柳州地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍細(xì)菌多樣性研究

陳正培，曹倩，蔣熠琤，周小玲，吳錦蘭，崔娜，鞏僖，熊建文

(柳州工學(xué)院 食品與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545616)

酸筍屬于典型的發(fā)酵食品，傳統(tǒng)工藝將新鮮竹筍切塊、洗凈后加入老壇酸水中進(jìn)行發(fā)酵[1-2]。隨著柳州螺螄粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，酸筍的市場(chǎng)需求量也迅速增大，逐漸從家庭作坊小規(guī)模制作走向工廠大規(guī)模生產(chǎn)，而新工藝生產(chǎn)的酸筍口感較傳統(tǒng)工藝的差，但傳統(tǒng)工藝又不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求，這是當(dāng)前酸筍行業(yè)發(fā)展急需解決的問(wèn)題。作為發(fā)酵食品，微生物對(duì)其風(fēng)味的形成至關(guān)重要，因此了解傳統(tǒng)酸筍中的微生物群落結(jié)構(gòu)，可為酸筍規(guī)模化生產(chǎn)提供參考，優(yōu)化酸筍發(fā)酵的微生物體系，是開(kāi)發(fā)高品質(zhì)酸筍的重要途徑。

高通量測(cè)序是近年來(lái)興起的用于食品微生物多樣性分析的前沿技術(shù)，應(yīng)用非常廣泛[3-6]。崔夢(mèng)君等[7]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析農(nóng)家醬中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)主要的細(xì)菌屬有乳酸桿菌屬、棒狀桿菌、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬等。安飛宇等[8]利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)豆醬自然發(fā)酵過(guò)程中的活性菌群及風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析表明嗜鹽四聯(lián)球菌、植物乳桿菌、酸魚(yú)乳桿菌、蛋白原酶乳桿菌、枯草芽孢桿菌及糞腸球菌與風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)，故將其定義為對(duì)風(fēng)味物質(zhì)合成有重要影響的核心發(fā)酵微生物種。該技術(shù)無(wú)需對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，分析結(jié)果覆蓋了樣品中的未培養(yǎng)微生物?；?Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)可對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行物種多樣性、物種豐度分析以及功能基因預(yù)測(cè)，是分析發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的有力工具。本研究利用該技術(shù)對(duì)酸筍發(fā)酵液中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，旨在為開(kāi)發(fā)適用于大規(guī)模生產(chǎn)的新工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸筍發(fā)酵液分別來(lái)自柳州的柳北區(qū)、柳城縣和鹿寨縣，每個(gè)地區(qū)各采集6份來(lái)自不同家庭的酸筍發(fā)酵液，裝入無(wú)菌瓶后于低溫(冰盒)條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，將各地區(qū)的樣品隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)樣品，并進(jìn)行等體積混合，得到6個(gè)混合樣品，分別為L(zhǎng)C1(來(lái)自柳城縣)、LC2(來(lái)自柳城縣)、LB1(來(lái)自柳北區(qū))、LB2(來(lái)自柳北區(qū))、LZ1(來(lái)自鹿寨縣)、LZ2(來(lái)自鹿寨縣)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：美國(guó)Omega科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5425高速離心機(jī) 德國(guó) Eppendorf公司；水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Master-S15超純水機(jī) 上海和泰儀器有限公司；GenoSens1880凝膠成像分析系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分別取以上6個(gè)混合酸筍發(fā)酵液20 mL，12000 r/min離心1 min，離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2次，參考Omega Bacterial DNA Kit 說(shuō)明書提取細(xì)菌的總DNA，經(jīng)過(guò)濃度測(cè)定后，將細(xì)菌總DNA于-80 ℃超低溫冰箱中臨時(shí)保存，取一定量的總DNA送至測(cè)序公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2 高通量測(cè)序1.3.2.1 DNA濃度的檢測(cè)

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA 濃度和純度。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

細(xì)菌多樣性分析采用16S rDNA基因可變區(qū)(V3～V4)區(qū)域通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[9-10]，PCR擴(kuò)增程序：①95 ℃預(yù)變性3 min；②95 ℃變性30 s；③退火溫度下退火15 s；④72 ℃延長(zhǎng)30 s；⑤72 ℃延長(zhǎng)10 min；②～④循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用AMPure XT beads 試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收純化，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用FLASH軟件，通過(guò)Overlap對(duì)樣品的Reads進(jìn)行拼接，得到Raw Tags數(shù)據(jù)；利用Trimmomatic軟件對(duì)Raw Tags進(jìn)行過(guò)濾[11]，得到高質(zhì)量的Clean Tags；利用Uchime軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective Tags；使用QIIME(Version 1.8.0)軟件中的 Uclust[12]對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU，并基于Silva細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。利用Uclust 軟件對(duì)OTU 進(jìn)行聚類分析，并選擇OTU 數(shù)目變化與Uclust 參數(shù)之間最佳近似值。并對(duì)物種豐度進(jìn)行分析，同時(shí)根據(jù)NCBI提供的已有微生物物種的分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Megan軟件將測(cè)序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫(kù)的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)中[13]。采用主坐標(biāo)分析法(principal coordinates analysis，PCoA)分析各樣品主因子。利用Metastats軟件對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)；得到p值，了解組間主要的差異物種。最后使用PICRUSt軟件通過(guò)比對(duì)16S測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

2 結(jié)果分析

2.1 各地區(qū)樣品中的OTU數(shù)分布

通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖1，6個(gè)測(cè)序樣品共獲得480，136對(duì)Reads，雙端Reads拼接、過(guò)濾后共產(chǎn)生344216條Clean Tags，其中柳北區(qū)樣品產(chǎn)生128617條Clean Tags，柳城縣樣品產(chǎn)生105335條Clean Tags，鹿寨縣樣品產(chǎn)生110261條Clean Tags。所有序列均按97%相似度歸為OTU，共聚合了191個(gè)OTU，柳北區(qū)樣品的OTU數(shù)顯著低于鹿寨縣和柳城縣樣品的OTU數(shù)，鹿寨縣和柳城縣樣品OTU數(shù)無(wú)顯著差異。分析不同地區(qū)樣品間的共有物種和特有物種數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。3個(gè)地區(qū)共有的OTU為48個(gè)，柳北區(qū)特有的OTU占比6.5%，鹿寨縣特有的OTU占比1.0%，柳城縣特有的OTU占比1.1%。

圖1 不同地區(qū)樣品的OTU數(shù)分布圖Fig.1 OTU number distribution diagram of samples from different regions

圖2 不同地區(qū)樣品的Venn圖Fig.2 Venn diagram of samples from different regions

2.2 各地區(qū)酸筍樣品中的物種分布

在屬水平上分析鹿寨、縣柳北區(qū)和柳城縣酸筍中的細(xì)菌物種豐度，篩選豐度大于0.1%的物種，結(jié)果見(jiàn)表1。在3個(gè)地區(qū)樣品中豐度大于0.1%的屬共有16個(gè)，分別為乳桿菌屬、氣斯卡多維亞氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、泛菌屬、擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬、志賀氏菌屬、艾克曼菌屬、瘤胃梭菌屬、嗜膽菌屬、普雷沃氏菌屬、阿里葉柄菌屬、羅斯氏菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、瘤胃球菌屬、弓(形)桿菌屬、葡萄球菌屬。其中乳桿菌屬占比最大，在3個(gè)地區(qū)的樣品中豐度均超過(guò)了90%，是柳州酸筍中的主要優(yōu)勢(shì)菌，其中柳北地區(qū)樣品的含量最高，達(dá)到96.11%。在柳北地區(qū)的酸筍樣品中，滿足豐度大于0.1%的物種只有5種，鹿寨地區(qū)有8種，柳城地區(qū)有10種，柳城與鹿寨的物種分布更為相似。

表1 柳州地區(qū)酸筍物種豐度Table 1 The species abundance of sour bamboo shoots in Liuzhou area %

續(xù) 表

2.3 Mega分類樹(shù)分析

根據(jù)NCBI提供的已有微生物物種的分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Megan軟件將測(cè)序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫(kù)的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)中，結(jié)果見(jiàn)圖3。來(lái)自柳城、鹿寨和柳北3個(gè)地區(qū)的酸筍樣品中原核微生物主要分布在9個(gè)門、13個(gè)綱、23個(gè)目、36個(gè)科和75個(gè)屬。在科水平上，主要分布在乳桿菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科中。

圖3 酸筍樣品的Mega分類樹(shù)Fig.3 Mega taxonomic tree of sour bamboo shoot samples

2.4 主成分分析

在屬水平上對(duì)來(lái)自柳北、柳城和鹿寨的6個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析，經(jīng)過(guò)提取因子后，PCoA-PC1占比為86.85%，PCoA-PC2占比8.45%。分析各樣品在兩個(gè)主成分上的差異，結(jié)果見(jiàn)圖4。各地區(qū)樣品組內(nèi)在PC1上均保持一致，除柳北的樣品外，來(lái)自柳城和鹿寨的各樣品在PCoA-PC2上有明顯的差異。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是酸筍發(fā)酵的主要物種只有乳桿菌屬，其他物種并不是酸筍發(fā)酵的關(guān)鍵菌種，因此其在不同樣品中的豐度有較大的差異。

圖4 屬水平上的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis at the genus level

2.5 組間顯著性差異分析

利用Metastats對(duì)柳北、柳城和鹿寨的樣品進(jìn)行兩兩比較，分析屬水平上導(dǎo)致組間差異的微生物，結(jié)果見(jiàn)表2。在屬水平上鹿寨與柳北的酸筍樣品中原核微生物的種類非常相似，只有梭桿菌屬(Fusobacterium)有顯著差異。柳城的酸筍樣品與柳北和鹿寨的樣品差異較大，主要體現(xiàn)在梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、甘藍(lán)油菜菌屬(Brassicanapus)、普氏菌屬(Prevotella)、 泛菌屬(Pantoea)4個(gè)屬上。

表2 地區(qū)間有顯著差異的菌株Table 2 Significantly different strains from different regions

2.6 組間功能基因的差異性分析

使用PICRUSt軟件通過(guò)比對(duì)16S測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)KEGG代謝途徑的差異分析，觀測(cè)不同分組的樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化，結(jié)果各組之間均無(wú)顯著性差異。3組樣品中共發(fā)現(xiàn)了39種功能基因，其中糖類代謝基因的豐度約為15%～18%，氨基酸代謝基因豐度為7%～12%、酯類代謝基因豐度約為3%～5%。

圖5 酸筍發(fā)酵液中的功能基因分析Fig.5 Functional genes infermentation broth of sour bamboo shoots

3 結(jié)論

本研究以柳州3個(gè)地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍為研究對(duì)象，采用 Illumina MiSeq 2500高通量測(cè)序技術(shù)分析樣品中細(xì)菌菌群組成情況。結(jié)果表明，不同地區(qū)酸筍樣品在物種多樣性上有一定的差異，柳北的樣品與鹿寨的樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，但與柳城的樣品存在較大差異，值得進(jìn)一步研究。酸筍中存在的優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌屬，其豐度達(dá)到90%以上，與其他發(fā)酵食品相似，劉怡萱等[14]發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬作為優(yōu)勢(shì)菌存在于西藏農(nóng)牧區(qū)牦牛酸奶中，孫慧君等[15]發(fā)現(xiàn)其作為優(yōu)勢(shì)菌存在于錦州地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵小菜中。毛螺菌屬和瘤胃菌屬也較為豐富，瘤胃菌屬可以發(fā)酵纖維素和纖維二糖，可能是使酸筍變軟的主要種群，同時(shí)也可以產(chǎn)生乙酸、甲酸等有機(jī)酸，所有樣品中均有志賀氏菌和葡萄球菌的存在，豐度較低，并不會(huì)引起人的疾病，但也應(yīng)引起人們的注意，可能存在一定安全風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過(guò)功能基因分析，糖代謝的基因豐度最大，達(dá)到15%～18%，可能是微生物能適應(yīng)在低可溶性糖環(huán)境下發(fā)酵的原因，氨基酸代謝相關(guān)的基因豐度達(dá)到7%～12%，它在賦予酸筍鮮味上起了重要作用。該技術(shù)在廣西酸筍細(xì)菌多樣性分析中的應(yīng)用，較為全面地解析了廣西酸筍中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為今后開(kāi)發(fā)復(fù)合發(fā)酵菌劑、優(yōu)化酸筍發(fā)酵體系提供了理論依據(jù)。