狼瘡性腎炎腎組織中β-catenin、TIMP-1 mRNA和蛋白的表達水平與預后關系研究

蒲改元，郭萌，王明浩

通用環(huán)球中鐵華州醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西 渭南 714100

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種由自身抗體、免疫復合物或細胞因子作用引起的自身免疫性疾病，其發(fā)病率女性高于男性。系統(tǒng)性紅斑狼瘡涉及多種器官損害，其中腎臟是最常見累及器官。當系統(tǒng)性紅斑狼瘡累及腎臟時可導致患者并發(fā)狼瘡性腎炎。遺傳、性激素、環(huán)境、感染、免疫反應等均可誘導狼瘡性腎炎發(fā)生[1]。Dinesh等研究表明，β-連環(huán)素(β-catenin)在類風濕性關節(jié)炎風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞中表達顯著升高，可促進疾病進展[2]。盧珍梅等[3]研究報道，金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)在免疫性腦脊髓炎中表達上調(diào)，可能通過促進巨噬細胞分泌炎癥因子，促進疾病發(fā)展。另有研究證實，下調(diào)TIMP-1表達可改善免疫性肝纖維化[4]。由于β-catenin和TIMP-1表達水平與狼瘡性腎炎患者預后關系未有研究，本研究通過檢測狼瘡性腎炎腎組織中β-catenin、TIMP-1 mRNA和蛋白表達水平，分析兩者與狼瘡性腎炎與患者預后關系，探究兩者在狼瘡性腎炎疾病進展中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月至2018年6月通用環(huán)球中鐵華州醫(yī)院腎內(nèi)科收治的狼瘡性腎炎患者96例(觀察組)，收集其腎活檢組織，其中男性22例，女性74例；年齡25～51歲，平均(32.54±11.18)歲。根據(jù)國際腎臟病學會和腎臟病理學會病理分型標準[5]分為Ⅱ型23例，Ⅲ型36例，Ⅳ～Ⅴ37例；根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度(systemic lupus erythematosus disease activity，SLEDAI)評分表分為＞9分61例，≤9分35例。納入標準：①根據(jù)診斷標準及腎組織切片活檢，確診為狼瘡性腎炎；②臨床及隨訪資料完整。排除標準：①入組前接受過激素治療；②合并膜性病變；③合并患有原發(fā)性心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟等疾病。另選取本院收治的96例腎腫瘤患者距病灶＞2 cm以上的正常腎組織為對照組，對照組患者未合并高血壓、糖尿病，其中男性19例，女性77例；年齡24～76歲，平均(31.72±10.85)歲。兩組患者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 熒光定量PCR儀(7500 Fast，美國ABI公司)，熒光定量PCR試劑盒(貨號：RR820A，日本TaKaRa公司)，免疫組織化學染色試劑盒(貨號：JM3920，上海優(yōu)予生物科技有限公司)，總RNA提取試劑盒(貨號：RP2401，北京百泰克生物技術有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：K1622，美國Thermo公司)，兔抗人β-catenin多克隆抗體(貨號：ABP0188，亞科因生物技術有限公司)，兔抗人TIMP-1多克隆抗體(貨號：E-AB-33105，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，羊抗兔IgG二抗(貨號：SSA004，北京澤平科技有限責任公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 觀察組患者在進行腎活檢時收集腎組織，對照組于術中收集正常腎組織。一部分液氮迅速冷凍后于-80℃保存，用于實時熒光定量PCR實驗；另一部分制成石蠟切片，用于免疫組織化學染色。需保證每個腎組織切片中至少有8個腎小球。

1.3.2 實時熒光定量PCR法檢測β-catenin、TIMP-1 mRNA表達水平Trizol法提取總RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，于-20℃保存，用于實時熒光定量PCR實驗。反應體系(20μL)如下：2μL上游引物，2μL下游引物，2μL cDNA，10μL SYBR Primix ExTaq，0.4μL ROX DyeⅡ，6μL無酶水。反應步驟如下：①95℃，30 s，1個循環(huán)。②95℃，5 s；62℃，31 s，40個循環(huán)。一個樣品三次重復，采用2-△△CT法計算β-catenin、TIMP-1 mRNA相對表達量。以GAPDH為內(nèi)參基因，所用引物如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3.3 免疫組織化學染色法檢測β-catenin、TIMP-1蛋白表達水平 采用免疫組織化學染色法檢測β-catenin、TIMP-1蛋白表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，實驗最終所得切片在400倍顯微鏡下觀察，并采集圖象資料。

1.4 染色結(jié)果評分標準 細胞膜、細胞質(zhì)中呈棕黃色或棕褐色為β-catenin、TIMP-1陽性細胞，分別根據(jù)陽性細胞百分比和染色強度評分。陽性細胞百分比：＜5%、5%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別為0、1、2、3、4分。染色強度：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3分。兩種記分相乘，0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(＋)；5～8分為陽性(++)；9～12分為強陽性(+++)。(-)、(+)為低表達；(++)、(+++)為高表達。

1.5 隨訪 本研究入組患者經(jīng)治療出院后，以復查或電話形式隨訪2年，每3個月1次，隨訪至2020年6月截止。隨訪期間觀察并記錄患者腎存活率，并于第6個月記錄患者是否獲完全緩解。完全緩解定義為：血漿肌酐(SCr)正?；蛏吡俊芑A值的30%，尿蛋白定量＜0.4 g/d，Alb≥35 g/L。SCr倍增殖與基線值比較，SCr持續(xù)升高1倍以上。終末期腎病指SCr持續(xù)(≥3個月)超過530.4μmol/L，或需腎臟替代治療[7]。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier曲線分析其與狼瘡性腎炎患者預后關系，采用Logistic法分析影響狼瘡性腎炎患者不良預后的危險因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的β-catenin、TIMP-1蛋白表達水平比較β-catenin主要在細胞膜和細胞質(zhì)中表達，TIMP-1主要在細胞質(zhì)中表達。狼瘡性腎炎患者腎組織中β-catenin、TIMP-1蛋白高表達率分別為69.79%、73.96%，明顯高于對照組的35.42%、40.63%，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2和圖1。

表2 兩組患者的β-catenin、TIMP-1蛋白表達水平比較（例）

圖1 兩組患者的β-catenin、TIMP-1蛋白表達水平(400×)

2.2 兩組患者的β-catenin、TIMP-1 mRNA表達水平比較 觀察組患者腎組織中β-catenin、TIMP-1 mRNA表達水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 兩組患者的β-catenin、TIMP-1 mRNA表達水平比較(±s)

表3 兩組患者的β-catenin、TIMP-1 mRNA表達水平比較(±s)

組別觀察組對照組t值P值例數(shù)96 96 β-catenin 6.57±2.14 1.03±0.32 25.086 0.001 TIMP-1 2.84±0.73 1.01±0.29 22.827 0.001

2.3 腎組織中β-catenin、TIMP-1蛋白水平與狼瘡性腎炎患者臨床特征的關系 腎組織中β-catenin、TIMP-1蛋白水平與狼瘡性腎炎患者的性別、年齡無關(P＞0.05)。β-catenin、TIMP-1蛋白高表達患者隨病理分型和SLEDAI評分增加而增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

2.4 不同β-catenin、TIMP-1蛋白表達水平狼瘡性腎炎患者的預后比較β-catenin、TIMP-1高表達組患者6個月內(nèi)獲完全緩解、2年腎存活比例明顯低于β-catenin、TIMP-1低表達組患者，而腎功能惡化、SCr倍增比例明顯高于β-catenin、TIMP-1低表達組患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表5、表6。

2.5 影響狼瘡性腎炎患者不良預后的危險因素 以Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Ⅳ-Ⅴ型狼瘡性腎炎、β-catenin高表達和TIMP-1高表達是影響狼瘡性腎炎患者不良預后危險因素(P＜0.05)，見表7。

表4 腎組織中β-catenin、TIMP-1蛋白水平與狼瘡性腎炎患者臨床特征的關系(例)

表5 不同β-catenin蛋白表達水平狼瘡性腎炎患者的預后比較[例(%)]

表6 不同TIMP-1蛋白表達水平狼瘡性腎炎患者的預后比較[例(%)]

表7 影響狼瘡性腎炎患者不良預后的危險因素

3 討論

狼瘡性腎炎患者會出現(xiàn)高血壓、血尿、腎功能下降，也會出現(xiàn)腎功能衰竭，最終發(fā)展為終末期腎病，導致患者死亡[6-7]。探尋狼瘡性腎炎預后標志物，對及時評估病情進展及改善患者預后有一定幫助。

β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，主要作為黏附因子調(diào)控細胞間信號轉(zhuǎn)導。BRADFORD等[8]研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在潰瘍性結(jié)腸炎組織中高表達，下調(diào)β-catenin表達可通過減少腸道祖細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，抑制炎癥進展。本研究結(jié)果顯示，觀察組腎組織中β-catenin mRNA表達水平及蛋白高表達率均顯著高于對照組，與β-catenin在潰瘍性結(jié)腸炎中表達結(jié)果相似，提示β-catenin可能與狼瘡性腎炎發(fā)生發(fā)展有關。腎纖維化是狼瘡性腎炎患者主要臨床特征[9]，WANG等[10]研究表明，β-catenin在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用，抑制其表達可有效控制腎纖維化發(fā)生。ALI等[11]在腎缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，β-catenin可能與炎癥因子相互作用，影響腎損傷發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，β-catenin蛋白高表達患者隨病理分型和SLEDAI評分增加而增多，提示β-catenin可能通過調(diào)控炎癥因子水平，影響腎纖維化過程，參與狼瘡性腎炎進展。

TIMP-1與細胞增殖和轉(zhuǎn)移有關。銀屑病是一種由免疫異常引起的炎癥性皮膚病。有研究表明，TIMP-1在銀屑病患者血清中表達水平明顯高于非銀屑病患者，與銀屑病進展中炎癥介質(zhì)調(diào)控通路有關[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，觀察組腎組織中TIMP-1 mRNA及蛋白高表達率顯著升高，與Amezcuaguerra在銀屑病中研究結(jié)果一致，提示TIMP-1可能參與狼瘡性腎炎進展。DONG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1可通過促進肺成纖維細胞的增殖引起肺纖維化，影響肺損傷發(fā)生發(fā)展。有研究證實，糖尿病腎病中TIMP-1通過參與腎纖維化調(diào)控疾病進展[14]。WU等[15]研究表明，IL-33可通過調(diào)控TIMP-1在肺纖維化進程中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1蛋白表達水平與狼瘡性腎炎病理分型和SLEDAI評分有關，提示TIMP-1可能通過與炎癥因子相互作用，影響腎纖維化，調(diào)控狼瘡性腎炎發(fā)生發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與β-catenin、TIMP-1低表達組患者相比，β-catenin、TIMP-1高表達患者6個月內(nèi)獲完全緩解、2年腎存活比例均明顯降低，腎功能惡化、SCr倍增比例明顯升高，提示β-catenin、TIMP-1高表達可能影響狼瘡性腎炎6個月內(nèi)完全緩解率、患者腎存活率及腎功能惡化等。且Ⅳ～Ⅴ型狼瘡性腎炎、β-catenin高表達和TIMP-1高表達是影響狼瘡性腎炎患者不良預后危險因素，提示β-catenin和TIMP-1可能作為生物標志物，用于評估狼瘡性腎炎患者病情及預后情況但具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，狼瘡性腎炎患者腎組織中β-catenin、TIMP-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于正常腎組織，與患者高病理分型、高SLEDAI評分及患者不良預后有關，可以作為預后標志物，為臨床治療方案確定及患者預后改善提供一定幫助。但由于本研究方法較為基礎且樣本量較少，具體機制尚需大量實驗進一步探究驗證。