紅曲霉繁殖相關(guān)wetM基因的克隆與生物信息學(xué)分析

王炫棟， 楊孫玉悅， 胡凌鳴， 何智鵬， 丁允章， 蔣冬花

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

紅曲霉(Monascusspp.)是我國(guó)歷史悠久的真菌資源，在許多方面都有非常廣泛的應(yīng)用[1-2]。探究紅曲霉的繁殖機(jī)制能夠更好地調(diào)控紅曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育。紅曲霉繁殖過(guò)程中的子囊孢子和分生孢子在工業(yè)、食品業(yè)和基礎(chǔ)研究中都有重要意義[3]。在工業(yè)上調(diào)控孢子產(chǎn)生數(shù)量可降低生產(chǎn)成本，控制污染。在食品業(yè)中，孢子的數(shù)量與次級(jí)代謝產(chǎn)物[4-5]的產(chǎn)量息息相關(guān)。在醫(yī)學(xué)上，孢子是致病真菌散播的主要方式。因此，利用生物信息學(xué)探明紅曲霉繁殖機(jī)制中相關(guān)基因的功能在各個(gè)方面都具有重要意義。在模式絲狀真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中已經(jīng)探明與繁殖相關(guān)的基因有brlA、wetA、abaA等，其相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族也已有較多的研究[6-9]。但紅曲霉中的繁殖調(diào)控路線和眾多基因還不明確。本研究在紅曲霉中發(fā)現(xiàn)了與構(gòu)巢曲霉孢子發(fā)育相關(guān)的wetA(wet-white “濕-白樣”)有較高同源性的基因，推測(cè)這個(gè)基因可能與紅曲霉繁殖相關(guān)，命名為wetM(wet-white Monascus)基因。從紅曲霉中首次克隆出wetM基因，并對(duì)此基因進(jìn)行測(cè)序、基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄蛋白生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)功能的預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從紅曲米中篩選純化保藏的紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)Mp-21菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[10]。

1.2 方法

1.2.1 紫色紅曲霉菌株Mp-21活化 將保藏管Mp-21菌株的適量菌絲接種至PDA平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后,將菌落中的新生菌絲接種至新的培養(yǎng)基中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)3次[11]。

1.2.2 紫色紅曲霉Mp-21基因組DNA提取 使用OMEAGA真菌提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作提取紫色紅曲霉Mp-21菌株基因組DNA。

1.2.3 紫色紅曲霉Mp-21wetM引物設(shè)計(jì) 根據(jù)紫色紅曲霉Mp-21轉(zhuǎn)錄組測(cè)序注釋結(jié)果[12]，篩選出與繁殖相關(guān)下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WetA蛋白的反轉(zhuǎn)錄序列(cDNA)具有較高同源性的Unigenes序列TRINITY_DN904_c0_g1。通過(guò)Primer 5.0軟件，根據(jù)所得的Unigenes序列，設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所需的引物[13-15]。引物wetM-F序列為T(mén)GCCGAGGTTTGGACAGTTA；引物wetM-R序列為ACGGATTGCCAGGCTCTATT。

1.2.4 紫色紅曲霉Mp-21wetMPCR基因擴(kuò)增和測(cè)序 得到引物后，使用高保真 LA Tap DNA polymerase，以紫色紅曲霉Mp-21基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)[16-17]。反應(yīng)體系：模版1 μL；LATaqDNA polymerase 0.25 μL；dNTP Mixture 4 μL；10×LA PCR Buffer 2.5 μL；brlM-F/wetM-F 1 μL；brlM-R/wetM-R 1 μL；ddH2O(Up to 25 μL)。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，50 ℃退火30 s， 循環(huán)30次；72 ℃延伸3 min；72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件120 V、170 mA。電泳后在紫外光分析儀下分析并回收目的條帶，隨后使用Axygen DNA Gel kit試劑盒回收目的條帶中的DNA。

1.2.5 紫色紅曲霉Mp-21wetM基因生物信息學(xué)分析 將克隆回收的wetM基因片段送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。利用ExPASy網(wǎng)站中的Translate tool工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，分析其開(kāi)放閱讀框(ORF)。利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并提交到Conserved Domains中識(shí)別此蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域并分析。利用得到的ORF框序列，使用dnaMAN軟件比對(duì)Mp-21wetM基因編碼氨基酸序列與其他絲狀真菌的繁殖相關(guān)因子WetA蛋白氨基酸序列的同源性和相關(guān)性。利用ExPASy網(wǎng)站中的ProtParam tool工具預(yù)測(cè)基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和一級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)氨基酸個(gè)數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、親水性等進(jìn)行分析。通過(guò)PSIPRED 4.0軟件分析wetM基因編碼的WetM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，該軟件通過(guò)多序列比對(duì)方法提取具有同源性的序列二級(jí)結(jié)構(gòu)以及分類(lèi)信息來(lái)對(duì)提交序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過(guò)ExPASy網(wǎng)站中的Swiss-Model工具對(duì)蛋白結(jié)果進(jìn)行同源比對(duì)建立蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，根據(jù)模型對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色紅曲霉Mp-21 wetM基因克隆結(jié)果

紫色紅曲霉Mp-21wetM基因克隆凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。wetM基因PCR克隆產(chǎn)物在電泳后只出現(xiàn)一條明亮的條帶，出現(xiàn)在4 500 bp對(duì)應(yīng)的位置。根據(jù)對(duì)應(yīng)Marker，可初步判斷產(chǎn)物片段長(zhǎng)度和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中Unigenes長(zhǎng)度大致相同。

圖1 紫色紅曲霉Mp-21 wetM 基因克隆結(jié)果Fig.1 Cloning results of wetM genes of Monascus purpureus Mp-21

2.2 紫色紅曲霉Mp-21 wetM基因分析

對(duì)所得測(cè)序結(jié)果中的轉(zhuǎn)錄序列進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，利用ExPASy網(wǎng)站中的Translate tool工具得到ORF[18-19]。wetM基因氨基酸序列預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示，其中存在一個(gè)1 659 bp的完整ORF開(kāi)放閱讀框，理論負(fù)責(zé)翻譯552個(gè)氨基酸。將ORF開(kāi)放閱讀框內(nèi)的氨基酸序列提交到Conserved domains，分析結(jié)果顯示W(wǎng)etM蛋白無(wú)明顯保守結(jié)構(gòu)域，再將該氨基酸序列提交到BLAST進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示W(wǎng)etM蛋白氨基酸序列與其他絲狀真菌中的WetA蛋白有一定的同源性，其中同源性得分最高的是煙曲霉(A.fumigatus)的WetA蛋白。

將紫色紅曲霉Mp-21wetM基因的ORF開(kāi)放閱讀框中的氨基酸序列與BLAST比對(duì)結(jié)果中同源性最高的費(fèi)氏曲霉(A.fischeri)、煙曲霉(A.fumigatus)、烏達(dá)加瓦曲霉(A.udagawae)、棒曲霉(A.clavatus)、赭曲霉(A.ochraceoroseus)、蘭貝利曲霉(A.rambellii)WetA蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，紫色紅曲霉wetM基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的WetM蛋白與其他絲狀真菌的WetA蛋白相似度在37.4%～39.5%范圍內(nèi)。其中相似度最高的是赭曲霉WetA蛋白序列，為39.5%；相似度最低的是費(fèi)氏曲霉WetA與煙曲霉WetA序列，為37.4%。

圖2 紫色紅曲霉Mp-21 wetM 基因開(kāi)放閱讀框分析結(jié)果Fig.2 ORF analysis of wetM gene of Monascus purpureus Mp-21

WetM蛋白與其他絲狀真菌在大部分區(qū)域相似度都較低，只有在氨基酸序列的最后90個(gè)氨基酸(460～552)中表現(xiàn)出極高的相似性，曲霉屬真菌WetA蛋白氨基酸序列也同樣具有這樣的特點(diǎn)，即整體的蛋白氨基酸序列差異較大，但是末端的序列中相似度極高。在序列長(zhǎng)度方面，WetM蛋白氨基酸序列與其他絲狀真菌WetA蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度相近(圖3)。

2.3 紫色紅曲霉Mp-21 wetM基因編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASy網(wǎng)站中的 ProParam tool工具對(duì)wetM基因編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)該蛋白的原子總數(shù)為8 302個(gè)，分子式為C2605H4067N781O831S18，分子量為60 199.76，氨基酸數(shù)為552個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)53個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)51個(gè)，理論等電點(diǎn)(pI)為8.15，不穩(wěn)定指數(shù)為79.97，脂肪族指數(shù)為57.66，親水性平均值-0.712。預(yù)測(cè)蛋白中絲氨酸(Ser)的含量最高，占氨基酸總數(shù)的15.6%。在預(yù)估的半衰期中完整蛋白預(yù)計(jì)半衰期為哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)或體外環(huán)境下30 h，在酵母菌細(xì)胞內(nèi)為>20 h，在大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)>10 h。根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)將WetM蛋白歸類(lèi)為不穩(wěn)定蛋白。

2.4 紫色紅曲霉Mp-21 wetM基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)PSIPRED 4.0軟件，利用多序列比對(duì)提取同源性序列對(duì)wetM基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。平均預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為78%，在所有蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法中居于領(lǐng)先地位[20-21]。按蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋(H)、β-折疊(E)、β-轉(zhuǎn)角(T)和無(wú)規(guī)則卷曲(C)，各種類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)并不是均勻分布在蛋白質(zhì)中，在不同的蛋白質(zhì)中二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類(lèi)和數(shù)目也不盡相同。WetM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析見(jiàn)圖4，粉色代表α-螺旋，黃色代表β-折疊，灰色代表無(wú)規(guī)則卷曲，且圖中藍(lán)色越深則代表準(zhǔn)確度越高。WetM蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示存在12個(gè)α-螺旋區(qū)域和2個(gè)β-折疊區(qū)域。

2.5 紫色紅曲霉Mp-21 wetM基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模

通過(guò)ExPASy網(wǎng)站中的Swiss-Model功能將開(kāi)放閱讀框(ORF)導(dǎo)入，利用保守性高的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源比對(duì)，建立蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型[22]。建模結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。WetM蛋白的保守功能區(qū)域含有多個(gè)結(jié)構(gòu)類(lèi)型，屬于非典型結(jié)構(gòu)域。

圖3 紫色紅曲霉Mp-21 WetM蛋白序列與其他絲狀真菌WetA蛋白序列比對(duì)Fig.3 Comparison of protein sequences of WetM of Monascus purpureus Mp-21 with those of WetA of other filamentous fungi 其他絲狀真菌：費(fèi)氏曲霉、煙曲霉、烏達(dá)加瓦曲霉、棒曲霉、赭曲霉、蘭貝利曲霉 other filamenteus fungi:A. fischeri, A. fumigatus, A. udagawa, A. clavatus, A. ochraceus, A. lambelli

圖4 紫色紅曲霉Mp-21 WetM蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of secondary structure of Monascus purpureus Mp-21WetM protein

圖5 紫色紅曲霉Mp-21 wetM基因編碼 蛋白質(zhì)保守區(qū)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.5 Prediction of the tertiary structure of protein conserved region encoded by wetM genes of Monascus purpureus Mp-21

3 討 論

首次從紫色紅曲霉Mp-21中克隆出紅曲霉繁殖相關(guān)基因wetM，并通過(guò)基因測(cè)序和開(kāi)放閱讀框分析得到了該基因的ORF序列，對(duì)ORF序列進(jìn)行氨基酸預(yù)測(cè)及蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)。對(duì)其編碼產(chǎn)生的WetM蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析角度大致從保守結(jié)構(gòu)域、蛋白同源性分析、蛋白各級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等方面出發(fā)。通過(guò)各項(xiàng)分析預(yù)測(cè)可知，WetM蛋白無(wú)明顯保守結(jié)構(gòu)域，將WetM蛋白與其他絲狀真菌的WetA蛋白比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，具有一定的同源性，蛋白氨基酸序列差異較大，但在末端則表現(xiàn)出高度相似。通過(guò)分析WetM蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，總結(jié)其分子式、理論等電點(diǎn)、親水性平均值并預(yù)測(cè)不穩(wěn)定指數(shù)后將該蛋白歸類(lèi)至不穩(wěn)定蛋白。WetM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可知該蛋白存在12個(gè)α-螺旋區(qū)域和2個(gè)β-折疊區(qū)域。根據(jù)同源建模得到的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn)，WetM蛋白的保守功能區(qū)域含有多個(gè)結(jié)構(gòu)類(lèi)型，屬于非典型結(jié)構(gòu)域。

本研究在一定程度上可以完善相應(yīng)家族蛋白的研究，以及目前尚未明晰的紅曲霉繁殖途徑。針對(duì)繁殖相關(guān)的基因及調(diào)控產(chǎn)生的相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究，對(duì)紅曲霉繁殖調(diào)控手段即控制子囊孢子和分生孢子的產(chǎn)生提供了理論參考，能夠在與紅曲霉相關(guān)的生產(chǎn)中更科學(xué)地調(diào)控生產(chǎn)條件，對(duì)紅曲霉在各個(gè)產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用具有積極作用。