熱休克蛋白B1在主動脈夾層中的表達變化及臨床意義*

程 林， 陳 軍， 蔣丁勝， 魏 翔

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 430030

主動脈夾層(aortic dissection，AD)是由各種病因引起的主動脈內(nèi)膜破裂，血液從內(nèi)膜破口進入中膜，主動脈壁形成真假腔的一種主動脈綜合征[1-2]。AD是高度致死性疾病，主要以胸痛為臨床表現(xiàn)。目前，主動脈夾層的診斷主要依賴于CT血管造影(CT angiography，CTA)等影像學檢查。用于主動脈夾層輔助診斷的生物標志物主要包括平滑肌蛋白、可溶性彈性蛋白片段、肌球蛋白重鏈、肌酸激酶BB亞型以及D-二聚體等，但由于以上生物標志物的特異性均較差，所以其診斷價值并不高。目前對于主動脈夾層的治療主要是外科手術(shù)、介入治療以及雜交手術(shù)治療，除了降壓、鎮(zhèn)痛以及控制心率等措施外，尚無有效的保守治療以及預防策略，主要原因是我們目前對主動脈夾層的發(fā)病機制還知之甚少[3]。熱休克蛋白B1(heat shock protein B1，HSPB1)主要作為ATP依賴的分子伴侶，參與應激狀態(tài)時蛋白質(zhì)重折疊過程，具有重要的抗凋亡與抗氧化作用[4]，近年來關(guān)于HSPB1在心血管疾病中的作用有較多報道，而HSPB1在主動脈夾層中的作用與機制仍知之甚少。因此，本研究旨在探討HSPB1在主動脈夾層患者主動脈壁中的表達情況，以期進一步明確其在主動脈夾層發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

40%甲醛溶液、二甲苯、無水乙醇、七水硫酸鎂、碳酸氫鈉、三氯甲烷、異丙醇、氯化鈉、乙二胺四乙酸、乙酸鈉、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲醇、濃鹽酸、氟化鈉、正釩酸鈉均購自國藥集團；石蠟購自上海佩歐生物科技有限公司；蘇木精染液購自谷歌生物科技有限公司；伊紅溶液、超凈封片劑、彈性纖維EVG染色液購自貝索生物技術(shù)有限公司；Scott藍化液購自上海信帆生物科技有限公司。RNA提取試劑Trizol溶液購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；DEPC水購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LightCycler?480 SYBR GreenⅠMaster熒光定量PCR試劑盒、蛋白酶抑制劑cocktail、磷酸酶抑制劑PhosStop購自Roche公司；人源HSPB1定量引物及內(nèi)參基因18S rRNA定量引物購自武漢擎科生物科技有限公司；Tris-base購自武漢飛羿科技有限公司；Triton X-100、甘油、Coomassice Brilliant Blue G250、酚紅、二硫蘇糖醇(DTT)、30%聚丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、疊氮鈉、牛血清白蛋白、Tween-20購自美國Sigma-Aldrich公司；RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)購自武漢安特捷生物有限公司；Tris-HCl購自SAFC Biosciences公司；十二烷基硫酸鋰(LDS)購自北京沃凱生物科技有限公司；脫脂奶粉購自福州飛凈生物科技有限公司；PVDF膜購自Millipore公司；PMSF蛋白酶抑制劑、蛋白免疫印跡顯影液、HSPB1抗體購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；蛋白質(zhì)電泳Marker及BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific Pierce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本及臨床資料的采集 本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，13例主動脈夾層的主動脈壁標本均來自CTA明確診斷為Stanford A型主動脈夾層患者主動脈置換術(shù)后的主動脈標本。11例無夾層的主動脈壁標本來源于終末期擴張型心肌病或冠心病心臟移植患者，合并馬凡氏綜合征、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、創(chuàng)傷性或醫(yī)源性主動脈夾層等均不納入本研究。采集主動脈夾層患者及無夾層對照組入院時的基本臨床資料，通過主動脈CTA檢查測量主動脈夾層患者主動脈(主動脈弓、升主動脈、胸主動脈、腹主動脈)直徑。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色(HE染色) 取得的主動脈壁標本經(jīng)10%多聚甲醛溶液固定48 h，主動脈組織經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋等處理后，將組織切成5 μm厚的切片進行病理學檢測。將切片置于65℃烘箱烤片30 min，使組織切片與玻片貼合緊密，隨后進行脫蠟與水合。水合結(jié)束后，將玻片置入蘇木精工作液孵育30 s，進行細胞核染色。利用1%鹽酸乙醇分化5 s，自來水沖洗后放入Scott藍化液中返藍，放入伊紅溶液中孵育1 min，進行細胞質(zhì)染色。梯度乙醇脫水，超凈封片劑封片。采用正置光學顯微鏡進行拍照，并分析結(jié)果。

1.2.3 EVG彈性纖維染色 烤片、脫蠟及水合步驟與上述HE染色步驟相同。水合結(jié)束后向切片滴加高錳酸鉀溶液，反應3 min進行高錳酸鉀氧化，隨后放入蒸餾水中漂洗5 min。滴加草酸溶液，反應3 min進行草酸漂白，蒸餾水中漂洗5 min。95%乙醇溶液中浸泡30 s，常溫避光24 h，將玻片放入Elastin染液中浸染。95%乙醇溶液中浸泡2次，每次浸泡2 min，自來水沖洗5 min，蒸餾水中漂洗1 min。滴加Van Gieson染液，反應1 min后進行脫水，95%乙醇溶液中浸泡1 min，100%乙醇溶液中浸泡3次，每次浸泡1 min，二甲苯溶液中浸泡3次，每次浸泡2 min。最后利用超凈封片劑進行封片，拍照后分析結(jié)果。

1.2.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 每例主動脈壁樣本取50 mg進行RNA提取，采用Trizol法提取總mRNA。向裝有主動脈組織的離心管中加入1 mL Trizol溶液，充分研磨后將組織勻漿液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入200 μL三氯甲烷，用力搖晃后室溫靜置5 min，4℃ 12000×g離心15 min。將離心后的上層水相溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500 μL異丙醇離心去上清，加入1 mL 75%乙醇溶液(用DEPC水配制)充分漂洗RNA沉淀，離心，去上清，將離心管內(nèi)的溶液用電槍吸凈，隨后進行風干。風干后，每管加入100 μL DEPC水溶解RNA。提取結(jié)束后利用NanoDrop 2000C超微量分光光度計檢測RNA濃度。每管取2 μg總RNA利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，利用LightCycler?480 SYBR GreenⅠMaster熒光定量PCR試劑盒進行RT-PCR實驗，通過實時熒光定量PCR儀檢測主動脈組織中HSPB1 mRNA表達水平。HSPB1的上游引物為：5′-CAGTCCAACGAGATCACCATC-3′，下游引物為：5′-CAGTCTCATCGGATTTTGCAG-3′；內(nèi)參基因18S rRNA的上游引物為：5′-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3′，下游引物為：5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗 每份主動脈壁標本取500 mg提取蛋白。向裝有主動脈組織的離心管中加入300 μL RIPA混合裂解液。充分研磨后，4℃ 12000×g離心15 min。將蛋白上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。利用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，向蛋白樣品中加入DTT溶液和LDS loading buffer調(diào)整蛋白濃度至相同水平。將蛋白樣品放于95℃恒溫金屬浴中加熱1 min，12000×g離心1 min，隨后進行蛋白電泳。向預先配制好的10%SDS-PAGE凝膠泳道中加入相同體積的蛋白樣品，80 V電泳30 min，120 V電泳至溴酚藍跑至膠底。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜(260 mA，60 min)，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。TBST溶液清洗3次，每次5 min，4℃孵育一抗過夜。TBST溶液清洗3次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h。TBST溶液清洗后，利用Image Lab凝膠成像系統(tǒng)進行顯影，采集結(jié)果并使用Image Lab分析軟件進行蛋白表達相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 主動脈夾層患者與對照組臨床資料及影像學結(jié)果對比

主動脈夾層患者有13例，均為Stanford A型主動脈夾層，對照組有11例。所有入選患者的臨床資料如表1所示，主動脈夾層患者高血壓的發(fā)病率更高，其他基本資料差異無統(tǒng)計學意義。主動脈夾層患者主動脈弓直徑為(35.7±4.8)mm，升主動脈直徑為(46.9±7.3)mm，胸主動脈直徑為(33.2±4.2)mm，腹主動脈直徑為(24.3±3.6)mm。主動脈夾層患者胸腹主動脈CTA影像檢查及三維重建結(jié)果顯示升主動脈、主動脈弓部及胸主動脈有明顯的內(nèi)膜片及假腔形成(圖1)。

表1 主動脈夾層患者與對照組臨床資料對比Table 1 Clinical data of AD patients and control group

A：主動脈夾層患者胸腹主動脈CTA檢查；B：主動脈夾層患者主動脈三維重建圖1 主動脈夾層患者影像學檢查結(jié)果Fig.1 Imaging examination results of AD patients

2.2 主動脈夾層患者與對照組主動脈病理學染色結(jié)果比較

主動脈壁HE染色結(jié)果顯示，在對照組中，主動脈壁結(jié)構(gòu)規(guī)整，平滑肌細胞形態(tài)正常，排列緊密，而主動脈夾層患者主動脈中膜結(jié)構(gòu)排列紊亂，平滑肌細胞出現(xiàn)退行性改變(圖2A)。EVG彈性纖維染色結(jié)果顯示，對照組主動脈壁彈性纖維結(jié)構(gòu)完整，排列有序，而主動脈夾層患者主動脈壁中彈性纖維斷裂明顯且伴有數(shù)量的減少(圖2B)。

A：主動脈HE染色結(jié)果；B：主動脈EVG彈性纖維染色結(jié)果圖2 對照組與主動脈夾層患者主動脈HE與EVG彈性纖維染色結(jié)果Fig.2 HE and EVG staining of aortas in control group and AD patients

2.3 主動脈HSPB1表達水平及與主動脈直徑的相關(guān)性

qRT-PCR實驗和Western blot實驗結(jié)果提示，主動脈夾層患者主動脈壁中的HSPB1 mRNA及蛋白表達水平顯著低于對照組，mRNA與蛋白分別約為對照組的28%與57%(圖3A、3B)，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，主動脈夾層患者HSPB1的mRNA表達水平與主動脈直徑無明顯相關(guān)性(圖3C)。

A：對照組與主動脈夾層患者主動脈HSPB1 mRNA表達水平；B：對照組與主動脈夾層患者主動脈HSPB1蛋白表達水平及蛋白定量；C：主動脈夾層患者主動脈直徑與HSPB1 mRNA表達水平相關(guān)性分析；*P<0.05圖3 對照組與主動脈夾層患者主動脈HSPB1表達水平與相關(guān)性分析Fig.3 HSPB1 mRNA and protein expression level of aortas in control group and AD patients and correlation analysis between HSPB1 mRNA expression level and aortic diameter

3 討論

主動脈夾層是一種極為兇險的急危重癥，A型主動脈夾層患者在發(fā)病48 h內(nèi)死亡率高達50%[5]。因此，進一步闡明主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的分子機制，對主動脈夾層的防治具有重要的臨床意義。HSPB1屬于熱休克蛋白分子家族中的一員，是一種非ATP依賴性的蛋白分子伴侶，主要參與細胞穩(wěn)態(tài)的維持，抑制細胞衰老以及抗氧化應激等過程[6-7]。關(guān)于HSPB1在心血管疾病中的研究結(jié)果顯示，小鼠心肌梗死的心臟組織中HSPB1 mRNA與蛋白表達水平均明顯升高，心臟特異性的HSPB1基因敲除能促進心肌梗死后白細胞的滲出，增強炎性細胞因子的表達以及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，進而導致心臟重構(gòu)[8]。另外，心臟特異性的HSPB1過表達能下調(diào)衰老小鼠心臟組織中衰老標志分子p53與p16的表達，降低衰老心臟組織中活性氧含量以及LC3-Ⅱ與p62的激活，抑制心臟組織纖維化，促進線粒體自噬激活，進而抑制心肌老化誘導的心功能減弱[9]。然而，HSPB1在主動脈夾層病變中是否發(fā)揮作用尚未見文獻報道。

本研究揭示了主動脈夾層患者主動脈中HSPB1 mRNA與蛋白表達水平顯著下調(diào)，并且下調(diào)的HSPB1 mRNA表達與患者主動脈直徑無明顯相關(guān)性，表明HSPB1 mRNA表達水平的降低與患者主動脈夾層的發(fā)生有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，氧化應激在主動脈夾層的病變過程中具有重要作用。比如，Liao等[10]的研究提示，主動脈夾層患者主動脈中膜抗氧化蛋白超氧化物歧化酶(SOD)蛋白表達水平顯著降低，脂質(zhì)過氧化物丙二醛水平顯著增加。同時，熊去氧膽酸能通過抑制氧化應激誘導的血管平滑肌細胞的凋亡從而抑制急性主動脈夾層的形成[11]。此外，國內(nèi)學者的研究發(fā)現(xiàn)巰基乙醇能抑制主動脈的氧化應激、炎癥反應，并促進細胞外基質(zhì)信號通路激活，從而抑制主動脈夾層的形成[12]。以上研究均提示氧化應激在主動脈夾層形成過程中具有重要調(diào)控作用。目前，HSPB1主要作為一種蛋白分子伴侶發(fā)揮抗氧化應激的作用，本研究中我們發(fā)現(xiàn)主動脈夾層患者主動脈中HSPB1 mRNA與蛋白表達水平發(fā)生下調(diào)，HSPB1表達水平的下調(diào)可能進一步導致其抗氧化應激能力減弱，進而誘發(fā)主動脈夾層的發(fā)生。

綜上所述，本研究探究了HSPB1在主動脈夾層中的表達變化，揭示了HSPB1 mRNA下調(diào)與主動脈夾層患者主動脈壁直徑無明顯相關(guān)性，提示HSPB1可能參與主動脈夾層的發(fā)生，為主動脈夾層發(fā)病的機制探索提供了分子水平的依據(jù)。然而，導致HSPB1 mRNA與蛋白表達水平下調(diào)的機制以及HSPB1在主動脈夾層中發(fā)揮作用的確切分子機制還有待于進一步研究。