DNA甲基化在非酒精性脂肪性肝病中的研究進展

李春野， 李 惠

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是在未過量飲酒和其他導(dǎo)致肝臟脂肪變性的情況下，以肝細胞脂質(zhì)過度堆積為主要特征的臨床病理綜合征[1]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)也稱單純性脂肪性肝病，以及由其演變的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后者可進展為病變程度更嚴(yán)重的脂肪性肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳機制影響NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。DNA甲基化是導(dǎo)致NAFLD基因表達異常的主要表觀遺傳學(xué)改變之一[3]，被認(rèn)為是肝臟表型從正常肝組織學(xué)到單純性肝脂肪變性再到炎癥和纖維化過程中的一個“分子鐘”[4]。一些研究也建議將DNA甲基化狀態(tài)作為NAFLD進展的標(biāo)志[5]。因此，本文對目前DNA甲基化在NAFLD中的研究進展、影響因素及潛在臨床意義進行分析，以期加深對DNA甲基化和NAFLD關(guān)系的認(rèn)識，并對以之為潛在治療靶點的臨床意義進行進一步挖掘與探索，改善患者的生存及預(yù)后。

1 NAFLD的流行病學(xué)分析、危險因素及發(fā)病機制研究進展

NAFLD的患病率為15%～70%，因種族和診斷方法的不同而不同。全球NAFLD患病人數(shù)高達10億[6]，已成為目前公認(rèn)的全球最常見的慢性肝病[7]。據(jù)估計，NASH影響了全球3%～5%的人口[8]，NAFLD是美國慢性肝病最普遍的原因，影響8 000萬至1億人，其中NASH幾乎占25%[6]。我國NAFLD患病率為29.2%，中年、男性、西北地區(qū)和臺灣地區(qū)、人均國內(nèi)生產(chǎn)總值(GDP)>10萬元的地區(qū)、維吾爾族和回族人群的疾病負(fù)擔(dān)較重。我國受NAFLD影響的人口在10年內(nèi)從18%急劇增加到29%，患病率以西方國家的兩倍多的速度增長。據(jù)預(yù)測，到2030年，我國將成為全球NAFLD患病率增長最快的國家，將有3.1458億例。此外，我國NAFLD的中位年齡是世界上最年輕的，這意味著其晚期并發(fā)癥的最大影響將發(fā)生在以后的幾十年[9]。

NAFLD的發(fā)病及進展是一個復(fù)雜的過程，其機制尚不清楚[10]。環(huán)境因素(飲食、生活方式、腸道微生物區(qū)系等)與遺傳和表觀遺傳背景協(xié)同作用，促進肝臟胰島素抵抗、慢性肝炎和壞死性炎癥。代謝失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和氧化應(yīng)激、脂毒性(由非酯化膽固醇、神經(jīng)酰胺或二酰甘油引起)和病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)的存在(由增加的腸道生物失調(diào)和腸道通透性促進)導(dǎo)致肝細胞損傷和死亡、免疫細胞浸潤、纖維化和疾病進展[10]。

NAFLD與肥胖、胰島素抵抗、高血壓、血脂異常、2型糖尿病(T2DM)、代謝綜合征及心血管疾病密切相關(guān)[11-13]。包括澳大利亞、美國、新西蘭、英國等范圍內(nèi)NAFLD發(fā)病率的上升在一定程度上是由肥胖率和T2DM的激增推動的[14]。Meta回歸模型顯示，地理區(qū)域和平均年齡與NAFLD的患病率有關(guān)(P<0.05)[7]。Ekstedt等[15]進行長達33年的隨訪研究表明，NAFLD患者的死亡風(fēng)險增加，且NAFLD患者的纖維化階段可以預(yù)測總體死亡率和疾病特異性死亡率。

2 DNA甲基化與NAFLD

2.1 DNA甲基化越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳機制影響NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳修飾，也是研究最廣泛和表征最好的表觀遺傳標(biāo)記[16]，在基因組印跡、細胞分化、胚胎發(fā)育、X染色體失活和染色體穩(wěn)定等諸多過程中發(fā)揮著重要作用[17]。

DNA甲基化是指胞嘧啶的第5位碳原子在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下被甲基化修飾為5-甲基胞嘧啶(5mC)[18-19]。在人類和其他哺乳動物中，這種修飾只強加于DNA序列中鳥苷之前的胞嘧啶(CpG二核苷酸)。發(fā)生DNA甲基化的CpG二核苷酸在基因組中的分布不均，這些二核苷酸可以聚集在稱為“CpG島”的DNA的小片段(0.5～4.0 kb)中，這些區(qū)域通常與DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的開始部位-啟動子區(qū)域[包括轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)1500、TSS200、5′非翻譯區(qū)(UTR)和第一外顯子]有關(guān)。在基因組的大部分中，約80%與CpG島無關(guān)的CpG二核苷酸是高度甲基化的。相反，CpG島上的二核苷酸，特別是那些與基因啟動子相關(guān)的二核苷酸，無論基因是否正在轉(zhuǎn)錄，通常是未甲基化的[20]。約60%的人類基因在其啟動子上有CpG島[21]，基因啟動子區(qū)域的甲基化通常與基因沉默相關(guān)[20]。

2.2 NAFLD患者基因多位點發(fā)生DNA甲基化改變

NAFLD患者中，DNA發(fā)生甲基化并引起沉默效應(yīng)相對比較普遍。很多研究均證明，NAFLD患者DNA多位點發(fā)生甲基化改變，與疾病的發(fā)生及進展密切相關(guān)，也有許多基因是組織特異性甲基化，因此在疾病過程中不發(fā)生變化。NAFLD患者的肝細胞和白細胞具有相同的DNA甲基化模式，即全局低甲基化模式[22]。Murphy等[23]在NAFLD組織中觀察到TSS和大多數(shù)CGI的整體低甲基化。常染色體和性染色體的甲基化也不同，X染色體上CGI的相對高甲基化，這可能是由于女性的X染色體失活導(dǎo)致。在比較輕度和晚期NAFLD的甲基化情況時，在CGI海岸(距CGI 0～2 kb)觀察到輕度和重度NAFLD之間的差異甲基化顯著增加。許多組織修復(fù)基因在晚期NAFLD中低甲基化和高表達(如COL1A1、LAMA4、CCR7等)，而某些代謝基因高甲基化和表達下調(diào)(如APOC4、CYP2C19、SLCO1B3等)。Zhang等[22]在外周血細胞中發(fā)現(xiàn)863個差異甲基化(DM)CpG位點，詳細地說，編碼區(qū)的高甲基化和低甲基化位點的比例遠遠高于基因組的其他區(qū)域。在基因組的非編碼區(qū)，啟動子和基因間隔區(qū)的CGI分別含有豐富的低甲基化和高甲基化位點。這些發(fā)現(xiàn)表明，DM基因座雖然數(shù)量有限，但在基因組的生物區(qū)高度富集。且研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控糖脂代謝、脂肪性肝炎、纖維化和癌變基因的CpG位點甲基化改變與NAFLD密切相關(guān)；Wu等[4]研究分析NAFLD患者的循環(huán)血白細胞含有65個CpG位點，與健康對照組相比，這與60個差異甲基化的基因密切相關(guān)，在NAFLD患者和正常對照組中被發(fā)現(xiàn)顯著甲基化，且半數(shù)以上與NAFLD相關(guān)的CpG位點主要表現(xiàn)為低甲基化。

2.3 DNA甲基化參與NAFLD的發(fā)病過程在NAFLD的發(fā)病中，DNA甲基化也起到不可或缺的作用。Walle等[24]研究表明，肝臟脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase，F(xiàn)ADS)2基因變異可能通過改變DNA甲基化，參與NAFLD的發(fā)病。酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4(long chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)(Cg15536552)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1C(carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C)(Cg21604803)低甲基化位點與NAFLD發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。ACSL4(Cg15536552)甲基化水平降低增加了NASH的易感性[22]。

2.4 DNA甲基化在NAFLD疾病進展中的作用多種基因參與脂質(zhì)代謝過程，而部分基因發(fā)生甲基化即可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝異常。Borowa-Mazgaj等[25]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD的發(fā)生和發(fā)展與由甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(glycine N-methyltransferase，GNMT)啟動子胞嘧啶DNA高甲基化介導(dǎo)的GNMT下調(diào)密切相關(guān)。干擾素調(diào)節(jié)因子6(interferon regulatory factor 6，IRF6)基因啟動子高甲基化下調(diào)，不能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ及其靶點，從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常[26]。ACSL4在高脂血癥小鼠血漿甘油三酯和葡萄糖代謝及肝臟磷脂合成中起關(guān)鍵作用[27]。鋅指蛋白300(ZNF300)通過PPARα促進脂肪酸氧化而在肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，這種作用可能被DNMT3a介導(dǎo)的ZNF300甲基化所阻斷[28]。

2.5 DNA甲基化與NAFLD嚴(yán)重程度相關(guān)越來越多的研究表明，NAFLD的嚴(yán)重程度與DNA甲基化水平有關(guān)(見表1)，且不同位點的甲基化程度可能與NAFLD嚴(yán)重程度呈正或負(fù)相關(guān)。位于PARVB變異體1調(diào)節(jié)區(qū)的CpG26在晚期NAFLD患者的肝臟中顯著低甲基化。相反，在這些患者中，PNPLA3調(diào)節(jié)區(qū)的CpG99高度甲基化[29]，而與輕度NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者PPARα啟動子目標(biāo)區(qū)的CpG3具有顯著更高的DNA甲基化。類似地，PPARδ啟動子靶區(qū)內(nèi)的CpG2的DNA甲基化程度在重度組顯著增加[17]。Hardy等[30]發(fā)現(xiàn)，與輕度NAFLD患者相比，重度NAFLD患者PPARγ基因啟動子上CpG1和CpG2的甲基化程度更高，PPARγ基因啟動子上CpG1甲基化閾值81%是區(qū)分輕度和晚期纖維化的最佳分界值。Wu等[4]研究證明，與正常肝臟和單純性肝臟脂肪變性相比，NASH與不同的DNA甲基化有關(guān)，其中SSBP1和SIGIRR對NASH和單純性肝脂肪變性有較好的鑒別作用。

表1 預(yù)測NAFLD嚴(yán)重程度的DNA甲基化相關(guān)的基因列表

另一方面，也有研究表明，隨著肝臟炎癥程度的加重和疾病的進展，NAFLD患者整體DNA甲基化水平呈下降趨勢[31]。晚期NAFLD患者的肝臟PNPLA3 mRNA水平低于輕度NAFLD患者，且與肝DNA中CpG99甲基化水平呈負(fù)相關(guān)[29]。重度NAFLD組血小板衍生生長因子α(platelet-derived growth factor alpha，PDGFα)啟動子CpG3甲基化程度僅為輕度肝病組的一半[17]。Tu等[32]研究表明，脂肪心磷脂合酶1(adipose cardiolipin synthase 1，CRLS1)通過抑制激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)的表達和活性，減輕NASH病理過程中的胰島素抵抗、肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。

2.6 DNA甲基化與NAFLD癌變除了參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展及在決定疾病嚴(yán)重程度過程中起到一定作用之外，一些研究表明DNA甲基化也參與NAFLD惡變。Hotta等[33]利用共甲基化和差異甲基化區(qū)域(DMR)分析證明，晚期NAFLD患者肝臟線粒體功能、氧化還原酶活性和代謝的降低發(fā)生在DNA甲基化水平，并在DNA甲基化水平獲得致瘤潛能。Kuramoto等[34]在腫瘤相關(guān)基因中發(fā)現(xiàn)了NASH和NASH相關(guān)的HCC特異性DNA甲基化改變，這種改變與mRNA表達異常相關(guān)，可能參與NASH相關(guān)的多階段肝癌的發(fā)生。Sung等[35]報道，ACSL4的高表達與HCC的分級和分期密切相關(guān)，是HCC中總生存期(OS)獨立的預(yù)后危險因素，與索拉非尼治療晚期HCC患者的良好預(yù)后相關(guān)，可用于預(yù)測索拉非尼在HCC中的敏感性[36]。

Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在與NAFLD相關(guān)的CpG位點，包括鉀電壓門控通道亞家族Q成員3(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3，KCNQ3)、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferases，F(xiàn)UT)11、雙特異性磷酸酶16(dual-specificity phosphatase 16，DUSP16)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子1(calmodulin binding transcription activator 1，CAMTA1)、G2和S期表達1(G2and S-phase expressed 1，GTSE1)，似乎與NAFLD有密切的聯(lián)系，并且發(fā)生HCC的風(fēng)險更高，其中GTSE1的高表達與HCC患者的病理分期和預(yù)后不良有關(guān)[37]，可能是預(yù)測肝癌預(yù)后的分子標(biāo)志物[38]。

3 NAFLD患者發(fā)生DNA甲基化的影響因素

對DNA甲基化研究的發(fā)展揭示了DNA甲基化不是固定的，而是高度動態(tài)的，并且對細胞和組織微環(huán)境作出反應(yīng)[17]。環(huán)境因素會影響DNA甲基化，下面列舉出一些對DNA甲基化的主要影響因素。

飲食是影響DNA甲基化的主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料和高脂飼料加果糖喂養(yǎng)的小鼠降低了脂肪酸氧化的限速酶CTP1A的活性[39-40]，可能通過DNA CpG甲基化從而特異性激活DNMT1，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達[41]。研究發(fā)現(xiàn)一碳供體(包括甜菜堿、膽堿、葉酸)均有劑量依賴性的改善NAFLD的效果，它們還能改善血清和肝臟氧化還原系統(tǒng)、肝臟S-腺苷蛋氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸(SAM/SAH)比值，并增加肝臟整體DNA甲基化[42]。

子宮內(nèi)代謝環(huán)境對DNA甲基化的影響是其增加NAFLD易感性的機制之一。動物模型研究表明，子宮內(nèi)過多的膽固醇暴露可以使子代易患上NAFLD，這種早期發(fā)育可以持續(xù)整個生命周期[43]。

中醫(yī)藥對DNA甲基化的影響是其發(fā)揮作用的機制之一。含砷中草藥方劑(CHF)青黃可引起全基因組顯著去甲基化，并影響染色體核型狀態(tài)和基因組甲基化水平[44]。白藜蘆醇可降低NAFLD條件下DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達和活性，減輕氧化應(yīng)激和脂質(zhì)堆積[45]，而且適當(dāng)攝取白藜蘆醇可能是預(yù)防NASH發(fā)生發(fā)展的潛在途徑[46]。

減肥手術(shù)是影響DNA甲基化的因素之一。在減肥手術(shù)前后編碼蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPRE)的基因表現(xiàn)出差異表達和差異甲基化，失去甲基化的CpG位點通常在從正常肝臟向NASH進展的過程中獲得甲基化[47]。Benton等[48]分析了肥胖女性在胃旁路手術(shù)和顯著減肥前后脂肪組織中的DNA甲基化，共分析了485 577個CpG位點。配對分析顯示大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織的甲基化顯著不同。在體質(zhì)量下降之前，CpGs有較大比例的高甲基化，并且在3’UTR和基因體中觀察到相對于啟動子區(qū)域的甲基化增加[48]。

體育鍛煉也是影響DNA甲基化的因素之一，同時也是一種有益的非藥物預(yù)防和治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練能夠改變小鼠肌肉生長和分化相關(guān)基因的DNA甲基化模式[49]，而且運動能夠誘導(dǎo)PGC-1α、PDK4和PPAR-δ的表達呈劑量依賴性，啟動子的甲基化水平顯著降低[50]。體育鍛煉已被證明對代謝性肝功能障礙的某些病理特征有益處，尤其是線粒體功能障礙[5]。

4 DNA甲基化對于NAFLD治療的潛在臨床意義

NAFLD的最佳非侵入性檢測方法仍在開發(fā)中，我們期待未來可以開發(fā)出一種檢查方法可以接近甚至超過肝活檢的臨床價值。Wu等[4]結(jié)果表明，DNA甲基化的表觀遺傳學(xué)變化可能與臨床參數(shù)相關(guān)，包括血清肝酶、血脂譜及NAFLD的組織學(xué)特征。且研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者外周血白細胞中存在甲基化CpG位點的改變，這些血源性生物標(biāo)志物可能對NASH的臨床研究和診斷有潛在價值。5hmC譜是NAFLD中基因轉(zhuǎn)錄的有用標(biāo)志和細胞狀態(tài)的標(biāo)志，并提示5hmC譜有可能作為與肥胖相關(guān)的異常肝生理的生物標(biāo)志物[51]。

Zeybel等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中每個CpG位點的甲基化在個體內(nèi)的變異相當(dāng)?shù)?，甲基化水平似乎不受年齡或性別的影響，這表明單個位點肝活檢可能足以提供代表整個器官的DNA甲基化的定量估計。Murphy等[52]對特征良好的輕度或晚期NAFLD患者肝臟進行全基因組甲基化和肝臟基因表達(GEX)數(shù)據(jù)綜合分析，結(jié)果表明在晚期NAFLD中發(fā)生的甲基組-轉(zhuǎn)錄組相互作用可以調(diào)節(jié)NAFLD的結(jié)果，包括癌癥和/或肝硬化的發(fā)展。

NASH是HCC發(fā)生的獨立危險因素[53]。DNA甲基化模式的改變可能是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的最早可檢測到的腫瘤變化之一。攜帶循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的癌癥特異性甲基化模式已被研究成為癌癥中可行的生物標(biāo)志物。最近的研究表明，ctDNA有可能通過非侵入性的“液體活檢”來徹底改變癌癥的篩查、診斷和治療，而且部分研究也表明，ctDNA甲基化標(biāo)志物具有高度的敏感性和特異性，與肝癌患者的腫瘤負(fù)擔(dān)、分期、治療反應(yīng)和預(yù)后相關(guān)，證明了無細胞DNA甲基化分析在HCC的診斷、治療評估和預(yù)后中的作用，并為其在HCC以外的腫瘤中的廣泛應(yīng)用提供了概念上的證據(jù)[54]。

5 總結(jié)與展望

NAFLD疾病的嚴(yán)重性日益顯現(xiàn)，DNA甲基化是NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的重要決定因素，與NAFLD的進展和纖維化的發(fā)展密切相關(guān)。上述研究表明，通過改變生活方式來調(diào)節(jié)表觀基因組似乎能夠逆轉(zhuǎn)因飲食不當(dāng)而造成的NAFLD，并有望通過發(fā)展一些無創(chuàng)操作檢查技術(shù)如血源性生物標(biāo)志物、液體活檢等來鑒別早期及進展期NAFLD患者，改變NASH相關(guān)HCC的患者的篩查、診斷和治療，在一定程度上減少NAFLD患者的痛苦，延緩疾病的發(fā)展，為NAFLD患者帶去福音。