1株野生羊肚菌鑒定及菌絲培養(yǎng)特性研究

孫靖娥, 李樹江， 張 璐, 黎 羲, 雷 艷, 張曉勇, 楊友聯

(六盤水師范學院 生物科學與技術學院，貴州 六盤水 553004)

羊肚菌是羊肚菌屬真菌的總稱，屬于子囊菌門(Ascomycota)、盤菌綱(Pezizomycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)的稀有可食用大型真菌[1]。羊肚菌又稱“羊肚子”“羊肚菇”等，子實體由菌蓋、菌柄兩部分組成，菌蓋多呈土黃色，近球形、卵形至圓錐形，其上分布有凹凸不平的“坑”，形狀酷似翻開的羊肚而得名。羊肚菌味道鮮美，富含多種人體必需的氨基酸及礦質元素，深受大眾歡迎[2-4]。羊肚菌還含有豐富的真菌多糖，具有緩解疲勞、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化等多種保健功能[5-6]。最早林奈在《植物種志》中就記載和命名了羊肚菌及其變種，但早期學者主要基于羊肚菌子囊果的形態(tài)特征進行分類，如Sesver將羊肚菌屬下劃分為6個種，在此基礎上，Boudier把法國羊肚菌屬劃分為23個種[7]。我國早期學者也基于形態(tài)特征將我國羊肚菌分為小頂羊肚菌、尖頂羊肚菌等8個品種[8]。但后來有研究者發(fā)現，羊肚菌的子囊果形態(tài)及顏色易受到生長環(huán)境的影響，僅僅依靠形態(tài)特征難以鑒別形態(tài)相近的類群[9]。近年來，分子生物學技術快速發(fā)展，羊肚菌分類更加便捷、準確。有研究者采用ITS+LSU+tef1-α+rpb1+rpb2多基因聯合方法對亞洲和北美等地的61份羊肚菌材料進行系統學分類，將其分為黃色羊肚菌支系、黑色羊肚菌支系和變紅羊肚菌支系[10]，為羊肚菌系統分類奠定了堅實基礎。羊肚菌田間馴化栽培受氣候條件影響較大，探索人工可控條件的栽培技術是大勢所趨[11]。目前，羊肚菌屬下有效記錄不多，用于田間馴化栽培的品種較少，尤其是六盤水地區(qū)。本研究對從六盤水地區(qū)采集的1株野生羊肚菌采用形態(tài)學結合多基因(ITS、rpb1、rpb2和tef1-α)序列分析進行鑒定，初步確定其分類地位，并通過設置不同碳源、氮源、碳氮比、溫度和pH值對野生羊肚菌的菌絲體培養(yǎng)條件進行研究，以期為田間馴化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 野生羊肚菌Morel2018008采自六盤水市大河鎮(zhèn)(海拔1 420 m，E104°52′28.56″ N26°40′33.24″)經火燒過的灌木叢中。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，瓊脂15～20 g，硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0～7.0；②PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 儀器與設備 高壓滅菌儀(三洋MLS-3750,深圳市科力易翔儀器設備公司)；潔凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SPX-250B,上?，槴\實驗設備有限公司)；電熱鼓風干燥箱(101-2A，北京科偉永興儀器有限公司)；電子天平(JA4103，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；正置顯微鏡(Olympus BX51，深圳市三昊儀器設備有限公司)；梯度PCR儀(Mastcrcycler Nexus GSX1,昆明倍捷科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 野生羊肚菌的分離純化 采用組織分離法進行野生羊肚菌的分離純化，獲得純菌株(編號：Morel2018008)。將純菌株接種于PDA斜面中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 野生羊肚菌的形態(tài)學鑒定 用直尺測量菌蓋和菌柄大小，并描述顏色和形狀以及菌蓋邊緣是否向外延伸，記錄橫、縱棱紋數量等。切取新鮮菌蓋菌褶制作臨時裝片，以乳酸酚棉蘭染液進行染色后在顯微鏡下對子囊盤、子囊及子囊孢子進行觀察及拍照，并測量單個子囊及子囊孢子大小。

1.2.3 菌株DNA提取與擴增 菌株于PDA平板25 ℃活化培養(yǎng)7 d后，刮取表面菌絲，用十六烷基三甲基溴化銨(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide，CTAB)法,進行菌株DNA提取[12]。擴增的目的序列分別為ITS、rpb1、rpb2和tef1-α四個基因部分序列片段。ITS選用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTACAAG-3′)[13]；rpb1基因選用引物rpb1B-F (5′-AACCGGTATATCACGTYGGTAT-3′)，引物rpb1B-R(5′-GCCTCRAATTGGTTGACRACGT-3′)，rpb2基因選用引物rpb2B-F(5′-TAGGTAG GTCCCAAGAACACC-3′)，引物rpb2B-R(5′-GATACCATGGCGAACATTCTG-3′)[14]，tef1-α基因選用引物ef1-526F(5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′)和ef1-1567R(5′-ACGTRCCRATACCACCRATCTT-3′)[10,15-16]。PCR擴增反應體系(25 μL)：正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板 2 μL。擴增ITS序列程序：94 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。rpb1和rpb2序列PCR反應程序：94 ℃初始變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min[14]。tef1-α序列PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性18 s，54 ℃退火33 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min[10,15-16]。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京擎科生物技術有限公司進行純化和測序。

1.2.4 多基因序列分析 將分離的野生羊肚菌菌株所測得的ITS、rpb1、rpb2和tef1-α序列，采用BioEdit 5.0.6軟件與GenBank中下載的同源性高的基因序列(表1)用MEGA X進行CLASTAI比對，刪除頭尾的空格后用Sequence Matrix 1.7.8進行自動拼接。以Morchellarufobrunnea(菌株號：M-14)為外類群，采用PAUP 4b10軟件以Maximum parsimony法進行分析，以啟發(fā)式搜索法獲取羊肚菌系統發(fā)育樹，分析該菌株分類地位。

表1 參與系統學分析的序列[10,14,16,19]

1.2.5 菌株生物學特性研究 ①試驗設計：最適碳源、氮源、碳氮比、pH篩選。以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別將察氏培養(yǎng)基中的蔗糖以同質量的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和甘油替換，制備不同碳源的培養(yǎng)基；分別將察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉以同質量的硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨和蛋白胨替換，制備不同氮源的培養(yǎng)基。碳氮比培養(yǎng)基參照王壽南等[17]，分別配制C/N值為5/1、10/1、20/1、30/1、40/1、50/1、60/1、70/1培養(yǎng)基。將配制的PDA培養(yǎng)基用HCl或NaOH 分別調節(jié)pH至4、5、6、7、8、9、10，制備不同pH值的培養(yǎng)基。將以上處理的培養(yǎng)基倒平板(平板直徑為9 cm)，每皿10 mL。待平板凝固后，用直徑5 mm的打孔器打取已活化的菌株菌絲邊緣，并分別接種于各個pH值的培養(yǎng)基中，每個處理4次重復。25 ℃培養(yǎng)4 d后，測量菌絲生長直徑(mm)；將菌株接種PDA平板，并分別于5、10、15、20、25、30和35 ℃培養(yǎng)，每個處理4次重復。4 d后測定各個溫度處理下的菌絲生長直徑(mm)，計算菌絲生長速率參照董雪[18]方法，進行最適溫度篩選。②數據處理與分析：生物學特性數據采用Microsoft Excel 2016和DPSv7.05軟件進行數據統計、分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 野生羊肚菌的形態(tài)學鑒定

菌株菌落特征如圖1(B～C)所示。PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)4 d長滿平板，第5天均長出棕黃色的菌核和氣生菌絲。菌落呈輻射狀生長，隨著培養(yǎng)時間延長氣生菌絲密度增大，菌核數量增多，顏色逐漸加深至黃褐色。

圖1 野生羊肚菌形態(tài)學特征Fig.1 Morphological characteristics of wild morel A:野生羊肚菌子實體; B～C:菌株菌落特征，B(正面)，C(反面); D～E:子囊形態(tài); F～G：子囊孢子形態(tài) A: Wild morel fruit body；B-C: Strain colony characteristics, B(Positive side), C (Reverse side); D-E: Ascus morphology；F-G：Ascospore morphology

2.2 野生羊肚菌多基因序列分析

基于野生羊肚菌的ITS+rpb1+rpb2+tef1-α多基因序列，以Morchellarufobrunnea為外類群構建系統發(fā)育樹，如圖2所示，該菌株與羊肚菌黃色支系的Morchellasp. (菌株號：Mes-15)菌株聚為一支，支持率為100%，支長差異極小，表明該菌株屬于羊肚菌黃色支系，與已報道的Mes-15菌株親緣關系最近，可能為同一個種。

2.3 野生羊肚菌生物學特性分析

2.3.1 碳源和氮源 菌株Morel2018008菌絲在不同碳源條件下生長速率差異顯著(圖3A)，在可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲長速最快，達到9.25 mm/d，顯著高于其他碳源處理，其次是蔗糖為碳源。說明該菌株最適碳源為可溶性淀粉。不同氮源對菌株Morel2018008菌絲生長速率的影響達到顯著水平(圖3B)，在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上菌絲長速最快，達到9.13 mm/d，顯著高于其他氮源處理，其次是硝酸鈉和蛋白胨處理。表明硝酸鉀為該菌株菌絲生長的最適氮源。

圖2 基于ITS+rpb1+rpb2+tef1-α多基因序列以最大簡約法分析得出的羊肚菌系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of wild morel based on ITS+ rpb1+rpb2+tef1-α multigene sequence analysis by maximum parsimony method

圖3 野生羊肚菌在不同碳源(A)、氮源(B)培養(yǎng)基上的生長速率Fig.3 Growth rate of strain Morel2018008 on different carbon(A) and nitrogen(B) sources a、b、c、d：分別代表野生羊肚菌在不同碳源、氮源培養(yǎng)基上的生長速率差異性，不同字母表示差異顯著 a，b，c，d：Respectively represent the difference in the growth rate of wild morels on different carbon sources and nitrogen sources, and different letters indicate significant differences

2.3.2 碳氮比(C/N) 不同碳氮比的培養(yǎng)基對菌株Morel2018008的菌絲長速影響顯著(圖4A)。在設置的范圍內，菌絲整體生長速率隨培養(yǎng)基碳氮比增大而顯著降低。菌絲生長速率在C/N 5/1～20/1的處理下達到最大，且3個處理間差異不顯著。說明該株野生羊肚菌生長最適C/N范圍為5/1～20/1之間。在C/N為10/1時生長速率達到最大，但差異不顯著。

2.3.3 菌絲生長溫度和pH值 不同溫度處理下菌株Morel2018008的菌絲長速差異顯著(圖4B)，20～30 ℃菌絲長速較快，20 ℃和25 ℃達到9.25 mm/d，生長最快。不同pH值對野生羊肚菌菌絲生長速率的影響如圖4C所示。pH值5～9時，菌絲生長速率較快，在該pH值范圍內差異不顯著，其中pH 7時菌絲生長最好。表明該菌株菌絲生長的最適溫度為20～25 ℃，最適pH值為5～9。

圖4 野生羊肚菌在不同碳氮比(C/N)(A)、溫度(B)、pH(C)培養(yǎng)基上的生長速率Fig.4 Growth rate of wild strain Morel2018008 on medium with C/N ratio(A), different temperature(B) and pH(C) a、b、c、d：分別代表野生羊肚菌在不同碳氮比、溫度、pH培養(yǎng)基上的生長速率差異性，具有相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著 a，b，c，d：Respectively represent the difference in the growth rate of wild Morchella on different carbon-nitrogen ratio, temperature and pH medium. The same letter indicates that the difference is not significant, and different letters indicate significant difference

3 討 論

近年來，通過形態(tài)學結合多基因系統學鑒定羊肚菌可以得到較為準確的結果。O′Donnell等[10]采用ITS+LSU+tef1-α+rpb1+rpb2多基因聯合分析61份羊肚菌材料，可將其分為3個支系(黃色羊肚菌支系、黑色羊肚菌支系和變紅羊肚菌支系)。通過多基因序列聯合分析，本研究中的菌株Morel2018008與黃色羊肚菌支系的Morchellasp.(菌株號：Mes-15)以100%的高支持率聚為1支。但其子囊果與已報道的菌株Mes-15代表的子囊果形態(tài)差異較大，后者子囊果的菌蓋呈棕黃色，其上分布明顯且規(guī)則的橫縱棱紋，菌柄米白色，略光滑，無明顯的皺褶[14]，本研究中羊肚菌子囊果的菌蓋顏色較淺，無明顯橫棱紋，但菌柄不光滑，有顯著縱向皺褶。Yang等[9]認為羊肚菌的子囊果形態(tài)及顏色容易受到生境的影響，僅靠子囊果形態(tài)特征難以識別相近的類群。由此可見，羊肚菌屬內各個種的基因型相同，但表型可能存在差異。據此，本研究的野生羊肚菌與菌株Mes-15代表的黃色羊肚菌支系可能為同一個種，菌株Mes-15基因序列偶聯的文字也沒有對其命名。

國內菌物學者對羊肚菌生物學特性研究較多。碳源、氮源是羊肚菌菌絲生長必不可少的營養(yǎng)元素，并能積累在羊肚菌子實體中[20]。朱永真[4]和韓鵬等[21]對羊肚菌菌絲碳源營養(yǎng)特性研究顯示，最適碳源多集中在可溶性淀粉、蔗糖等，本研究最適碳源為可溶性淀粉，其次為蔗糖，研究結果與其相似。但是范冬茹等[22]近年報道粗柄羊肚菌最適碳源為葡萄糖，不同種類羊肚菌碳源利用存在較大差異。朱永真[4]、韓鵬等[21]和柴林山等[23]研究表明，不同種類羊肚菌最適氮源多集中在尿素、蛋白胨、硝酸鉀等，本研究最適氮源為硝酸鉀，與其他氮源處理達到顯著性差異，與前人研究存在一定差異。最適碳源和氮源有利于菌絲生長，但兩者的最適比例對菌絲生長影響較大。如劉士旺等[24]研究表明尖頂羊肚菌最適碳氮比為35/1。而和曉娜[25]研究四種不同羊肚菌的碳氮比揭示最適碳氮比為25/1。陶熱等[26]報道，小羊肚菌最適碳氮比為20/1。本研究中最適碳氮比為5/1～20/1。由此可見，羊肚菌屬各個種的最適碳氮比存在一定差異。

韓鵬等[21]研究兩種野生羊肚菌發(fā)現，最適pH均為8。和曉娜[25]研究四種羊肚菌表明不同羊肚菌的適宜pH為6～7。本研究顯示，菌株菌絲生長在pH 5～9之間差異極小，pH 7時菌絲生長最快最好。

羊肚菌是一種在我國廣泛分布的低溫性藥食兼用真菌。李巖龍[27]研究表明梯棱羊肚菌M6613菌絲最適生長溫度為20 ℃；謝放等[28]報道了7種羊肚菌的最適生長溫度為25 ℃；韓鵬等[21]研究表明兩株羊肚菌最適生長溫度為24 ℃。本研究發(fā)現20～30 ℃有利于菌株菌絲生長，20～25 ℃生長最快，達到顯著水平，為最適生長溫度范圍。