楊樹口蘑菌種分離和馴化*

孟慶國，池景良，朱巍巍

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000）

楊樹口蘑（Tricholoma populinum J.Lange） 也稱地?fù)?、老頭扣、地拱子，是口蘑屬（Tricholoma）中一種野生食用菌，生長于楊樹（Populus L.）林。其子實(shí)體較大，菌蓋直徑4 cm～15 cm，扁半球形至平展，邊緣內(nèi)卷波狀，粘，淺紅褐色，趨向邊緣色淺，氣味香，主要分布于中國內(nèi)蒙古、河北、山西、黑龍江等[1]。其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，香味濃郁，肉質(zhì)滑嫩，深受消費(fèi)者喜愛，一直是國內(nèi)熱銷的野生食用菌產(chǎn)品之一，目前沒有人工馴化成功的報(bào)道。近年來由于人們過度采收，生態(tài)環(huán)境遭到破壞，自然生長的楊樹口蘑產(chǎn)量逐年降低。因此，保護(hù)野生楊口蘑資源以及進(jìn)行楊樹口蘑的人工馴化栽培已經(jīng)迫在眉睫。楊樹口蘑市場價(jià)格鮮菇20元/kg，價(jià)格和野生紅菇相當(dāng)，一旦栽培成功，市場前景廣闊。通過介紹楊樹口蘑的菌種分離和馴化技術(shù)，以期為實(shí)現(xiàn)楊樹口蘑的大規(guī)模人工栽培奠定基礎(chǔ)。

1 楊樹口蘑采集

秋季8月～10月雨后，在遼寧省朝陽縣、內(nèi)蒙古自治區(qū)敖漢等地楊樹林中采集到野生楊樹口蘑，見圖1（圖片由趙英同提供）。

如圖1所示，楊樹口蘑叢生，因此當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)子實(shí)體后就能夠判斷附近還有多個(gè)子實(shí)體存在，與其相鄰的地方有時(shí)候也有。這種生長現(xiàn)象被稱為“蘑菇盤”，今年采摘后，第2年在相同的方依舊會有子實(shí)體生長。

圖1 楊樹林與楊樹口蘑Fig.1 Populus L.forest and Tricholoma populinum

2 菌種分離與純化

2.1 培養(yǎng)基

PDA楊樹葉培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、楊樹葉100 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g～20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL。將土豆、楊樹葉用小火煮沸30 min，然后用6層紗布過濾。加入其他成分繼續(xù)加熱并攪拌至全部溶化后，停止加熱，補(bǔ)足水分。將培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶中，每瓶裝200 mL，115℃滅菌30 min后，在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入平皿中（每個(gè)平皿約20 mL），冷卻備用。

2.2 組織分離

從采集的楊樹口蘑子實(shí)體樣品中，選擇長勢好、菇形完整、中等偏大、肉厚、孢子未彈射、無病蟲害的子實(shí)體，在無菌環(huán)境進(jìn)行組織分離，見圖2。

圖2 楊樹口蘑子實(shí)體組織分離Fig.2 Isolation of fruiting body tissue of Tricholoma populinum

如圖2所示，子實(shí)體表面用75%酒精棉球擦拭消毒，然后放在滅好菌的平皿中。用手術(shù)刀切開子實(shí)體，在菌蓋或菌柄內(nèi)側(cè)用無菌手術(shù)刀或尖嘴鑷子取1 cm見方組織塊接于培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上，然后用封口膜封口。

由于楊樹口蘑的菌種分離難度較大，在組織分離過程中，一定要選好目標(biāo)子實(shí)體。有蟲害、含水量過高、老化的菇體都不應(yīng)選用，否則組織分離很難成功。最好選用菇體未開傘的幼菇，生命力強(qiáng)不易感染雜菌。

2.3 培養(yǎng)

將培養(yǎng)皿放入溫箱22℃恒溫培養(yǎng)，5d～7d后組織塊萌發(fā)。待菌落長到約2cm，用接種針選取最優(yōu)菌落的尖端菌絲接入新培養(yǎng)基上，進(jìn)行尖端脫毒，見圖3。

圖3 斷橋法純化Fig.3 Bridge breaking purification

如圖3所示，在無菌條件下，采用斷橋脫毒法用接種針把平皿培養(yǎng)基中間培養(yǎng)基斷開1 cm，把菌種接在斷開培養(yǎng)基一側(cè)，菌絲穿越斷開處，伸入前端的培養(yǎng)基上，可以純化菌種。將純化的楊樹口蘑菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上，放入22℃恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，12 d～15 d后得到楊樹口蘑純化菌種。

在培養(yǎng)基的選擇上除采用PDA楊樹葉培養(yǎng)基外，還可采用楊樹葉培養(yǎng)基（楊樹葉80%、麩皮18%、糖1%、石膏1%），見圖4。

圖4 楊樹葉培養(yǎng)基接種Fig.4 Poplar leaf culture medium inoculation

如圖4所示，具體方法是將組織塊接入瓶中楊樹葉培養(yǎng)基中或平皿中楊樹葉培養(yǎng)基中，采用這種方法組織塊也可萌發(fā)生長。

2.4 菌絲微觀形態(tài)觀察

插片培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室觀察真菌形態(tài)的一種基本方法。用干凈的鑷子，將無菌的蓋玻片以45°的角度斜插入培養(yǎng)基中，插片位置與接種塊之間距離一般為1.0 cm～1.5 cm，見圖5。

圖5 插片法Fig.5 Insertion method

如圖5所示，待菌絲鋪展開來，長過插片的位置后，即可取出玻片進(jìn)行觀察，見圖6。

圖6 楊樹口蘑菌絲Fig.6 Hyphae of Tricholoma populinum

如圖6所示，菌絲粗壯、豐滿、均勻，并具有鎖狀聯(lián)合。

3 液體菌種的制作

3.1 培養(yǎng)基配方

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀2.0 g、硫酸鎂1.0 g、維生素B11片，pH 6.8～7.0，水 1 000 mL。

3.2 培養(yǎng)基制作

將土豆用小火煮沸30 min（標(biāo)準(zhǔn)為熟而不爛），然后用6層紗布過濾，將濾液倒入鍋內(nèi)，同時(shí)加入按配方稱好的各種成分，繼續(xù)加熱并攪拌至全部溶化后，停止加熱，補(bǔ)足水分。將培養(yǎng)液分裝入三角瓶中，500 mL錐形瓶內(nèi)裝150 mL培養(yǎng)液，每瓶加10個(gè)玻璃珠，然后用12層紗布外加一層牛皮紙封口。

將三角瓶放入滅菌鍋，上面蓋上報(bào)紙，排氣后，待溫度升至121℃開始計(jì)時(shí)，維持30 min。降壓排氣后，打開鍋蓋冷卻到30℃以下時(shí)取出三角瓶放在超凈工作臺中冷卻。

3.3 接種與培養(yǎng)

選取新培養(yǎng)好的試管斜面菌種1支，在無菌條件下每瓶液體培養(yǎng)基接入2 cm2～3 cm2的母種1塊，每支母種可接5個(gè)搖瓶。接種好的菌種瓶可置于搖床上培養(yǎng)，也可置于22℃恒溫下靜置培養(yǎng)出48 h后，在確保無雜菌且氣生菌絲延伸到培養(yǎng)液中時(shí)再放在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。搖床頻率為180 r·min-1，培養(yǎng)溫度22℃，一般培養(yǎng)7 d～8 d，見圖7。

圖7 楊樹口蘑液體菌種Fig.7 Liquid strain of Tricheloma popalnum

如圖7所示，a為培養(yǎng)中的液體菌種，b為結(jié)束培養(yǎng)的液體菌種。當(dāng)菌絲球均勻地布滿透明的橙黃色營養(yǎng)液中時(shí)停止培養(yǎng)。

4 栽培袋制作與接種

4.1 栽培袋配方

配方1：楊樹木屑78%、麩皮20%、糖1%、石膏 1%，pH 6.5～7.0，含水量 60%～65%。

配方2：楊樹葉78%、麩皮20%、糖1%、石膏1%，pH 6.5～7.0，含水量60%～65%。

4.2 裝袋、滅菌

選17 cm×33 cm×0.005 cm聚丙烯塑料袋，裝袋后袋中間用直徑2 cm木棍打孔到袋底，然后加雙套環(huán)。采用高壓滅菌126℃持續(xù)1 h。

4.3 接菌與培養(yǎng)。

在無菌條件下，每個(gè)栽培袋接入液體菌種50 mL，放入培養(yǎng)室，22℃條件下弱光培養(yǎng)。接種后菌絲生長過程見圖8。

如圖8所示，當(dāng)基質(zhì)內(nèi)布滿菌絲，菌絲具有楊樹菇特有的香味，即可結(jié)束培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，配方1由于楊樹木屑透氣性差，菌絲生長較慢，而配方2透氣好，菌絲生長速度快。一般情況下楊樹木屑培養(yǎng)基長滿需要35 d～40 d，楊樹葉培養(yǎng)基25 d～30 d即可長滿。為提高栽培袋中菌絲生長速度，也可采用窩口方式制作栽培袋，見圖9。

圖8 栽培袋菌絲生長過程Fig.8 Mycelial growth process of cultivation bag

圖9 窩口法制作栽培袋Fig.9 Making cultivation bags by nest-mouth method

如圖9所示，具體方式為裝制菌包時(shí)，裝袋機(jī)在菌包袋的中間留孔，將菌包培養(yǎng)料上面的塑料袋塞入菌包中間的孔中，然后將周轉(zhuǎn)棒插入中間的孔中，倒置于筐中準(zhǔn)備滅菌。這種方式可以使液體菌種直接接入袋內(nèi)，菌絲從菌袋中部萌發(fā)并向四周輻射生長，可以縮短菌袋培養(yǎng)周期。

5 室內(nèi)覆土栽培

將培養(yǎng)好的菌袋脫袋后，放入菌種筐內(nèi)，并將菌種脫袋、裝筐、壓實(shí)、覆土，詳見圖10。

圖10 覆土過程Fig.10 Process of soil covering

如圖10所示，為了增加透氣性，菌種筐底部放2層報(bào)紙或遮陽網(wǎng)。采用楊樹林的土為覆土原料，暴曬2 d后，加入稻殼5%、石灰2%、過磷酸鈣1%，并噴水使土含水量達(dá)到20%（即手握成團(tuán)、落地即散、手掰土粒不見白為好）。將調(diào)好水的土壤均勻地撒在料面上，覆土厚度為3 cm，進(jìn)行出菇管理。使溫室保持在20℃，空氣相對濕度保持在60%～70%，保持室內(nèi)空氣新鮮。菌絲生長情況見圖11。

圖11 菌絲長出土面Fig.11 The hyphae grow out of the earth

如圖11所示，菌絲5 d～7 d可長出土層表面，為了保持料面濕度，在土層表面覆蓋一層楊樹葉，保濕效果較好。之后進(jìn)行催菇管理，加大溫差，使溫度保持在15℃～22℃，早晚溫差達(dá)到7℃～8℃，濕度保持在80%～90%，菌絲生長情況見圖12。

如圖12所示，一般菌絲長至土層表面后10 d～15 d可見菌絲扭結(jié)、變粗，約20 d～25 d菌絲扭結(jié)形成子實(shí)體原基形狀。

圖12 出菇管理過程中菌絲生長情況Fig.12 Mycelium growth during fruiting management

6 楊樹林返生栽培試驗(yàn)

選擇地形平整、正在生長的楊樹林，于8月初在楊樹根部挖30 cm深穴，將生長好的楊樹口蘑菌種運(yùn)到楊樹林，脫袋后將菌種放穴內(nèi)，踩實(shí)掩埋，并少量淋水，見圖13（圖片由趙英同提供）。

圖13 楊樹林栽培試驗(yàn)Fig.13 Cultivation experiment in Populus L.forest

如圖13所示，在出菇管理上主要參照野外環(huán)境進(jìn)行出菇管理，在管理中雖能少量出菇，但受自然條件影響太大，效果并不理想。

7 結(jié)論

進(jìn)行了楊樹口蘑采集、菌種分離和馴化研究，主要進(jìn)行了室內(nèi)栽培實(shí)驗(yàn)。在室內(nèi)栽培過程中，采用楊樹葉、楊樹木屑為基本原料進(jìn)行栽培袋的制作；采用楊樹林的土壤和楊樹葉為覆蓋材料，進(jìn)行覆土栽培，并進(jìn)行出菇管理，菌絲爬土后能扭結(jié)變粗，形成類似子實(shí)體原基的形狀。雖然未形成子實(shí)體，但為子實(shí)體形成提供了有益探索。將來計(jì)劃用楊樹葉、楊樹木屑、楊樹林土壤為主要基質(zhì)，采用發(fā)酵料和熟料等多種方式，以楊樹林的土為主要覆土原料進(jìn)行進(jìn)一步的馴化栽培試驗(yàn)，爭取在楊樹口蘑馴化中有重大突破。