飛機(jī)草提取物的體外與體內(nèi)抗菌作用研究

楊航 黃凌 呂傳柱

自1928年人類發(fā)現(xiàn)青霉素到1943年正式投入臨床使用，人類開始不斷發(fā)現(xiàn)或合成新型抗生素，而微生物也在不斷進(jìn)化從而出現(xiàn)耐藥，進(jìn)而導(dǎo)致抗生素的殺傷力減弱。據(jù)統(tǒng)計，2000～2015年全球抗生素的消耗量增長了近65%[1]，而研究表明每年全世界約有70萬例患者因抗生素耐藥死亡[2]。在我國，感染是造成40歲以上人群第5大死亡原因[3]，因此新型抗菌藥物的研發(fā)亟不可待。由于天然植物來源廣泛，毒副作用小，抗菌譜廣，目前已經(jīng)有越來越多的科學(xué)家把目光投向了天然植物，以找出合適的抗菌藥物衍生物[4～6]。飛機(jī)草在我國、印度、喀麥隆、越南、泰國等發(fā)展中國家常被作為傳統(tǒng)藥物使用，主要應(yīng)用于止血、抗炎、促進(jìn)傷口愈合、抗感染等[7～9]。有研究表明飛機(jī)草葉的水及乙醇提取物對真菌具有一定的抗菌活性，且呈濃度依賴性[10]，也有研究表明飛機(jī)草葉提取出的脂溶性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌也具有抗菌活性[11]，以上研究均表明飛機(jī)草提取物具有體外抗菌作用，有望成為新型抗菌藥物研究的對象。本實驗通過飛機(jī)草葉、莖、全草3個部位的提取物針對常見致病菌進(jìn)行體外、體內(nèi)抗菌作用研究，為飛機(jī)草作為新型抗菌藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑2019年7月于?？诓杉w機(jī)草，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)院張小坡教授鑒定為菊科澤蘭屬飛機(jī)草。試劑：無水甲醇（上?；乒荆?；95%乙醇（佛山予華儀器科技有限公司）；無水丙酮（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；羧甲基纖維素鈉（CMCNa，上海Aladdin公司）；MH瓊脂培養(yǎng)基（青島hopebio公司）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱公司）；無菌脫纖維綿羊血（南京樂診生物技術(shù)有限公司）；注射用青霉素鈉（廣州白云山天心制藥公司）。

1.2 實驗菌株與動物金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 25923、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）ATCC49619、大腸埃希菌（E. Coli） ATCC25922、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa） ATCC27853，以上4種菌種均來自海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科。金黃色葡萄球菌（S. aureus） CMCC26001來自中國食品藥品檢定研究院。健康昆明種小鼠150只，SPF級，雌雄各半，體重18～20g，購自海南藥物研究所。

1.3 方法

1.3.1 飛機(jī)草各部位提取液制備 將采集的飛機(jī)草置于陰涼處陰干，將部分飛機(jī)草葉、莖分離，用碾碎機(jī)碾碎，各部位再分別用甲醇、95%乙醇、丙酮、水浸泡48h，過濾，重復(fù)2次，合并濾過液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)、濃縮，最后將飛機(jī)草各組分濃縮液置于恒溫蒸發(fā)儀上再次除去多余的溶劑得到不同溶劑浸膏。體外抗菌實驗中，用DMSO溶解各組分浸膏，配制成濃度為128mg/ml的溶液，用0.22m的過濾器對溶液進(jìn)行過濾消毒。同時配制濃度為128mg/ml青霉素溶液，設(shè)為陽性對照組，無菌的DMSO溶液為陰性對照組。體內(nèi)抗菌實驗中，根據(jù)課題組前期急性毒性結(jié)果及體外抗菌結(jié)果，以配制的飛機(jī)草提取物的濃度不致小鼠死亡作為體內(nèi)抗菌的給藥濃度，用1%的羧甲基纖維素鈉溶液分別配制飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、葉水提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草乙醇提取物菌懸液，濃度分別為0.8g/ml、1.2g/ml、0.6g/ml、1.8g/ml、1.0g/ml、0.3g/ml、1.0g/ml。青霉素溶液作為陽性對照組，配成0.1g/ml；1%的羧甲基纖維素鈉溶液為模型組；正常喂養(yǎng)小鼠為陰性對照組。

1.3.2 菌液制備

1.3.2.1 體外抗菌菌液制備 配制在波長為600nm處吸光度為0.5時的菌液，通過平板計數(shù)法[12]，得出各菌種吸光度在0.5時的菌液濃度為（1.5～3.0）×108CFU/ml。

1.3.2.2 體內(nèi)抗菌菌液制備 同樣采用平板計數(shù)法，計算每毫升金黃色葡萄球菌 ATCC25923的菌液濃度。通過腹腔注射菌液建立感染模型，計算最小致死菌液濃度為4×108CFU/ml。

1.3.3 體外抗菌實驗

1.3.3.1 飛機(jī)草提取物抑菌圈直徑測定 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌圈直徑測定，取配制好的菌懸液150μl，涂布均勻，晾干后在瓊脂板上放置無菌藥敏紙片（直徑6mm，厚度1mm），取配制的飛機(jī)草各部位提取物溶液、青霉素及DMSO溶液15μl滴在藥敏紙片上，重復(fù)3次，做好標(biāo)記，將平板倒扣在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后，測量各提取物抑菌圈直徑。

1.3.3.2 飛機(jī)草提取物最小抑菌濃度（MIC）測定 采用微量肉湯稀釋法，分組如下：①飛機(jī)草各部位提取物作為實驗組，加藥加菌；②青霉素為陽性對照組，加藥加菌；③菌液組，加菌液不加藥；④空白對照組，僅加細(xì)菌培養(yǎng)基。檢查結(jié)果通過肉眼觀察實驗組各孔的澄清度，以剛好未出現(xiàn)渾濁的濃度作為該組藥物MIC，如果難以確定的孔，可選波長在492nm處吸光度為0.4的飛機(jī)草提取物的孔進(jìn)行再次實驗。

1.3.4 體內(nèi)抗菌實驗 小鼠隨機(jī)分組，雌雄各半，每組10只。除空白對照組，每組小鼠腹腔注射濃度為4×108CFU/ml的金黃色葡萄球菌 ATCC25923菌液0.4ml。根據(jù)體外抗菌結(jié)果，選擇飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、葉水提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草乙醇提取物進(jìn)行灌胃給藥，按每只小鼠以0.2ml/10g給藥，每天1次，連續(xù)灌胃3d，記錄7d內(nèi)每組小鼠的存活率。及時對死亡的小鼠進(jìn)行解剖，觀察體內(nèi)臟器的變化，同時留取肝、肺、腎的病理標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，做病理檢測。1周后，對每組存活的小鼠采取摘取眼球取血的方式，檢測WBC及NEUT%水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及作圖，多組間比較采用單因素方差分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑菌圈直徑測定飛機(jī)草各部位提取物對5種細(xì)菌的抑菌圈直徑見表1。飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、葉水提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草乙醇提取物對金黃色葡萄球菌ATCC25923具有一定抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為11mm、11mm、11.5mm、10mm、12mm、12.5mm、11mm；且上述提取物對金黃色葡萄球菌CMCC26001同樣具有一定抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為12mm、11mm、12mm、11mm、8mm、13mm、10mm，而莖甲醇提取物、莖水提取物、全草甲醇提取物、全草丙酮提取物、全草水提取物對金黃色葡萄球菌ATCC25923與金黃色葡萄球菌 CMCC26001無明顯抑菌效果。見圖1、2。除飛機(jī)草葉、莖、全草水提取物對肺炎鏈球菌 ATCC49619無明顯抑菌作用，飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、莖甲醇提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草甲醇提取物、全草乙醇提取物、全草丙酮提取物對肺炎鏈球菌 ATCC49619均具有不同程度的抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為11mm、11.5mm、11mm、11mm、12mm、12mm、12.5mm、13mm、12mm，見圖3。僅飛機(jī)草葉水提取物對大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌 ATCC27853具有抑菌作用，其抑菌圈平均直徑分別為7.5mm與9mm，其它飛機(jī)草提取物對這兩種細(xì)菌均無抑菌作用，見圖4、5。

表1 飛機(jī)草各部位提取物對5種細(xì)菌的抑菌圈直徑（mm）

圖1 飛機(jī)草各部位提取物對金黃色葡萄球菌 ATCC25923的抑菌作用

圖2 飛機(jī)草各部位提取物對金黃色葡萄球菌 CMCC26001的抑菌作用

圖3 飛機(jī)草各部位提取物對肺炎鏈球菌 ATCC49619的抑菌作用

圖4 飛機(jī)草各部位提取物對大腸埃希菌ATCC25922的抑菌作用

圖5 飛機(jī)草各部位提取物對銅綠假單胞菌 ATCC27853的抑菌作用

2.2 MIC測定飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、葉水提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草乙醇提取物對金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC分別為16mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、4mg/ml、8mg/ml；上述提取物對金黃色葡萄球菌CMCC26001的MIC分別為16mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、4mg/ml、8mg/ml。飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、莖甲醇提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草甲醇提取物、全草乙醇提取物、全草丙酮提取物對肺炎鏈球菌ATCC49619的MIC分別為8mg/ml、16mg/ml、4mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、8mg/ml。僅飛機(jī)草葉水提取物可測得對大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853的MIC，分別為64mg/ml和128mg/ml。見表2。

表2 飛機(jī)草各部位提取物對5種細(xì)菌的MIC測定結(jié)果（mg/ml）

2.3 飛機(jī)草各部位提取物對感染金黃色葡萄球菌ATCC25923小鼠的保護(hù)情況根據(jù)體外抗菌結(jié)果，飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、葉水提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物、全草乙醇提取物對感染金黃色葡萄球菌ATCC 25923小鼠的保護(hù)情況見表3。

表3 飛機(jī)草各部位提取物對感染金黃色葡萄球菌ATCC25923小鼠的保護(hù)作用

2.4 飛機(jī)草各部位提取物對小鼠體內(nèi)WBC及NEUT%水平的影響飛機(jī)草各部位提取物組WBC及NEUT%水平與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 飛機(jī)草各部位提取物組WBC與空白對照組WBC及NEUT%比較（±s）

表4 飛機(jī)草各部位提取物組WBC與空白對照組WBC及NEUT%比較（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05

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2.5 病理結(jié)果對死亡的小鼠進(jìn)行解剖，肉眼可見小鼠胃腸脹氣，腹腔積液，可聞及惡臭味，部分小鼠肝臟、肺有出血，出血量不一，腎臟、脾及心臟肉眼未見明顯變化。

小鼠感染金黃色葡萄球菌ATCC25923，灌胃給藥后，與空白對照組相比，飛機(jī)草莖丙酮提取物與模型組的肝臟損傷最為嚴(yán)重，飛機(jī)草葉乙醇提取物、飛機(jī)草莖乙醇提取物、全草乙醇提取物組小鼠肝臟中度損傷，陽性對照組、飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉丙酮提取物與葉水提取物組小鼠肝臟輕度損傷，具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞點、灶狀壞死，細(xì)胞核大小不等，大量炎癥細(xì)胞浸潤，見圖6。飛機(jī)草各部位提取物組、陽性對照組、模型組肺損傷病理改變均較明顯，表現(xiàn)為肺組織充血水腫，肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤，少量肺組織纖維化，見圖7。各組均有一定程度腎損傷，具體表現(xiàn)為不同程度的炎細(xì)胞浸潤，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞彌漫性增生，毛細(xì)血管壁輕至中度損傷，并有部分新月體形成，見圖8。

圖6 小鼠感染金黃色葡萄球菌ATCC25923后的肝損傷情況（×400）

圖7 小鼠感染金黃色葡萄球菌ATCC25923后的肺損傷情況（×400）

圖8 小鼠感染金黃色葡萄球菌ATCC25923后的腎損傷情況（×400）

3 討論

目前有研究報道飛機(jī)草提取物在體外實驗中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等常見致病菌均具有不同程度的抑菌作用[13，14]。本課題就飛機(jī)草葉、莖、全草3個部位12種提取物針對金黃色葡萄球菌 ATCC25923、金黃色葡萄球菌 CMCC26001、肺炎鏈球菌 ATCC49619、大腸埃希菌ATCC25922與銅綠假單胞菌 ATCC27853這5種常見致病菌進(jìn)行了全面的體外抑菌作用研究，結(jié)果表明飛機(jī)草提取物對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌 ATCC25923、金黃色葡萄球菌 CMCC26001、肺炎鏈球菌 ATCC49619）具有較好的抑菌作用，僅飛機(jī)草葉水提取物對革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌ATCC25922與銅綠假單胞菌 ATCC27853）具有較弱的體外抑菌作用,這一結(jié)果表明飛機(jī)草葉水提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均具有一定的抑菌作用，飛機(jī)草葉水提取物的具體抑菌活性成分還需進(jìn)一步研究，其抑菌作用機(jī)制也需深入探索。

目前關(guān)于飛機(jī)草體內(nèi)抗菌作用的研究暫未見報道，且全球金黃色葡萄球菌感染率不斷上升[15]，耐藥性越來越強(qiáng)，死亡率也越來越高。在我國醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染率已經(jīng)超過50%[16]，在美國MRSA感染率已經(jīng)超過免疫缺陷綜合征（ARDS）[17]。因此本研究選擇金黃色葡萄球菌 ATCC25923對小鼠進(jìn)行感染造模，同時，根據(jù)體外抗菌結(jié)果，選擇飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、葉丙酮提取物、葉水提取物、莖乙醇提取物、莖丙酮提取物及全草乙醇提取物針對感染金黃色葡萄球菌 ATCC25923的小鼠進(jìn)行了體內(nèi)抗菌實驗，結(jié)果表明飛機(jī)草葉水提取物組小鼠病死率為0，其小鼠病死率比陽性對照組還低，表明飛機(jī)草葉水提取物抗菌作用比青霉素強(qiáng)，且飛機(jī)草葉水提取物病理結(jié)果也顯示其對肝、腎損傷相對較輕，結(jié)合體外抗菌實驗結(jié)果，飛機(jī)草葉水提取物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均具有一定的體外抑菌效果，說明飛機(jī)草葉水提取物具有較大的轉(zhuǎn)化為臨床新型抗菌藥物的價值。飛機(jī)草葉甲醇提取物、葉乙醇提取物、莖乙醇提取物對感染金黃色葡萄球菌ATCC25923的小鼠也具有一定的體內(nèi)保護(hù)作用，小鼠的生存率也明顯高于模型組，說明這3種提取物也具有一定的體內(nèi)抗菌作用。

通過飛機(jī)草提取物的體外及體內(nèi)抗菌實驗，可以發(fā)現(xiàn)飛機(jī)草具有一定的抗菌效果。課題組前期就飛機(jī)草提取物的毒理學(xué)也進(jìn)行了相關(guān)研究，表明其提取物對小鼠口服實際無毒，且由于其資源豐富，藥理作用廣泛，飛機(jī)草具有較大的藥用價值。下一步可分析提取具體的化合物，對其抗菌靶點及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為開發(fā)及利用飛機(jī)草提供科學(xué)依據(jù)。