,具體如下。①維生素E 是弱極性化合物,選用中等極性色譜柱時(shí)藥物和內(nèi)標(biāo)不能完全分離。隨后選用非極性色譜柱,維生素E 與固定相有較強(qiáng)的親和力,雖然延長(zhǎng)了分析時(shí)間,但內(nèi)源性物質(zhì)、藥物和內(nèi)標(biāo)都能達(dá)到基線(xiàn)分離,效果較好。②柱溫的選擇參照中國(guó)藥典2015 版二部,在265℃下,20 min 內(nèi)沒(méi)有出峰。試驗(yàn)考察了270、280、290、300℃時(shí)的色譜分離情況,最終確定柱溫為290℃。③血漿樣品處理時(shí)加入水和乙醇的作用是沉淀血漿中的蛋白,再加正己烷萃取血漿中的維生素E。血漿樣品萃取后,曾經(jīng)選擇無(wú)水乙醇將殘?jiān)芙?但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重現(xiàn)性較差,因正三十二烷為非極性物質(zhì),在無(wú)水乙醇中不能完全溶解,在用無(wú)水乙醇復(fù)溶時(shí),離心管內(nèi)壁上附有少量白色物質(zhì)。最后改用正己烷復(fù)溶,能完全溶解殘?jiān)?/p>

本試驗(yàn)中的毛細(xì)管氣相色譜法采用正己烷對(duì)血漿樣品進(jìn)行萃取,與固相萃取法比較費(fèi)用低,操作簡(jiǎn)便易行,具有選擇性強(qiáng),靈敏度高,簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),可用于維生素E 藥動(dòng)學(xué)研究和血藥濃度檢測(cè)。