丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4B通過上調(diào)KDM5C表達(dá)提升其致瘤性

鄭 義， 鄭靜薇， 包君麗， 林列坤， 杜 姍， 曾凡杞

1.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 深圳 518106； 2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是嚴(yán)重危害人類健康的病原體，全球HCV的感染率約3%，其中80%為慢性感染，常常導(dǎo)致脂肪肝、慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌[1]。盡管特異性抗HCV藥物已上市[2]，但這些藥物存在嚴(yán)重的毒副作用和治療耐受的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，對病毒和宿主之間相互作用的理解是發(fā)展更有效治療藥物或方法的前提。非結(jié)構(gòu)蛋白4B(non-structural protein 4B，NS4B)是HCV編碼的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，高度疏水，具有多次跨膜的復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，能單獨(dú)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生“膜網(wǎng)”，為HCV復(fù)制的支架，成為HCV復(fù)制酶復(fù)合物的重要組織者。在病毒復(fù)制體(vRFs)中，NS4B除了錨定結(jié)合膜外，還與病毒編碼的其他蛋白和宿主細(xì)胞蛋白相互作用，以及誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)的生物合成[4]。NS4B這些功能對HCV生命周期中的復(fù)制、組裝、致病性等產(chǎn)生重要影響，然而對其機(jī)制雖有涉及但遠(yuǎn)未知曉。我們前期分析了HCV不同基因型和亞型的NS4B序列，發(fā)現(xiàn)其C-末端(C terminal domain，CTD)存在Ⅰ類PBM(PDZ-binding motif)基序[5]，并研究證明了該基序介導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)極性蛋白Scrib的相互作用，通過泛素-蛋白酶體途徑特異介導(dǎo)Scrib的降解，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，我們發(fā)現(xiàn)NS4B通過Scrib誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Merlin蛋白表達(dá)減少，引起Hippo信號途徑中Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，Yap)去磷酸化，去磷酸化的Yap轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，激活A(yù)KT，提高其致瘤性[5]。

表觀遺傳決定基因的表達(dá)水平，在個(gè)體的發(fā)育分化、細(xì)胞的命運(yùn)決定、對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)等過程中起到?jīng)Q定性作用。研究[6]發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞常劫持各種已有的表觀遺傳機(jī)制，讓細(xì)胞產(chǎn)生更有利于癌變的各種表觀遺傳變化，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生、進(jìn)展、腫瘤轉(zhuǎn)移和抗藥性的產(chǎn)生。表觀遺傳包括染色質(zhì)重塑、DNA的甲基化、組蛋白修飾等。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的核心手段，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少8種不同的修飾類型，其中最為常見的4種修飾，即乙?；?、甲基化、磷酸化和泛素化均是可逆的。組蛋白修飾參與對染色質(zhì)功能的調(diào)控。在目前已知的甲基化位點(diǎn)中，6個(gè)位點(diǎn)的研究最為深入，它們分別是H3上的K4、K9、K27、K36和K79及H4K20。除了H3K79以外，其他位點(diǎn)均分布在組蛋白N端的尾巴上。相對于組蛋白乙?；揎?，甲基化修飾要復(fù)雜得多。首先，甲基化修飾具有多種不同的功能，包括激活轉(zhuǎn)錄(如H3K4me3)、抑制轉(zhuǎn)錄(如H3K9me3)、DNA損傷應(yīng)答(如H4K20me3)、轉(zhuǎn)錄延伸(如H3K36me3)等。第二，甲基化修飾存在多個(gè)層次，在一個(gè)賴氨酸位點(diǎn)上可以發(fā)生單甲基化、二甲基化和三甲基化的修飾。不同層次的甲基化修飾具有不同的功能，例如H3K4me3分布在基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，而H3K4me則分布在基因的增強(qiáng)子上。組蛋白甲基化狀態(tài)通過賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶—寫作者(writers)，和去甲基化酶—搽拭者(erasers)的協(xié)同作用動態(tài)控制[6]。在本研究中，我們研究組蛋白修飾對HCV-NS4B致瘤性的影響，為HCV的治療提供靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體pCDNA3.1(-)NS4B、pEGFPC1-NS4B的構(gòu)建按常規(guī)方法進(jìn)行。質(zhì)粒pCDNA3.1(-)NS4B和pEGFPC1-NS4B由本實(shí)驗(yàn)室保存。用免疫熒光和Western blotting分析進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)粒載體的構(gòu)建。KDM5C的siRNA序列參考文獻(xiàn)[7]，其序列為：正鏈：5′-GTGACAGTAAACGGCACCT-3′,負(fù)鏈：5′-AGGTGCCGTTTACTGTCA-3′，siRNA-KDM5C和對照siRNA委托GenePharma公司合成(上海)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在25 mmol/L NaHCO3，10 μl/ml鏈霉素，100 μg/ml青霉素G和質(zhì)量濃度為100 g/L(V/V)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HepG2以5×104個(gè)/ml接種到含有6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染(Invitrogen)pCDNA3.1(-)、pCDNA3.1(-)NS4B或pEGFPC1-NS4B。

1.3 HCV-NS4B的檢測為了驗(yàn)證構(gòu)建的pCDNA3.1(-)NS4B和pEGFPC1-NS4B質(zhì)粒，用熒光顯微鏡和Western blotting分析證實(shí)。HepG2細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種到含有6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合達(dá)到90%后，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染(Invitrogen)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(0.1 μg/ml)。轉(zhuǎn)染后48 h在熒光顯微鏡觀察NS4B的表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(-)NS4B質(zhì)粒的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(購自Qiangen生物公司)裂解，裂解物冰浴30 min，12 000g，4 ℃離心15 min。SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)Immobilon膜。用抗NS4B單抗(購自Santa Cruz公司)檢測HCV-NS4B的表達(dá)。

1.4 檢測NS4B對組蛋白修飾的影響為了研究NS4B對組蛋白甲基化和乙?；挠绊懀覀冇肏epG2細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種到含有6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到90%后，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染(Invitrogen)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1(-)NS4B或pCDNA3.1(-)(0.2 μg/ml)。72 h收獲細(xì)胞。用組蛋白提取試劑盒(EpiQiuikukn 總組蛋白提取試劑盒)提取組蛋白，Western blotting操作同上，一抗分別為抗H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3、H3K14ac、H3K18ac、H4K8ac、抗丁酸抗體、抗?；贵w、抗H3抗體。這些抗體均購自Abcam公司，二抗為兔抗小鼠的標(biāo)記HRP的IgG抗體(Santa Cruz公司)。

1.5 檢測賴氨酸去甲基化酶5(KDM5)的表達(dá)KDM5家族蛋白，包括KDM5A-D(也稱為JARID1A-D),是依賴Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸的雙氧酶，催化H3K4me3上甲基的除去。因KDM5D是Y染色體編碼的男性特異性組蛋白去甲基化酶5D，在本研究中，用Western blotting檢測KDM5A-C的表達(dá)，方法同上，一抗KDM5A-C購自Santa Cruz公司，二抗為兔抗小鼠的標(biāo)記HRP的IgG抗體。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為了評價(jià)HCV-NS4B和KDM5C對細(xì)胞增殖的影響，轉(zhuǎn)染前1 d將HepG2細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞分組，每組設(shè)48 h時(shí)間點(diǎn)，每組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按照表1所示組合轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后，將培養(yǎng)基換為含有質(zhì)量濃度為20 g/L胎牛血清的DMEM，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h向不同處理的細(xì)胞中加入20 μl 5 g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基(注意不要吸走藍(lán)色結(jié)晶)，每孔細(xì)胞加入200 μl DMSO，避光振蕩10 min后測定OD492 nm值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%，設(shè)定對照組存活率為100%。

表1 MTT實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒處理表

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)為了研究KDM5C對HCV-NS4B致瘤性的影響，分成4組，即A組：pCDNA3.1(-)+對照siRNA組，B組：pNS4B+對照siRNA組，C組：pCDNA3.1(-)+siRNA-KDM5C組，D組：pNS4B+siRNA-KDM5C組。轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染后2 d，胰酶消化細(xì)胞后用DMEM培養(yǎng)基重懸，接著用0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖覆蓋在含DMEM培養(yǎng)基的0.6%瓊脂板上(20 mm)，每個(gè)板含1 000個(gè)細(xì)胞。2周后，細(xì)胞用冰冷的甲醇和乙酸(3∶1，V/V)混合物固定15 min。然后用0.5%結(jié)晶紫染色。觀察克隆形成情況并拍照。計(jì)算克隆形成百分比，克隆形成百分比=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)×100%，設(shè)定對照組為100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)統(tǒng)計(jì)，兩獨(dú)立樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV-NS4B的鑒定對構(gòu)建的pCDNA3.1(-)NS4B通過限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定，目標(biāo)帶的大小與預(yù)期的一致，DNA測序分析也證明構(gòu)建的質(zhì)粒是正確的，通過Western blotting分析均表明構(gòu)建的質(zhì)粒能在HepG2細(xì)胞中表達(dá)。此外，重組的pEGFPC1-NS4B質(zhì)粒在熒光顯微鏡下觀察到有表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒是正確的，并能在HepG2細(xì)胞中表達(dá)(見圖1)。

注：A：pEGFPC1-NS4B重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果(1:DNA marker，2:重組質(zhì)粒雙酶切，3:重組質(zhì)粒單酶切，4:重組質(zhì)粒未酶切)；B：質(zhì)粒測序部分結(jié)果(上排為構(gòu)建完成質(zhì)粒測序結(jié)果，下排為HCV NS4B 3′端部分序列)；C：空白質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果(放大100倍)；D：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Western blotting分析NS4B的表達(dá)。

2.2 HCV-NS4B對組蛋白修飾的影響我們用pCDNA3.1(-)和pCDNA3.1(-)NS4B轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用Western blotting分析幾種主要的組蛋白修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HCV-NS4B能誘導(dǎo)H3K4me3減少，H3K36me3增加，對H3K79me3影響不大，誘導(dǎo)H3K18ac和H4K8ac輕微增加，但對H3K14ac無影響。NS4B能誘導(dǎo)組蛋白丁酸化(butyration)、?；?propionylation)增加，誘導(dǎo)H4K12酰化、H3K14巴豆酰化增加，但對H3K14酰化的影響不明顯(見圖2)。

圖2 HCV-NS4B對組蛋白修飾的影響

2.3 HCV-NS4B對賴氨酸去甲基化酶5(KDM5)的影響因?yàn)镠CV-NS4B能誘導(dǎo)H3K4me3減少，H3K36me3增加，接著，我們研究NS4B對KDM5表達(dá)的影響。結(jié)果表明，NS4B能誘導(dǎo)KDM5C表達(dá)增加，但對KDM5A和KDM5B影響不明顯(見圖3)。

圖3 HCV-NS4B對KDM5表達(dá)的影響

2.4 HCV-NS4B和KDM5C對HCV-HepG2細(xì)胞增殖的影響不受控制的過度生長和增殖是細(xì)胞癌變的標(biāo)志，我們在HepG2細(xì)胞中評價(jià)了KDM5C和HCV-NS4B對細(xì)胞生長和增殖的能力以及它們之間的相互關(guān)系。HCV-NS4B的過表達(dá)顯著提升細(xì)胞的增殖，敲減KDM5C的則明顯抑制HepG2的增殖，且對HCV-NS4B過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖起抑制作用(見圖4)。

注：1、2、3、4分別表示pCDNA3.1(-)(50 ng)+對照siRNA(0.5 mmol/L)組；pCDNA3.1(-)(50 ng)+KDM5C siRNA(0.5 mmol/L)組；pNS4B(50 ng)+對照siRNA(0.5 mmol/L)組和pNS4B(50 ng)+KDM5C siRNA(0.5 mmol/L)組。*P<0.05，**P<0.01。

2.5 KDM5C抑制劑對HCV-NS4B誘導(dǎo)的克隆形成的影響為了研究HCV-NS4B誘導(dǎo)KDM5C增加對NS4B致瘤性的影響，克隆形成實(shí)驗(yàn)分成4組，即：A組：pCDNA3.1(-)+對照siRNA組，B組：pNS4B+對照siRNA組，C組：pCDNA3.1(-)+siRNA-KDM5C組，D組：pNS4B+siRNA-KDM5C組。克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，克隆形成百分比從大到小依次為pNS4B+對照siRNA組、pCDNA3.1(-)+對照siRNA組、pNS4B+siRNA-KDM5C組、pCDNA3.1(-)+siRNA-KDM5C組；與NS4B+對照siRNA組比較，pCDNA3.1(-)+對照siRNA組和pNS4B+siRNA-KDM5C組的克隆形成數(shù)量大大減少(P<0.01)，但比pCDNA3.1(-)+siRNA-KDM5C組克隆形成數(shù)多(P>0.05)(見圖5)。這些結(jié)果表明，抑制KDM5C可以減少HCV-NS4B的可能致瘤性，但未完全根除，表明HCV-NS4B誘導(dǎo)的致瘤性還通過其他途徑。

注：A、B、C、D分別表示pCDNA3.1(-)+對照siRNA組；pNS4B+對照siRNA組；pCDNA3.1(-)+siRNA-KDM5C組和pNS4B+siRNA-KDM5C組?？寺⌒纬砂俜直?實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)×100%。*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

HCV感染導(dǎo)致肝癌的致病機(jī)制有諸多探討，如HCV-core能與Snail和組蛋白去乙酰酶(HDACs)相互作用促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[8]，HCV-core+1/ARF蛋白調(diào)節(jié)Cyclin D1/pRb途徑，促進(jìn)致癌[9]。HCV-core蛋白促進(jìn)Nm23-H1蛋白Sumoylation化后被降解以及轉(zhuǎn)錄失調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[10]。NS4B也可通過不同機(jī)制致瘤。HCV-NS4B能不依賴共轉(zhuǎn)染的Ha-ras基因轉(zhuǎn)化NIH-3T3細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤形成[11]。我們之前的研究表明，HCV-NS4B的C末端能與Scrib相互作用降解Scrib，通過Hippo-AKT途徑促進(jìn)腫瘤形成，并且HCV-NS4B誘導(dǎo)Snail表達(dá)升高促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。這些研究表明，HCV編碼的蛋白能引起細(xì)胞致瘤和促進(jìn)轉(zhuǎn)移[5，12]。但NS4B能否通過表觀遺傳的方式對其致瘤性產(chǎn)生影響尚無研究。

在本研究中，我們首先觀察到NS4B能夠誘導(dǎo)H3K4me3減少，H3K36me3增加，對H3K79me3影響不大，對H3K18ac和H4K8ac輕微增加，但對H3K14ac無影響。NS4B能誘導(dǎo)組蛋白丁酸化、?；黾樱T導(dǎo)H4K12?；3K14巴豆?；黾樱珜3K14?；挠绊懖幻黠@。顯然，HCV-NS4B是能夠引起細(xì)胞表觀遺傳改變的，特別是H3K4me3的改變。組蛋白賴氨酸甲基化狀態(tài)與基因的表觀和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相聯(lián)系。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通過H3K4me3標(biāo)記，這有助于RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的進(jìn)入和裝備。相比較而言，H3K4me1修飾聯(lián)合?；腍3K427(H3K27ac)是預(yù)示活躍的增強(qiáng)子，能遠(yuǎn)距離調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性。已鑒定了能結(jié)合H3K4me3的各種不同蛋白復(fù)合物，但特異的H3K3me1結(jié)合物似乎很少。H3K4甲基化能通過組蛋白去甲基化酶KDM5/JARID1(K4me3/2到K4me1)、Lsd/KDM1(K4me2/1到K4me0)家族成員逆轉(zhuǎn)。全基因組研究揭示KDM5A(也稱為JARID1A/Rbp2)和KDM5B(也稱為JARID1B/Plu-1)位于基因啟動子區(qū)。而Lsd1/KDM1A結(jié)合啟動子和遠(yuǎn)端元件，Lsd2/KDM1B和H3K36甲基化共定位于轉(zhuǎn)錄基因內(nèi)部[13]。

由于HCV-NS4B能引起H3K4me3減少，KDM5主要功能是催化H3K4me3/2除去甲基，我們接著繼續(xù)研究NS4B對KDM5表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)HCV-NS4B能夠誘導(dǎo)KDM5C表達(dá)增加，但KDM5A和KDM5B的表達(dá)影響不明顯。KDM5家族成員有不同的生物學(xué)功能。研究[13-14]顯示，KDM5A和KDM5B直接與癌癥相關(guān)。在小鼠模型中，失去KDM5A抑制腫瘤產(chǎn)生。胃癌高表達(dá)KDM5A，乳腺癌和前列腺癌高表達(dá)KDM5B。KDM5A和KDM5B涉及維持癌癥細(xì)胞群的慢生長和藥物耐受。KDM5C(SMCX或JARIC1C)基因與幾種人類疾病相關(guān)，如腎癌和X-連鎖的精神遲鈍。最近發(fā)現(xiàn)，STING的表達(dá)被H3K4 KDM5B和KDM5C表觀遺傳抑制，被H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶激活，證明一個(gè)新的免疫反應(yīng)的表觀調(diào)控途徑，表明KDM5是抗病原體和抗癌免疫治療的潛在靶標(biāo)[14]。

為了研究KDM5C在NS4B致瘤性方面的作用，我們首先用MTT證明了敲減KDM5C減弱HCV-NS4B對HepG2的細(xì)胞增殖能力，然后用克隆形成實(shí)驗(yàn)證明了敲減的KDM5C減少對NS4B轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的克隆形成數(shù)，但少于無HCV-NS4B誘導(dǎo)的敲減KDM5C的HepG2的克隆形成數(shù)。這表明KDM5C影響NS4B的致瘤性，但不能排除有其他途徑參與[5，12]。其他致瘤病毒通過編碼蛋白影響KDM的表達(dá)或直接相互作用，調(diào)節(jié)宿主染色質(zhì)的重塑或組蛋白修飾，從而影響宿主抗病毒反應(yīng)或致病性。EBV原癌基因誘導(dǎo)H3K27me3去甲基化酶KDM6B/JMJD3表達(dá)，有助于EBV-相關(guān)的惡性腫瘤的致病性[15]。在EBV感染的B細(xì)胞基因抑制期間EBNA3C直接招募RBPJ到染色質(zhì)，并且EBNA3C與KDM2B相互作用抑制COBLL1和ADAM28-ADAMDEC1的表達(dá)[16]。HPV E7上調(diào)JARID1B的表達(dá)，減少TLR9啟動子處的H3K4me3，抑制免疫反應(yīng)。高危型HPVE6通過降解KDM5C激活EGFR和c-MET原癌基因的超級增強(qiáng)子[17]。

我們前期證明過HCV-NS4B具有抑制抗病毒反應(yīng)的作用[18]，HCV-NS4B能抑制STING累積[19]，使HCV感染細(xì)胞逃逸固有免疫反應(yīng)。我們初步推測：HCV-NS4B誘導(dǎo)KDM5C表達(dá)增加，可能通過減少STING等基因啟動子處的H3K4me3，減少干擾素-γ的表達(dá)。但本研究存在一些缺陷，HCV-NS4B通過KDM5C的表達(dá)增加，減少H3K4me3，是否影響某些抑癌基因的啟動子或超級增強(qiáng)子，這需要深入研究。因此，KDM5C可能是抗HCV治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。