海洋鏈霉菌?；o酶A硫酯酶基因的克隆及分析

薛永常， 胡泰文

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

放線菌特別是其中的鏈霉菌屬可以產(chǎn)生包括非核糖體肽、脂肪酸、聚酮化合物等次生生理活性物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的抗生素70%來自鏈霉菌家族[1-2]。這些化合物在抗腫瘤、抗菌、酶抑制劑[3-5]等方面發(fā)揮著重要作用。酰基輔酶A硫酯酶(Acyl-CoA thioesterase，ACOT)是催化脂酰輔酶A水解為自由脂肪酸和輔酶A的一類酶，不僅能夠代謝包含?；o酶A的各類化合物，還能代謝不飽和脂肪?；o酶A，在探索新的生物代謝途徑及新藥合成領(lǐng)域有重要意義[6-8]。ACOT大致分為I型或II型兩類，其中Ⅱ型ACOT(ACOT II)對底物脂酰輔酶A具有較高的特異性，決定了ACOT II在脂肪酸合成途徑具有重要的作用，介導(dǎo)了諸如能量產(chǎn)生、溫度調(diào)節(jié)和信號分子合成等多種功能[9]。II型ACOT缺乏或失調(diào)會導(dǎo)致機體脂肪酸代謝紊亂，從而引起如炎癥反應(yīng)、II型糖尿病、脂肪肝、艾滋病[10-12]等一系列疾病。ACOT II基因缺失能導(dǎo)致聚酮 (PK)的產(chǎn)量顯著降低[13]，基因敲除可使鏈霉菌殺假絲菌素的生物合成量下降90%[14]，可導(dǎo)致工程菌AF 1000中的(R)-3-羥基丁酸酯產(chǎn)率降低43%；而ACOTII基因的過表達能使(R)-3-羥基丁酸酯生產(chǎn)率和產(chǎn)量均增加1倍[15]。因此，對鏈霉菌ACOTII基因的研究不僅對探索脂肪酸代謝途徑有重大意義，而且還可為指導(dǎo)疾病治療和藥物研發(fā)提供依據(jù)。本研究利用實驗室保存的具有完整NRPS基因簇的海洋鏈霉菌，通過對其ACOTII基因進行克隆及生物信息學(xué)分析，為以后深入研究其結(jié)構(gòu)與功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋鏈霉菌Streptiomycessp. L1[16]。大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基配置參考文獻[17]。

1.1.3 試劑與儀器 柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司)；FastPure質(zhì)粒提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；T-Vector pMDTM19試劑盒、QuickCutTMBamH I(15 U/μL)、QuickCutTMEcoRI(15 U/μL)、QuickCutTMHind III(15 U/μL)(寶生物工程(大連)有限公司)；DNA Marker DL2000、TaqDNA polymerase(5 U/μL)(天根生化科技(北京)有限公司)Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；PCR Thermal Cycler Dice TP610(日本TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中StreptomycesviridosporusATCC 14672(WP_004991247.1_1)、Streptomycesglaucescens(WP_043498495.1_1)、Streptomycesprasinopilosus(WP_055571148.1_1)及Streptomycesgriseochromogenes(WP_067311017.1_1)等Acyl-CoA thioesterase II基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物。同時在引物的5′端添加BamH I、EcoR I酶切位點，以利于后續(xù)操作：ACOT II MQs：5′-CGGGATCCCGAGGTCAACATCTTCCG-3′，ACOT II MQa：5′-GGAATTCACCACCGACACCAGCAGT-3′。

1.2.2 目的基因擴增及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 以Streptomycessp. L1基因組DNA為模板，以ACOT II MQs和ACOT II MQa為特異引物進行目的基因擴增。擴增體系20 μL：ddH2O 14.6 μL，10× PCR buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1 μL，ACOT II MQa(10 μmol/L)及ACOT II MQs(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA polymerase(2.5 U/μL)0.4 μL，基因組DNA 1 μL。擴增條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 35 s，退火58 ℃ 45 s。延伸72 ℃ 45 s。共35個循環(huán)?；厥漳康臄U增產(chǎn)物與pMDTM19T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有X-gal(20 μg/mL)、IPTG(24 μg/mL)和Amp (50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取白色單菌落，提取重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定及分析 對提取的重組質(zhì)粒進行特異引物PCR、雙酶切及測序鑒定，并用MEGA 6.0和NCBI在線分析工具分析目的基因序列。

1.2.4ACOTII的原核表達 ①A表達載體構(gòu)建：利用QuickCutTMEcoR I和QuickCutTMBamH I對pET32a (+)及構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19T-ACOT II進行雙酶切，回收相應(yīng)目的片段。將回收的ACOTII目的片段與pET32a (+)大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。②目的蛋白誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE分析：分別培養(yǎng)只含pET32a(+)單克隆菌及含有重組子pET32a(+)-ACOT II單克隆菌落。取相應(yīng)的含pET32a(+)菌液作為對照，在含pET32a(+)-ACOT II的菌落培養(yǎng)液中加入適當(dāng)濃度的IPTG，以誘導(dǎo)表達目的蛋白。培養(yǎng)液4 ℃，12 000 r/min離心，菌體沉淀中加入50 μL的2×SDS上樣緩沖液，振蕩懸浮，沸水浴加熱5 min，冰上冷卻3 min，12 000 r/min離心1 min，取適量上清液進行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACOT II目的基因的擴增

以Streptiomycessp. L1基因組DNA為模板，以ACOT II MQs和ACOT II MQa為特異引物，擴增目的ACOTII基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 ACOT II基因擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ACOT II gene fragment M:Trans2K? Plus DNA Marker; 1、2: 擴增的ACOT II產(chǎn)物 M:Trans2K? Plus DNA Marker; 1，2: Amplified products of ACOT II

從圖1可以看出，在800 bp左右出現(xiàn)了單一的清晰條帶，擴增片段大小與預(yù)期的ACOTII基因基本一致，并以此為基礎(chǔ)進行下一步的實驗。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將目的基因片段回收，與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH 5 感受態(tài)細(xì)胞，在含有X-Gal、Amp和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，進行藍白斑篩選。挑選白色陽性單克隆菌落，提取其質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。

圖2 質(zhì)粒DNA電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmid DNA M: Trans2K? Plus DNA Marker; 1、2: 重組質(zhì)粒 M: Trans2K? Plus DNA Marker; 1，2: recombinant plasmid DNA

從圖2可知，在約3 500 bp出現(xiàn)了一條清晰的條帶，為提取質(zhì)粒所呈條帶，和目的質(zhì)粒大小一致，證明可能是需要的重組質(zhì)粒。

以質(zhì)粒DNA為模板，利用特異引物ACOT II MQs和ACOT II MQa進行PCR擴增，結(jié)果見圖3。

圖3 質(zhì)粒DNA中擴增ACOT II基因電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of ACOT II gene from recombinant plasmid DNA M: DNA Marker DL2000; 1: 質(zhì)粒DNA擴增ACOT II基因 M: DNA Marker DL2000; 1: ACOT II fragment amplified from recombinant plasmid

從圖3中可以看出，在約800 bp有一條清晰的條帶，且無雜帶，說明該重組質(zhì)粒含有插入的目的基因片段，且與預(yù)期大小相符。選擇pMD19-T載體含有的EcoR I、Hind III酶切位點，對提取的質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結(jié)果見圖4。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.4 Recombinant plasmid cut by Hind III and EcoR I M: Trans2K? Plus DNA Marker; 1、2: 重組質(zhì)粒Hind III/EcoR I 雙酶切 M: Trans2K? Plus DNA Marker；1，2: recombinant plasmid cut by Hind III and EcoR I

從圖4中可以看出，在約2 800 bp和800 bp左右各出現(xiàn)1條清晰的條帶，大小與pMD19-T 載體及目的片段大小基本相符。將重組質(zhì)粒送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

2.3 目的片段測序及序列分析

測序結(jié)果表明目的片段為786個堿基，大小與預(yù)期值基本相符。該重組質(zhì)粒命名為pMD19T-ACOT II。利用ORF Finder查找ACOTII的開放閱讀框，結(jié)果見圖5。將ACOTII基因的擬翻譯氨基酸序列提交NCBI，在線BLAST進行分析，結(jié)果見圖6、圖7。選取8株與目的基因具有較高同源性的序列，通過MEGA 6.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖8。

同源性分析表明，克隆的基因片段與Acyl-CoA thioesterase II(Unclassified Streptomyces)(sequence ID: WP 069742521.1)相似度達到100%。BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該基因序列中含有一個Hot-Dog superfamily核心結(jié)合區(qū)，屬于熱狗超家族成員。該超家族成員包含II型硫酯酶結(jié)構(gòu)域(圖7)。II型硫酯酶結(jié)構(gòu)域可以通過水解作用去除肽基載體蛋白(PCP)和?；d體蛋白(ACP)域上的乙酰基來啟動模塊化PKS的合成。ACOT II具有一種不對稱的熱狗折疊結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)與PaaI硫酯酶、4-羥基苯甲酰-CoA硫酯酶(4HBT)和β-羥基癸酰-ACP脫水酶中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)相似。因此可以斷定克隆目的基因片段屬于ACOTII。

而系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，不同鏈霉菌中 II型酰基輔酶A硫酯酶基因具有較近的進化關(guān)系，其中ACOTII與StreptomycesviridosporusATCC 14672屬于同一分支，同源性達到99%以上，親緣關(guān)系最近。

圖5 ACOT II基因的ORF Finder結(jié)果Fig.5 The results of ORF Finder of ACOT II gene

圖6 ACOT氨基酸序列比對Fig.6 Alignment of ACOT amino acid sequence

圖7 ACOT II基因的BLAST比對分析圖Fig.7 The analysis of comparison results in BLAST of ACOT II gene

圖8 ACOT II系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 Fig.8 The phylogenetic tree of ACOT II

2.4 ACOT Ⅱ的原核表達與SDS-PAGE分析

將含有pET32a(+)及pET32a(+)-ACOT II的單克隆菌分別進行培養(yǎng)至OD600為0.6。加入IPTG使終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)目的蛋白的表達。每隔1 h取樣，樣品處理后進行SDS-PAGE，結(jié)果見圖9。

圖9 ACOT II擬表達蛋白SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of ACOT II expression M:蛋白Marker；1：無IPTG誘導(dǎo)下的pET32a(+)表達；2：IPTG誘導(dǎo)下的pET32a(+)表達；3：無IPTG誘導(dǎo)下的pET32a(+)-ACOT II表達；4：IPTG誘導(dǎo)1 h的pET32a(+)-ACOT II表達；5：IPTG誘導(dǎo)2 h的pET32a(+)-ACOT II表達；6：IPTG誘導(dǎo)3 h的pET32a(+)-ACOT II表達 M: protein Marker；1: pET32a (+) expression without IPTG induction；2: pET32a (+) expression induced by IPTG； 3: pET32a(+)-ACOT II expression without IPTG induction; 4: pET32a(+)-ACOT II expression induced by IPTG for 1 h；5： pET32a(+)-ACOT II expression induced by IPTG for 2 h；6: pET32a(+)-ACOT II expression induced by IPTG for 3 h

由圖9可知，作為對照的pET32a(+)質(zhì)粒在添加誘導(dǎo)物IPTG前、后，對其本底表達沒有影響。而含有pET32a(+)-ACOT II的菌株，在未加入IPTG時，沒有目的蛋白的表達；在加入IPTG誘導(dǎo)表達1 h后，在37 kD左右出現(xiàn)明顯的條帶，并且隨誘導(dǎo)時間的延長，其表達量會逐漸增加，在誘導(dǎo)3 h時達到最大，說明ACOTII基因在大腸埃希菌BL21(DE3)得以表達。

3 討 論

II型ACOT作為可以廣泛水解硫酯鍵的一類酶，可以裂解支鏈脂肪酸、短鏈和長鏈飽和及不飽和?；鵆oA等多種含CoA的底物，在脂肪酸合成途徑中形成游離的脂酰CoA，在II型ACOT的水解作用下卸載了多余的CoA分子，形成完整的脂肪酸。在PKS途徑中II型ACOT行使水解產(chǎn)物和糾錯功能，即催化反應(yīng)完全的硫酯CoA從PKS上脫落和清除不能被PKS延伸利用的異常硫酯CoA在內(nèi)的中間產(chǎn)物，從而影響了相應(yīng)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，這對次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高提供了基礎(chǔ)。

本研究從海洋鏈霉菌Streptiomycessp. L1基因組擴增獲得ACOTII基因，其與Acyl-CoA thioesterase II (sequence ID：WP 069742521.1)相似性達到100%。BLAST比對發(fā)現(xiàn)，其屬于熱狗超家族成員，并包含一個II型硫酯酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域為ACOT II催化反應(yīng)的特有區(qū)域。在0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，目的基因能表達得到1分子量為37.0 kD左右的蛋白。本研究誘導(dǎo)表達的蛋白與在線分析預(yù)測的理論值略有差別，可能是表達蛋白發(fā)生了一定程度的磷酸化或者糖基化修飾，或者“HotDog”結(jié)構(gòu)域基因與表達載體基因組之間發(fā)生了融合，共表達形成了Rosetta蛋白，從而產(chǎn)生了以熱狗結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)功能和結(jié)構(gòu)的多樣性[18]。這為進一步研究II型硫酯酶的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，為新興藥物和新型抗生素的研發(fā)提供參考。