環(huán)狀RNA在眼科疾病中的研究進(jìn)展

束 煉，陳曉曉，孫興懷,3

0引言

環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)屬于非編碼RNA家族(non-coding RNA，ncRNA)，是一類具有共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA，一般認(rèn)為它是通過前體RNA的反向剪接反應(yīng)形成的，即內(nèi)含子下游5’剪接位點(diǎn)以相反的順序與上游3’剪接位點(diǎn)連接形成環(huán)狀，并在反向剪接的外顯子之間形成3’，5’-磷酸二酯鍵[1]。近十年來全基因組檢測等深度測序技術(shù)不斷發(fā)展，RNA干擾(RNA interference，RNAi)、RNA免疫沉淀芯片(RNA immunoprecipitation chip，RIP)分析以及質(zhì)?；蛳俨《巨D(zhuǎn)染等功能學(xué)檢測及驗(yàn)證手段愈發(fā)成熟，為研究ncRNA提供了很好的技術(shù)支持，circRNA也逐漸進(jìn)入研究熱潮。circRNA的主要作用機(jī)制主要包括：(1)通過“海綿樣”吸附下游靶基因miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，起競爭性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)的作用，從而阻止miRNA和信使RNA(messenger RNA，mRNA)之間的相互作用，間接調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)水平，這也是circRNA在目前研究中最廣泛和關(guān)鍵的作用[2]；(2)競爭性結(jié)合蛋白質(zhì)并影響其活性；(3)作為蛋白質(zhì)復(fù)合體的腳手架，并在親本基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用等。已有研究證明，circRNA 可以參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移調(diào)控等，其在腫瘤性疾病、血管性疾病、炎癥性疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用[3]。

在眼科疾病中circRNA的相關(guān)研究也已陸續(xù)展開[4]，本文就circRNA在青光眼、視網(wǎng)膜疾病(如糖尿病性視網(wǎng)膜病變等)、晶狀體疾病(如年齡相關(guān)性白內(nèi)障等)、眼表及眼眶疾病(如翼狀胬肉、甲狀腺相關(guān)眼病等)和葡萄膜疾病(如葡萄膜黑色素瘤)等眼科疾病中的基礎(chǔ)研究和臨床發(fā)現(xiàn)進(jìn)行綜述。

1青光眼

青光眼是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡、視盤損傷及視功能損害，常伴隨病理性眼壓升高，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓誘導(dǎo)的青光眼小鼠模型的視網(wǎng)膜以及原發(fā)性開角型青光眼患者的房水中均可檢測到cZRANB1表達(dá)的顯著上升。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)cZRANB1可充當(dāng)miRNA海綿，通過cZRANB1/miR-217/RUNX2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)直接調(diào)控視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞—Müller細(xì)胞功能，從而間接調(diào)控RGCs功能。由此顯示cZRANB1可通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)活化和影響RGCs的活性，進(jìn)而參與青光眼引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性改變。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)cZNF609也具有相似的作用機(jī)制[6]，由此提出對這些circRNA進(jìn)行表達(dá)干預(yù)可能成為治療青光眼引起的視神經(jīng)退行性改變的有效策略。

2視網(wǎng)膜疾病

2.1缺血性視網(wǎng)膜病變?nèi)毖砸暰W(wǎng)膜病變的基本病理特征是血管閉塞伴隨視網(wǎng)膜新生血管生成，代表性疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)等。

已有多項(xiàng)研究表明，與無眼底病變的糖尿病患者相比，circRNA在DR患者的血清或玻璃體液中存在差異表達(dá)[7-9]，并且可能參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的生物學(xué)功能。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Circ_0005015(CircBase ID：cHAS2)在DR患者的血漿、玻璃體液和血管纖維膜中表達(dá)上調(diào)。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，Circ_0005015可充當(dāng)miR-519d-3p海綿，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)等基因表達(dá)增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管來促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成，進(jìn)而誘導(dǎo)DR的產(chǎn)生。在Zhu等[11]和Liu等[12]的研究中,circDNMT3B/miR-20b-5p及cZNF609/miR-615-5p/MEF2A網(wǎng)絡(luò)也同樣可調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞功能改變和血管生成進(jìn)而參與DR的形成。Jiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，cZNF532可通過充當(dāng)miR-29a-3p海綿并誘導(dǎo)賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)等基因表達(dá)來調(diào)節(jié)周細(xì)胞生物功能，參與調(diào)控DR中的視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙。而Sun等[13]的研究顯示，hsa_circ_0041795(CircBase ID：cC17)在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，該circRNA對下游炎癥相關(guān)因子(如TNF-α，IL-1β和IL-6等)的表達(dá)調(diào)控可能在DR中發(fā)揮重要作用。

Zhou等[14]在高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變鼠模型中鑒定出共236種差異表達(dá)的circRNA和14種差異表達(dá)的miRNA，同時(shí)通過逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR驗(yàn)證了其中9個(gè)差異表達(dá)的circRNA，為ROP發(fā)生機(jī)制的研究提供了方向指導(dǎo)。

2.2年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達(dá)國家老年人致盲的主要原因[15]，脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是其重要的病理表現(xiàn)和突出特征。CNV可導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、滲出、出血和視網(wǎng)膜功能障礙，直接導(dǎo)致視力下降[16]，但CNV的形成機(jī)制認(rèn)識尚未完全統(tǒng)一。在Liu等[17]的研究 中，CNV小鼠模型的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合物中的100個(gè)circRNA與對照組相比有顯著改變。另有研究表明激光誘導(dǎo)的CNV小鼠的脈絡(luò)膜和內(nèi)皮細(xì)胞中的cZBTB44在缺氧應(yīng)激時(shí)明顯上調(diào)[18]，后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)cZBTB44與其靶點(diǎn)miR-578相互作用，調(diào)控下游血管內(nèi)皮生長因子VEGFA/VCAM1基因的表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并參與CNV的發(fā)生發(fā)展，而在ARMD患者的房水中檢測到cZBTB44表達(dá)的顯著上調(diào)也印證了這一機(jī)制。該研究提示cZBTB44調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是參與CNV相關(guān)的ARMD形成的潛在發(fā)病機(jī)制。

2.3增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是指在孔源性視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)后，由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生和收縮又造成視網(wǎng)膜脫離的病變[19]，可能與細(xì)胞和膜的遷移增殖、胞外膠原蛋白生成以及視網(wǎng)膜前膜(epiretinal membrane，ERM)形成有關(guān)[20]。Yao等[21]鑒定出91個(gè)在PVR患者的ERM中差異表達(dá)的circRNA，其中上調(diào)最為顯著的circ_0043144(CircBase ID：cCCL3)在PVR-ERM患者的玻璃體樣本和血清樣本中檢測出了同等變化。隨后功能實(shí)驗(yàn)測定表明，circ_0043144通過調(diào)控下游趨化因子CCL2、CXCL8和內(nèi)皮生長因子VEGFA等基因表達(dá)從而調(diào)控視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖，遷移和分泌能力，顯示出circ_0043144參與PVR形成的可能機(jī)制，但該研究未對中間調(diào)控介質(zhì)miRNA相關(guān)靶點(diǎn)作進(jìn)一步探究。

2.4視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是最常見的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤[22]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變異、蛋白質(zhì)磷酸化和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種機(jī)制[23-24]。有研究報(bào)道，與正常視網(wǎng)膜相比RB組織樣本中circRNA的豐度和表達(dá)均顯著降低，進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析顯示這些差異表達(dá)的circRNA其宿主基因主要參與染色質(zhì)修飾和磷酸化[25]。其中circ_0093996(CircBase ID：cTET1)/miR-183/PDCD4調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能參與RB的形成。還有報(bào)道顯示circ_0000527(CircBase ID：cFAM158A)可通過發(fā)揮海綿作用，吸附miR-646從而間接調(diào)節(jié)BCL-2蛋白基因來促進(jìn)RB的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。Xing等[27]研究發(fā)現(xiàn)，RB組織和細(xì)胞中的circRNA的下調(diào)表達(dá)程度與RB患者的腫瘤大小及晚期(國際眼內(nèi)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分級，international intraocular retinoblastoma classification，IIRC)分級有關(guān)，其中hsa_circ_0001649可以作為RB患者整體生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。Zhao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，circ-0075804(CircBase ID：cE2F2)可以通過與HNRNPK結(jié)合來提高E2F3的穩(wěn)定性來促進(jìn)RB的增殖。這些研究都顯示出circRNA可能通過各種復(fù)雜機(jī)制實(shí)現(xiàn)參與RB的發(fā)生發(fā)展。

3眼表及眼眶疾病

3.1角膜新生血管角膜本身無血管，但許多免疫性、創(chuàng)傷性或感染性的眼表疾病均可導(dǎo)致角膜新生血管形成。角膜新生血管可使角膜透明性降低，使視力下降甚至失明，但其形成機(jī)制尚未完全了解。Zhou 等[29]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠誘導(dǎo)角膜新生血管模型中無血管角膜和血管化角膜間存在229個(gè)差異表達(dá)的circRNA。同時(shí)在存在血管化的人角膜中cZFP609的直系同源物顯著增加，而其下游cKifap3基因可以提升角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力，提示circRNA-cKifap3可作為治療角膜新生血管的靶點(diǎn)。

3.2結(jié)膜黑色素瘤結(jié)膜黑色素瘤是一種罕見的高度惡性的眼部腫瘤，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不清楚。Shang等[30]發(fā)現(xiàn)，相較于臨近正常組織，結(jié)膜黑色素瘤組織中可鑒定出9300種差異circRNA，其中circMTUS1在結(jié)膜黑色素瘤中表達(dá)明顯上調(diào)。后續(xù)研究提示circMTUS1可能通過海綿樣吸附miR-622和miR-1208調(diào)節(jié)ErbB、MAPK等信號通路以發(fā)揮原癌基因的作用，促進(jìn)結(jié)膜黑色素瘤的發(fā)展。因此提出circMTUS1可能是結(jié)膜黑色素瘤的新型生物標(biāo)志物。

3.3翼狀胬肉翼狀胬肉是結(jié)膜的慢性炎癥性病變，是一種常見的眼表疾病，可能與異常細(xì)胞增殖、傷口愈合缺陷、基質(zhì)異常重塑、血管生成和氧化應(yīng)激等機(jī)制有關(guān)[31]。Li等[32]發(fā)現(xiàn)和正常結(jié)膜組織進(jìn)行配對分析時(shí)翼狀胬肉組織中約有669個(gè)circRNA異常表達(dá)，其中circ_0085020(CircBase ID：cLAPTM4B)上調(diào)最為明顯。實(shí)驗(yàn)證明對circ_0085020的沉默抑制了成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時(shí)促進(jìn)了紫外線輻射誘導(dǎo)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circ_0085020介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)大部分集中在黏著斑信號通路中，由此推測胞質(zhì)內(nèi)circRNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，進(jìn)而調(diào)控翼狀胬肉的形成。

3.4甲狀腺相關(guān)眼病甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)是Graves病患者的眼部表現(xiàn)，其眼外肌和眼眶脂肪或結(jié)締組織中可發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的浸潤。TAO被認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，但其發(fā)病機(jī)制未被完全揭示。Wu等[33]在其研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組的眼眶脂肪和結(jié)締組織相比，TAO患者差異表達(dá)了163個(gè)circRNA。其中circ_14940(CircBase ID：cEYA1)，circ_10135及circ_14936可能通過影響脂肪形成以及B細(xì)胞免疫激活等方式參與TAO的形成。

4晶狀體疾病

4.1年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體蛋白質(zhì)變性并發(fā)生混濁稱為白內(nèi)障，以老年人居多。其特征是不溶性晶狀體蛋白的積累、細(xì)胞凋亡增加和晶狀體上皮細(xì)胞增殖分化改變等[34-35]，已成為現(xiàn)今非創(chuàng)傷性視力損害和失明第一大原因[35]。Liu等[36]通過RNA測序技術(shù)在人正常透明晶狀體囊和年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體囊中鑒定出差異表達(dá)的101個(gè)circRNA，其中circ-HIPK3通過對miR-193a的海綿吸附作用影響下游晶狀體蛋白基因CRYAA的表達(dá)，由此揭示出circ-HIPK3在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成和發(fā)展中發(fā)揮的作用機(jī)制。

4.2代謝性白內(nèi)障與非糖尿病患者相比，糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)病年齡較早，并且發(fā)展速度更快，這可能與糖尿病性白內(nèi)障晶狀體抗氧化能力受損，以及高血糖癥誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的異常增殖、凋亡和自噬相關(guān)[37]，但確切發(fā)病機(jī)制未知。Fan等[38]在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體組織和透明晶狀體組織中分析circRNA表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)1063個(gè)circRNA顯著差異表達(dá)，其中circ-KMT2E的上調(diào)可能發(fā)揮結(jié)合miR-204-5p的海綿作用參與糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病，但完整的調(diào)控通路仍需進(jìn)一步的機(jī)制研究。

5葡萄膜疾病

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)是成人最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，預(yù)后較差且可早期轉(zhuǎn)移[39]，嚴(yán)重威脅患者的視力乃至生命，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。Yang等[40]使用微陣列分析評估了UM組織和正常葡萄膜組織中的circRNA表達(dá)譜，共鑒定出50579個(gè)失調(diào)的circRNA。作者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其下游分子與WNT，PI3K/Akt，Hippo等20余條癌癥相關(guān)信號通路相關(guān)，并篩選出可能與UM發(fā)病機(jī)制相關(guān)circRNA-miRNA軸，但未進(jìn)行更深入的研究。

6總結(jié)與展望

隨著深度測序等分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及對circRNA研究的不斷深入[41]， circRNA在眼科疾病中發(fā)揮的功能也不斷受到重視[4]。本文綜述了在青光眼、視網(wǎng)膜疾病、晶狀體疾病、眼表及眼眶疾病、葡萄膜疾病等眼科疾病的發(fā)生發(fā)展過程中circRNA發(fā)揮的重要作用。目前circRNA在眼科領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)主要集中在血管相關(guān)疾病(如視網(wǎng)膜新生血管、角膜新生血管等)或腫瘤相關(guān)疾病上，這與circRNA在既往研究中的功能發(fā)現(xiàn)相一致[42-44]，也反映出circRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其功能機(jī)制的復(fù)雜性、廣泛性和多樣性。對包括眼科疾病在內(nèi)的多種疾病的circRNA譜系分析，以及對circRNA生物學(xué)功能和潛在作用機(jī)制的進(jìn)一步探索，依然會是當(dāng)下基礎(chǔ)性研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。文章中參與相關(guān)疾病形成且研究較為深入的circRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)制匯總見表1。

表1 不同眼科疾病中circRNA的差異表達(dá)和分子機(jī)制

同時(shí)，在眼科疾病中circRNA的基礎(chǔ)性研究仍存在一定的不足:(1)不同眼科疾病中鑒定出的circRNA表達(dá)豐度，以及同一疾病下不同樣本之間鑒定出的circRNA種類差異均較大，這可能與不同的測序技術(shù)及來源組織有關(guān)，因此高穩(wěn)定性的測序技術(shù)以及縝密的功能學(xué)驗(yàn)證依然是當(dāng)下circRNA相關(guān)研究的基本要求[41]。(2)眼科領(lǐng)域中大多數(shù)機(jī)制研究僅基于circRNA的海綿效應(yīng)及其與miRNA相互作用形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能，但circRNA更多更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制還有待探索，才能夠避免在進(jìn)行目標(biāo)circRNA篩選時(shí)出現(xiàn)遺漏。(3)在多種研究中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)，但未被現(xiàn)有circRNA數(shù)據(jù)庫收錄的新型circRNA，同時(shí)傳統(tǒng)富集分析和下游靶信號預(yù)測等分子生物學(xué)信息也存在一定滯后性，因此circRNA的相關(guān)數(shù)據(jù)庫也亟需更多的基礎(chǔ)性研究并加以更新。

circRNA在各種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，體現(xiàn)出circRNA在眼科疾病中的潛在臨床意義：(1)對circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其下游產(chǎn)物的研究為我們提供了諸多治療靶點(diǎn)，各項(xiàng)研究及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都已證實(shí)靶向上調(diào)或下調(diào)這些關(guān)鍵介質(zhì)，能夠很好地控制疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理特征；(2)由于circRNA的穩(wěn)定性和特異動(dòng)態(tài)表達(dá)[2]，其本身及下游產(chǎn)物可作為眼科疾病未來的生物標(biāo)記物，為眼科疾病的診斷或預(yù)后指導(dǎo)新的方向?？傊?，真正將circRNA應(yīng)用于臨床，還需要我們對circRNA在不同眼科疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，以及對circRNA本身的生物學(xué)功能和特性進(jìn)行更多更深層次的研究。