槲皮素對小鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

劉文，康凱，張健楠，種陽，趙鳴雁

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury，LIRI)可發(fā)生于肺移植、肺切除、心臟驟停和肺栓塞患者，其引起的肺功能障礙是急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的重要危險因素，預(yù)示患者預(yù)后較差[1]。LIRI病理機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等[2]，靶向于無菌炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是減輕患者LIRI和改善預(yù)后的主要治療策略[3]。槲皮素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于較多蔬菜、水果和飲料中，具有抗炎、抗增殖和抗氧化等多種藥理學(xué)活性[4-5]。研究[6-10]發(fā)現(xiàn)，槲皮素對多種肺損傷模型均有保護(hù)作用，通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(HO-1)抑制肺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，并通過調(diào)節(jié)抗氧化劑基因的表達(dá)減少，可緩解百草枯介導(dǎo)的氧化損傷；通過與廣泛的細(xì)胞靶標(biāo)相互作用，可減少炎癥性細(xì)胞因子和生長因子的表達(dá)及粘蛋白的分泌，降低金屬蛋白酶的活性，減輕香煙中煙氣引起的大鼠氣道炎癥和粘液產(chǎn)生，而其抗小鼠肺缺血再灌注損傷的活性尚未闡明。本研究旨在探討槲皮素對LIRI的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

選擇-0.074 mm占41.41%、60.00%、80.00%、89.29%、99.59%的磨礦細(xì)度進(jìn)行細(xì)度試驗。磁性分析表明該礦以強(qiáng)磁性礦物為主，故磨礦細(xì)度試驗采用弱磁選，弱磁選條件：磁場強(qiáng)度110.00 kA/m，給礦濃度35.00%。試驗結(jié)果見表6。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性小鼠40只，體質(zhì)量28～32 g。動物分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房，自由飲水和飲食，12 h交替光照，濕度21～23 ℃，所有動物試驗均經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)同意。將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、槲皮素低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各 8只。

三個月說到就到，這天，又到交房租的日子，老梅打電話告訴李老鬼，說下午在家等他。李老鬼不愿意見老梅，給王鯰魚借一千二百元錢，讓李叔和送過來。李叔和來到她家的時候，她正和幾個女人打麻將。

1.1.2 主要試劑 槲皮素(B20527-1g)購買于上海源葉生物；Anti-p-AKT(protein kinase B，#13038)、AKT(#4685)、p-PI3K(phosphatidylinositide 3-kinases，#17366)、p-IκBα(Inhibitor of NF-κB，#2859)、p-p65(#3033)、p65(#8242)和β-Actin(#4970)抗體購于美國Cell signal公司，均為兔源；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成生物公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin- 6，IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)小鼠ELISA試劑盒購于杭州聯(lián)科生物生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 槲皮素低劑量組(2.5 mg/kg)、中劑量組(5 mg/kg)、高劑量組(10 mg/kg)小鼠灌胃給予對應(yīng)劑量的槲皮素；對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)5 d，最后一次給藥60 min后，麻醉小鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.7 TNF-α、IL-6和IL-1β測量 收集小鼠血清和肺組織勻漿上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測量小鼠血清和肺組織TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 肺組織W/D測量 處死小鼠后，立即稱重左肺下葉(即濕重)，然后在60 ℃干燥24 h至恒重稱量(即干重)，計算W/D值。

HE染色顯示，與對照組比較，模型組小鼠肺泡壁水腫，肺間質(zhì)增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞和肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺損傷評分增加(P<0.05)；槲皮素各劑量組小鼠較模型組上述病理變化緩解，肺損傷評分降低(P<0.05)。模型組小鼠肺W/D值(7.50±0.36)高于對照組(3.10±0.47)(P<0.05)，槲皮素低、中、高劑量組小鼠肺W/D值(7.00±0.38、5.80±0.52、4.86±0.48)較模型組減小(P<0.05)。見圖1。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 將小鼠肺組織于4 %多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片機(jī)切片，厚度4 μm。二甲苯除蠟脫水，蘇木精染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，水浸泡15 min；伊紅染色2 min；常規(guī)脫水、透明、密封。

1.2.8 蛋白免疫印跡(Western blot) 稱取左肺組織50 mg，加入含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液，勻漿。4 ℃ 13 000 rpm離心20 min，收集上清， BCA蛋白定量。每泳道上樣20 μg蛋白質(zhì)于聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜；用稀釋后的特異性一抗(Anti-p-AKT、AKT、p-PI3K、p-IκBα、p-p65、p65和β-Actin，稀釋比例 1∶1 000)與膜4 °C孵育過夜；洗膜，HRP-二抗室溫孵育60 min后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒曝光顯色。

1.2.2 LIRI小鼠模型建立[11]小鼠腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛(4.5 mL/kg)麻醉，RSP1002型小動物呼吸機(jī)輔助機(jī)械通氣，呼吸比(吸入/呼出空氣)1∶1，呼吸頻率80次/min，潮氣量10 mL/kg，吸氧分?jǐn)?shù)100%。觀察到肺塌陷和擴(kuò)張后開胸，用微血管鉗將左肺門肺血管(包括肺動脈，靜脈和支氣管)閉塞60 min，再灌注120 min，縫合胸腔切口。術(shù)后2 h，小鼠眼球取血，脫頸椎處死。分離小鼠左肺下葉部分用于后續(xù)試驗。通過檢測肺濕干重比值(W/D)、觀察病理變化驗證建模成功與否。

1.2.6 肺組織MPO、MDA和SOD測量 收集肺組織，加入生理鹽水，組織勻漿，4 ℃ 2 000 rpm離心15 min，收集上清，比色法測量肺組織MPO、MDA和SOD含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠LIRI肺組織形態(tài)學(xué)變化及損傷評分比較

1.2.4 肺損傷組織學(xué)評分 包括肺泡充血、肺泡壁增厚和水腫、肺泡細(xì)胞浸潤3項內(nèi)容，每項0～ 3分； 0分為無損傷，1分為輕度損傷，2分為中度損傷，3分為嚴(yán)重?fù)p傷[12]。

只有學(xué)生在真正的理解與掌握了電荷作用力后，才可以明確的找到庫侖定律中所包含的關(guān)鍵性的知識點。因此，在引導(dǎo)學(xué)生探索庫侖定律之前，首先要對電荷作用力進(jìn)行深入的探究。教師在設(shè)計課堂實驗的時候，可以選擇懸掛小球的實驗，將3個小球懸掛在鐵支架下側(cè)的位置，接著讓學(xué)生分析小球自身承受的作用力。通過這一實驗的演示，對于電荷彼此的作用應(yīng)以f來表示，懸掛線和豎直方向的夾角以a來表示，小球的質(zhì)量以m來表示。由此可見，通過觀察夾角的大小，便可以歸納出電荷作用力。

2.2 各組小鼠肺組織MPO、MDA及SOD含量比較

模型組小鼠肺組織MPO和MDA含量高于對照組(P<0.05)，SOD含量低于對照組(P<0.05)；槲皮素中劑量和高劑量組小鼠肺組織MPO和MDA含量低于模型組(P<0.05)，SOD含量高于模型組(P<0.05)。見表1。

首先是藥品智能化物流管理系統(tǒng)。藥品供應(yīng)是醫(yī)療保障的重要部分，醫(yī)院采用了先進(jìn)的藥品智能化物流管理系統(tǒng)，實現(xiàn)了藥品采購計劃生成智能化、采購計劃網(wǎng)上傳輸、藥庫庫位智能化管理、藥庫主動補貨、藥房藥品智能發(fā)放、藥品追溯等功能。有效提高了藥品供應(yīng)效率，減少了人為因素。

表1 各組小鼠肺組織MPO、MDA及SOD含量比較

2.3 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較

模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量高于對照組(P<0.05)；槲皮素低、中、高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量低于模型組(P<0.05)，且槲皮素高劑量組<中劑量組<低劑量組(P<0.05)。見表3。

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較

2.4 各組小鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β含量比較

模型組小鼠肺組TNF-α、IL-1β及IL-6含量高于對照組(P<0.05)；槲皮素低、中、高劑量組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量低于模型組(P<0.05)，且槲皮素高劑量組<中劑量組<低劑量組(P<0.05)。見表2。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較

2.5 各組小鼠肺組織PI3K-AKT-NFκB蛋白表達(dá)量比較

模型組小鼠肺組織中p-p65/p65、p-IκBα、p-AKT/AKT及p-PI3K蛋白表達(dá)量高于對照組(P<0.05)；槲皮素低、中、高劑量組小鼠肺組織p-p65/p65、p-IκBα、p-AKT/AKT及p-PI3K蛋白表達(dá)量低于模型組(P<0.05)，且槲皮素高劑量組<中劑量組<低劑量組(P<0.05)。見圖2及表4。

比較1990—2015年我國與上述樣本庫中部分國家的HDI指標(biāo)，我國于2011年后HDI指標(biāo)正式步入0.7，根據(jù)聯(lián)合國開發(fā)計劃署(UNDP)定義，“中等發(fā)展水平國家”變成“發(fā)展水平較高國家”。因此，上述HDI指標(biāo)對于我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展所處不同階段具有較好的刻畫作用(見圖1)。

慢性病患者的就醫(yī)行為主要發(fā)生在門診[13]和自購藥品[14]上，高血壓長期而頻繁的門診治療和疾病管理所花費的醫(yī)療費用是因病致貧的主要原因[15]。研究證實，收入較低的患者面臨著較高的門診就診經(jīng)濟(jì)風(fēng)險，高血壓患者的門診自付費用對患者家庭發(fā)生CHE存在著顯著影響。

表4 各組大鼠PI3K-AKT-NFκB蛋白表達(dá)量比較

3 討論

有研究[13]報道，炎癥因子可引起肺泡-毛細(xì)血管屏障的肺通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致動脈血氧合損傷及水腫。另有研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，許多天然類黃酮，如甘草查爾酮A、千層紙素A和黃芪素均可通過抑制炎性細(xì)胞因子分泌緩解肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素預(yù)處理可減輕I/R肺損傷小鼠的肺泡壁增厚和炎性細(xì)胞浸潤，并降低了肺濕/干重比(P<0.05)，表明槲皮素對LIRI和水腫有保護(hù)作用。TNF-α、IL-6和IL-1β是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要參與因子。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞激活、產(chǎn)生和釋放，是一種強(qiáng)大的炎癥介質(zhì)。研究[17]表明，TNF-α可以增加肺泡毛細(xì)血管通透性，減少肺泡中液體的清除能力，與IL-1β具有相似的作用。中性粒細(xì)胞是促炎性細(xì)胞因子的重要來源，中性粒細(xì)胞浸潤是急性肺損傷的重要標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組比較，槲皮素降低了I/R肺損傷小鼠炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量(P<0.05)，表明槲皮素可能通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗急性肺損傷作用。

LIRI與過度氧化應(yīng)激有關(guān)。研究[18]發(fā)現(xiàn)，過量ROS會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和其他有害的氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量反映了組織中脂質(zhì)過氧化的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠肺組織中MDA含量增加(P<0.05)，表明LIRI脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)；但與模型組比較，槲皮素組小鼠組織MDA含量降低(P<0.05)，表明槲皮素可以緩解脂質(zhì)過氧化。SOD是肺組織中主要的內(nèi)源性抗氧化劑，各種內(nèi)源性抗氧化劑(如過氧化氫酶，GSHPx等)和非酶性抗氧化劑(如維生素C，維生素E等)共同構(gòu)成了抗氧化劑系統(tǒng)，可以清除氧自由基并保持體內(nèi)平衡[19]。因此，SOD可反映抗氧化程度。另外，組織MPO活性是嗜中性粒細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素升高了急性肺損傷小鼠組織SOD含量和MPO活性(P<0.05)，表明槲皮素對LIRI有預(yù)防作用，可能與提高抗氧化酶和減少氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

NF-κB信號既是調(diào)節(jié)炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)釋放的重要通路，也是炎癥因子表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子[20]。病理條件下，NF-κB信號通路激活，IKK活化，進(jìn)而促進(jìn)IκBα磷酸化降解，引起p65磷酸化，調(diào)節(jié)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。有研究[21]報道，阻斷NF-κB信號通路可以發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，并緩解LIRI。此外，PI3K/AKT途徑與細(xì)胞存活、增殖和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，但PI3K/Akt途徑對LIRI的具體作用不清楚[22]，可能與PI3K/AKT信號通過降解IκBα激活NF-κB信號通路有關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠肺組織p-PI3K、p-AKT和p-p65表達(dá)升高(P<0.05)，表明PI3K/Akt介導(dǎo)的NF-κB信號通路與急性肺損傷的病理變化密切相關(guān)[24]。槲皮素組小鼠肺組織p-PI3K、p-Akt和p-p65的表達(dá)降低(P<0.05)，表明槲皮素可以抑制PI3K-AKT-NF-κB信號通路發(fā)揮抗急性肺損傷作用。

綜上，槲皮素能有效改善小鼠LIRI，機(jī)制可能與抑制PI3K-AKT-NFκB信號通路有關(guān)，其具體機(jī)制及對PI3K-AKT-NF-κB途徑的調(diào)節(jié)是直接作用還是間接仍需進(jìn)一步研究。