植物乳桿菌抑制產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌誘發(fā)豬腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制

李海花 梁東梅 喬家運(yùn)*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

仔豬早期斷奶是提高養(yǎng)豬生產(chǎn)效率常用的手段，但早期斷奶容易造成仔豬胃腸功能紊亂，使得細(xì)菌性腹瀉如大腸桿菌病經(jīng)常發(fā)生，因此在實(shí)際生產(chǎn)中常在飼糧中添加抗生素來預(yù)防仔豬腹瀉[1]。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2016年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)新生仔豬8.79億頭，其中大約有1.52億頭死于斷奶后腹瀉，導(dǎo)致?lián)p失高達(dá)240億元，這給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。當(dāng)前，“禁抗令”已正式生效，原本利用抗生素預(yù)防腹瀉的措施已禁止使用，因此，尋找抗生素替代品保護(hù)仔豬腸道健康顯得尤為急迫和重要。乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、預(yù)防仔豬腹瀉、提高腸道健康的作用，已經(jīng)作為一種安全的飼料添加劑被廣泛應(yīng)用。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)是識(shí)別各種入侵病原體的模式識(shí)別受體，在先天免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[3]。TLR或NLR識(shí)別病原微生物后，通過上游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等關(guān)鍵蛋白，從而調(diào)控下游促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的生成，進(jìn)而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷[4]。乳酸菌具有抑制產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)引起的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用[5]，然而其分子機(jī)制尚不是十分清楚。因此，本研究利用ETEC誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，研究植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對(duì)MAPK和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用，揭示植物乳桿菌調(diào)節(jié)豬腸上皮炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，為其在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞和菌株

豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；ETEC K88和植物乳桿菌均為天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)與動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等常用細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，豬IL-1β、IL-8和TNF-α檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司，豬乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，DNA和RNA核酸萃取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)買于美國(guó)GeneCpoeia公司，p38 MAPK抑制劑(SB-203580)、NF-κB p65抑制劑(BAY11-7082)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)MAPK抑制劑(SCH772984)購(gòu)自美國(guó)MCE公司，抗閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens，ZO)-1抗體和抗閉鎖蛋白(occludin)抗體均購(gòu)自Abcam公司，抗ERK MAPK抗體、抗磷酸化ERK-MAPK抗體、抗NF-κB p65抗體、抗磷酸化NF-κB p65抗體、抗p38 MAPK抗體、抗磷酸化p38 MAPK抗體和抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體均自美國(guó)CST公司。

1.3 促炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)

在本試驗(yàn)開始前，首先對(duì)植物乳桿菌使用的最佳劑量進(jìn)行篩選，利用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)分別為0、1、10、30和100的植物乳桿菌作用IPEC-J2細(xì)胞3 h，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量、細(xì)胞的形態(tài)變化以及植物乳桿菌黏附細(xì)胞的數(shù)量，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)正常、無炎癥反應(yīng)和植物乳桿菌黏附細(xì)胞數(shù)量等因素確定植物乳桿菌的最佳使用劑量為MOI=30。

試驗(yàn)設(shè)以下處理：空白對(duì)照組(不進(jìn)行處理)、ETEC組(ETEC刺激細(xì)胞)、植物乳桿菌+ETEC組(按順序使用植物乳桿菌、ETEC刺激細(xì)胞)。 將IPEC-J2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，加入植物乳桿菌(MOI=30)預(yù)作用細(xì)胞3 h，在ETEC(1×103CFU/mL)分別作用IPEC-J2細(xì)胞3、6、12和24 h后，收集培養(yǎng)上清液，經(jīng)3 000 r/min離心20 min后，按照IL-1β、IL-8和TNF-α檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行上清液中促炎性細(xì)胞因子含量的檢測(cè)。

1.4 TLR和NLR表達(dá)的測(cè)定

將IPEC-J2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，加入植物乳桿菌預(yù)作用細(xì)胞3 h，再用ETEC分別刺激細(xì)胞3、6、12和24 h，同時(shí)設(shè)立未處理的空白對(duì)照組和ETEC組，收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2、TLR4、NLRP3、NLRP6和GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物設(shè)計(jì)、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和相對(duì)定量法2-△△Ct法的計(jì)算參照Qiao等[6]的方法。

1.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中靶蛋白的表達(dá)

將IPEC-J2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，加入植物乳桿菌預(yù)作用細(xì)胞3 h，再用ETEC分別刺激細(xì)胞1、3、6和24 h，同時(shí)設(shè)立未處理的空白對(duì)照組和ETEC組，收集細(xì)胞。根據(jù)Qiao等[6]的Western blot檢測(cè)方法，測(cè)定靶蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)量以及NF-κB p65、ERK MAPK和p38 MAPK的磷酸化水平，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量。用Gel-Pro analyzer軟件分析各組上述蛋白條帶濃度，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 抑制劑處理細(xì)胞及其樣品檢測(cè)

將IPEC-J2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，分別用10 μmol/L的抑制劑SB-203580、SCH772984和BAY11-7082處理細(xì)胞1 h，置換培養(yǎng)液，加入植物乳桿菌處理細(xì)胞3 h，再用ETEC分別處理細(xì)胞24 h，分別收集培養(yǎng)上清液、細(xì)胞和凋亡小體。試驗(yàn)設(shè)以下處理：空白對(duì)照組(不進(jìn)行處理)、ETEC組(ETEC刺激細(xì)胞)、抑制劑+ETEC組(按順序用抑制劑、ETEC刺激細(xì)胞)、植物乳桿菌+ETEC組(按順序使用植物乳桿菌、ETEC刺激細(xì)胞)和抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組(按順序使用抑制劑、植物乳桿菌、ETEC刺激細(xì)胞)。按照LDH試劑盒說明書進(jìn)行上清液、凋亡小體和貼壁細(xì)胞中LDH活性的檢測(cè)。細(xì)胞的損傷程度根據(jù)公式來評(píng)估，細(xì)胞毒性(%)=培養(yǎng)上清液中LDH活性/總LDH活性。IL-1β、IL-8和TNF-α含量的檢測(cè)方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD法進(jìn)行多重比較，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖像處理及分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子的影響

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，ETEC組IL-1β、IL-8和TNF-α含量在6、12和24 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，TNF-α含量在3 h極顯著升高(P<0.01)，而IL-1β和IL-8含量在3 h均無顯著變化(P>0.05)。與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組IL-1β含量在12和24 h極顯著降低(P<0.01)，在3和6 h均無顯著差異(P>0.05)，IL-8和TNF-α含量在24 h均極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，ETEC感染促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，植物乳桿菌能夠降低ETEC誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的含量。

表1 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子的影響

續(xù)表1項(xiàng)目 Items空白對(duì)照組 Blank control groupETEC組 ETEC group植物乳桿菌+ETEC組 Lactobacillus plantarum+ETEC group12 h44.58±1.97Aa89.27±4.51Bb83.15±3.04Bb24 h43.71±1.11A145.66±11.78B101.24±4.46C

2.2 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞TLR和NLR表達(dá)的影響

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，ETEC組TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6 mRNA相對(duì)表達(dá)量在6、12和24 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，TLR4和NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量在3 h均極顯著升高(P<0.01)。與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組TLR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在3和6 h均極顯著升高(P<0.01)，且在24 h極顯著降低(P<0.01)；TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量在6和12 h均極顯著升高(P<0.01)，NLRP3和NLRP6 mRNA相對(duì)表達(dá)量在3和6 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量在12和24 h均極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，ETEC感染促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞表達(dá)TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6；植物乳桿菌能夠在ETEC感染前期促進(jìn)ETEC感染細(xì)胞表達(dá)微生物識(shí)別受體，在感染后期能夠降低ETEC誘導(dǎo)的受體表達(dá)。

表2 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞TLR和NLR表達(dá)的影響

2.3 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞中MAPK和NF-κB磷酸化的影響

由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，ETEC組ERK-MAPK磷酸化水平在3 h顯著升高(P<0.05)，在6 h極顯著降低(P<0.01)；p38 MAPK磷酸化水平在3 h極顯著升高(P<0.01)，在1和6 h均無顯著變化(P>0.05)；NF-κB p65磷酸化水平在1、3和6 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組ERK-MAPK磷酸化水平在1和3 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，在6 h無顯著變化(P>0.05)；p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平在3和6 h均極顯著降低(P<0.01)，在1 h無顯著變化(P>0.05)。結(jié)果表明，ETEC感染引起細(xì)胞中ERK-MAPK、p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平升高，植物乳桿菌不僅能降低ETEC誘導(dǎo)的p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，還可提高ETEC誘導(dǎo)的ERK-MAPK的磷酸化水平。

ERK-MAPK：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-絲裂原活化蛋白激酶 extracellular signal-regulated kinase-mitogen activated protein kinase；p-ERK MAPK：磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-絲裂原活化蛋白激酶 phospho-extracellular signal-regulated kinase-mitogen activated protein kinase；p38 MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶 p38 mitogen activated protein kinase；p-p38 MAPK：磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶 phospho-p38 mitogen activated protein kinase；NF-κB p65：核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65 nuclear factor-κB p65；p-NF-κB p65：磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65 phospho-nuclear factor-κB p65；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；p-GAPDH：磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶 phospho-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；ETEC：產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；LP：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum。

2.4 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，ETEC組ZO-1和occludin的表達(dá)量在6和24 h均極顯著降低(P<0.01)；與ETEC組相比，植物乳桿菌+ETEC組ZO-1和occludin的表達(dá)量在6和24 h顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明，ETEC感染能夠引起豬腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)量下降，但是植物乳桿菌能夠逆轉(zhuǎn)ETEC造成的緊密連接蛋白表達(dá)下降。

ZO-1：閉合小環(huán)蛋白-1 zonula occludens-1；Occludin：閉鎖蛋白；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；ETEC：產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌 enterotoxigenic Escherichia coli；LP：植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum。

2.5 靶蛋白在植物乳桿菌調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子中的作用

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，ETEC組IL-1β、IL-8和TNF-α含量均極顯著升高(P<0.01)。與ETEC組相比，抑制劑+ETEC組、植物乳桿菌+ETEC組和抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組IL-1β、IL-8和TNF-α含量均極顯著降低(P<0.01)。與植物乳桿菌+ETEC組相比，抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組在p38 MAPK活性被抑制后IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)，IL-8含量呈下降趨勢(shì)但差異不顯著(P>0.05)；在NF-κB p65活性被抑制后IL-8含量顯著降低(P<0.05)，TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，IL-1β含量呈下降趨勢(shì)但差異不顯著(P>0.05)；在ERK-MAPK活性被抑制后IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)，TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，IL-8含量呈下降趨勢(shì)但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，植物乳桿菌和靶蛋白抑制劑共同作用或植物乳桿菌單獨(dú)作用均能夠降低ETEC誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的生成，并且靶蛋白抑制劑對(duì)植物乳桿菌調(diào)控部分促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有協(xié)同作用。

表3 靶蛋白在植物乳桿菌調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子中的作用

2.6 植物乳桿菌對(duì)ETEC誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，ETEC組細(xì)胞毒性極顯著升高(P<0.01)；與ETEC組相比，抑制劑+ETEC組、植物乳桿菌+ETEC組和抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組細(xì)胞毒性均極顯著降低(P<0.01)；與植物乳桿菌+ETEC組相比，抑制劑+植物乳桿菌+ETEC組在ERK-MAPK活性被抑制時(shí)細(xì)胞毒性顯著下降(P<0.05)，在p38 MAPK和NF-κB p65活性被抑制時(shí)細(xì)胞毒性無顯著變化(P>0.05)。結(jié)果表明，ETEC感染增加了豬腸上皮細(xì)胞細(xì)胞毒性，植物乳桿菌和ERK-MAPK抑制劑共同作用或植物乳桿菌單獨(dú)作用均能夠降低ETEC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并且部分抑制劑對(duì)植物乳桿菌降低ETEC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有協(xié)同作用。

表4 植物乳桿菌對(duì)ETEC誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

3 討 論

3.1 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子的影響

細(xì)胞因子由激活的免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞等)和基質(zhì)細(xì)胞(如上皮細(xì)胞等)產(chǎn)生，具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)作用，其中一個(gè)十分重要的作用就是參與免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)。TNF-α和白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)能夠使巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)其吞噬、殺傷等活性，同時(shí)TNF-α具有細(xì)胞毒作用，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化，這些免疫細(xì)胞的活化均有助于機(jī)體清除入侵的病原菌。IL-8又稱為趨化因子，能夠募集免疫細(xì)胞到病原菌感染部位，從而使免疫細(xì)胞能夠在特定部位發(fā)揮殺傷作用，有利于機(jī)體抵抗病原菌感染和維持自身免疫平衡。適量的TNF-α、IL-1和IL-8能夠發(fā)揮上述積極作用，過量的這些細(xì)胞因子則會(huì)給機(jī)體正常組織帶來較大的損傷，例如活化的中性粒細(xì)胞可以溶解細(xì)胞和結(jié)締組織。因此，如果細(xì)胞因子過量的話，冗余的中性粒細(xì)胞就會(huì)被激活，導(dǎo)致較多的細(xì)胞和組織損傷，破壞機(jī)體的免疫平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的TNF-α、IL-1β和IL-8，同時(shí)釋放出大量的LDH(表現(xiàn)為細(xì)胞毒性增強(qiáng))于培養(yǎng)液中，對(duì)自身造成了損傷，然而，被植物乳桿菌預(yù)處理的豬腸上皮細(xì)胞在被ETEC感染后，其產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-8含量以及釋放的LDH活性均顯著下降。植物乳桿菌10hk2株能夠減弱脂多糖(LPS)處理的小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，同時(shí)增加抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7]。這表明，植物乳桿菌能夠降低ETEC感染的細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，減輕該病原菌引起的腸上皮細(xì)胞損傷。

3.2 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞TLR和NLR表達(dá)的影響

先天性免疫反應(yīng)通過細(xì)胞的模式識(shí)別受體識(shí)別入侵的微生物，TLR和NLR是2類重要的模式識(shí)別受體，它們一旦識(shí)別微生物后就會(huì)活化免疫細(xì)胞，通過下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[8]。TLR2和TLR4均是細(xì)胞膜表面受體，它們識(shí)別的微生物具有其分子結(jié)構(gòu)特征性，TLR4主要識(shí)別LPS，而TLR2的配體較TLR4的廣泛，可以識(shí)別脂蛋白、脂磷壁酸和脂多肽等。在本研究中，ETEC的刺激增加豬腸上皮細(xì)胞中TLR2和TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量，在ETEC感染3～12 h植物乳桿菌預(yù)處理的細(xì)胞中TLR2和TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，但是在ETEC感染24 h植物乳桿菌預(yù)處理的細(xì)胞中TLR2的mRNA相對(duì)表達(dá)量開始下降。NLR是TLR的胞質(zhì)對(duì)應(yīng)物，在病原體出現(xiàn)時(shí)會(huì)啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)[9]。此外，本試驗(yàn)中，ETEC的刺激增加豬腸上皮細(xì)胞中NLRP3和NLRP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量，在ETEC感染3～6 h植物乳桿菌預(yù)處理的細(xì)胞中NLRP3和NLRP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，但是在ETEC感染12 h植物乳桿菌預(yù)處理的細(xì)胞中NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量開始下降。這說明，植物乳桿菌對(duì)TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，在ETEC感染早期TLR2、TLR4和NLRP3的高表達(dá)能夠使IPEC-J2細(xì)胞通過識(shí)別更多的ETEC分子結(jié)構(gòu)而活性增強(qiáng)，從而產(chǎn)生較多的促炎性細(xì)胞因子，有助于清除ETEC；而在感染后期TLR2和NLRP3的低表達(dá)可以降低促炎性細(xì)胞因子的生成，有助于減輕對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的損傷。NLRP6是一個(gè)抑制天然免疫反應(yīng)的模式識(shí)別受體，在ETEC感染植物乳桿菌預(yù)處理的細(xì)胞早期NLRP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，這有助于減輕或避免過強(qiáng)的免疫反應(yīng)帶來的細(xì)胞損傷。這表明，植物乳桿菌通過調(diào)節(jié)TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6表達(dá)來調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的生成，有助于減輕ETEC感染引起的腸上皮細(xì)胞損傷。因此，我們猜測(cè)植物乳桿菌介導(dǎo)的TLR2、TLR4和NLRP3依賴性信號(hào)通路的激活可能會(huì)誘導(dǎo)一些炎癥細(xì)胞的募集和激活，成為宿主細(xì)胞抵抗ETEC誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的一種防御性策略。與本研究結(jié)果一致的是，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)GR-1[10]或植物乳桿菌NDC 75017[11]處理的細(xì)胞中TLR2的表達(dá)水平也表現(xiàn)為提高；嗜酸乳桿菌預(yù)飼仔豬后，也能夠降低ETEC感染仔豬脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中TLR2和TLR4的表達(dá)[12]。

3.3 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞中MAPK和NF-κB磷酸化的影響

TLR和NLR識(shí)別入侵病原體后，就會(huì)激活信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白如MAPK和NF-κB，最終調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-8等的產(chǎn)生。TNF-α的產(chǎn)生和NF-κB的活化能夠形成一個(gè)正向反饋回路，即NF-κB的活化促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生，TNF-α的產(chǎn)生又可產(chǎn)生信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起NF-κB的活化[13]。蛋白質(zhì)磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控的核心，因?yàn)樗鹬_關(guān)的作用來開啟或關(guān)閉蛋白質(zhì)的活性。因此，本研究對(duì)NF-κB亞基p65的磷酸化進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，植物乳桿菌對(duì)NF-κB p65的磷酸化有顯著的抑制作用。因此，我們推測(cè)，植物乳桿菌可能至少部分通過NF-κB依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)ETEC感染的IPEC-J2細(xì)胞產(chǎn)生抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌預(yù)處理后能夠減弱ETEC誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α。與本研究發(fā)現(xiàn)一致，植物乳桿菌10hk2株能夠通過抑制NF-κB的活化減弱LPS處理的小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[7]。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)也可以下調(diào)ETEC感染的豬小腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子IL-8和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)[14]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，特異性信號(hào)通路抑制劑對(duì)植物乳桿菌下調(diào)ETEC誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有協(xié)同作用。

TLR和NLR表達(dá)下降能夠減弱MAPK和NF-κB的磷酸化，導(dǎo)致多種細(xì)胞因子分泌下降[15]。本研究表明，在ETEC感染后期植物乳桿菌使ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞表達(dá)TLR2、TLR4和NLRP3的能力下降，同時(shí)植物乳桿菌還能夠降低ETEC誘導(dǎo)的p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平。前人研究表明，詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)和食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)在下調(diào)TLR4依賴性NF-κB和MAPK激活以及觸發(fā)TLR負(fù)調(diào)節(jié)因子，包括Toll相互作用蛋白(Toll interacting protein，Tollip)、B細(xì)胞淋巴瘤3編碼的蛋白質(zhì)(B-cell lymphoma 3-encoded protein，Bcl3)、腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3(A20)、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)和抑制性白細(xì)胞介素-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)相關(guān)激酶等中發(fā)揮保護(hù)作用[16-17]。副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)能夠通過誘導(dǎo)TLR2依賴性NF-κB信號(hào)通路激活的負(fù)調(diào)節(jié)因子來抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子[18]。因此，我們推測(cè)植物乳桿菌引起的NF-κB磷酸化水平下降可能與TLR2活化相關(guān)。他們的研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果相結(jié)合，提供了一種益生菌通過減輕炎癥反應(yīng)來保護(hù)腸細(xì)胞免受ETEC造成損傷的可能性。ERK和p38是MAPK中2個(gè)不同的家族，參與炎性反應(yīng)。在本研究中，植物乳桿菌可在ETEC感染后3～6 h使細(xì)胞中p38 MAPK磷酸化受到抑制，但是在同一組中觀察到了ERK-MAPK磷酸化的增強(qiáng)，這說明植物乳桿菌調(diào)節(jié)ETEC誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)存在著復(fù)雜性，還需要我們進(jìn)行更深入的研究。NLRP6可以抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路[6,19-20]。在本研究中，植物乳桿菌還能夠提高ETEC感染細(xì)胞中NLRP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)還降低了該細(xì)胞中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，這表明NLRP6在植物乳桿菌調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著一定的作用。

3.4 植物乳桿菌對(duì)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)的影響

腸道屏障與功能性緊密連接蛋白密切相關(guān)，緊密連接蛋白是位于上皮細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)復(fù)合體，是一種基于分子電荷和大小的細(xì)胞旁通透性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[21]。從這個(gè)意義上說，這種多功能和連續(xù)裝配的任何變化都可能導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性的限制，使離子和溶質(zhì)的進(jìn)入或凈流動(dòng)成為可能。緊密連接包括跨膜蛋白(封閉蛋白和閉合蛋白)以及各種被招募到頂外側(cè)膜的胞漿蛋白，包括ZO-1、ZO-2、ZO-3、扣帶蛋白(cingulin)和7H6[22]。在ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞中，緊密連接的完整性和規(guī)律滲透率被負(fù)面影響[22]；在早期斷奶仔豬中，ETEC的感染能夠增加緊密連接的通透性[23]；羅伊氏乳桿菌能夠通過維持ZO-1的正常位置，可以降低ETEC誘導(dǎo)的膜屏障損傷[24]。這些結(jié)果與本研究的結(jié)果是一致的，ETEC感染能夠降低緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)，但是這種不利的影響在植物乳桿菌預(yù)處理的細(xì)胞中能夠被部分逆轉(zhuǎn)。這說明，植物乳桿菌調(diào)控腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)有助于維護(hù)腸上皮細(xì)胞的完整性。

3.5 植物乳桿菌對(duì)ETEC誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

LDH是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的氧化還原酶，廣泛存在于組織中。細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外應(yīng)激都會(huì)導(dǎo)致黏屏障功能受損，刺激細(xì)胞隨后釋放LDH，常用培養(yǎng)液中LDH的活性來表示細(xì)胞損傷程度[25]。因此，培養(yǎng)液中LDH的活性通常作為細(xì)胞損傷或死亡的一種標(biāo)志。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ETEC能夠誘導(dǎo)豬腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，釋放大量LDH，而植物乳桿菌的加入能夠顯著降低ETEC感染細(xì)胞釋放LDH。這說明，植物乳桿菌能夠保護(hù)豬腸上皮細(xì)胞膜的完整性，并且在特異性信號(hào)通路抑制劑存在的情況下這種保護(hù)作用能夠被提高，植物乳桿菌對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用可能有助于提高上皮細(xì)胞的屏障功能。

4 結(jié) 論

植物乳桿菌通過促進(jìn)ETEC感染的豬腸上皮細(xì)胞過表達(dá)NLRP6，抑制ETEC感染細(xì)胞過表達(dá)TLR2和NLRP3，下調(diào)感染細(xì)胞中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，以及抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此外，植物乳桿菌還可促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)，減輕感染細(xì)胞的損傷程度，有助于維護(hù)腸上皮細(xì)胞的完整性。