塞舌爾角毛藻的形態(tài)學(xué)再描述和分子系統(tǒng)學(xué)分析

牛彪彪, 翟夢(mèng)怡, 李揚(yáng)

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510631

角毛藻屬(ChaetocerosEhrenberg)是海洋浮游硅藻中物種多樣性最為豐富的大屬之一, 廣泛分布于全球海域(Tomas et al, 1997)。依據(jù)角毛中是否含有色素體可劃分為兩個(gè)亞屬: 有色角毛藻亞屬Phaeoceros和無(wú)色角毛藻亞屬Hyalochaete(Hernández-Becerril,1996)。角毛藻是海洋浮游植物的優(yōu)勢(shì)類群(Tomas et al, 1997; Shevchenko et al, 2006), 也是重要的藻華生物(Tomas et al, 1997)。

塞舌爾角毛藻(C. seychellarusG.Karsten)隸屬于有色角毛藻亞屬, 是全球罕見(jiàn)種, 最初報(bào)道于印度洋(Karsten, 1907), 此后多年未見(jiàn)報(bào)道, 而近二三十年來(lái)在北美加利福尼亞沿岸、墨西哥灣以及印度洋開始有零星報(bào)道(Hernández-Becerril, 1993; Hernández-Becerril et al, 1998)。韓國(guó)近年亦曾有報(bào)道, 該報(bào)道中研究者利用光鏡在自然樣品中觀察到了少數(shù)群體,所提供的有效形態(tài)特征相對(duì)有限(Lee, 2011)。以往對(duì)于塞舌爾角毛藻的認(rèn)知多限于普通光學(xué)顯微鏡觀察, 因而對(duì)其形態(tài)學(xué)了解得不夠全面, 導(dǎo)致在分類學(xué)上出現(xiàn)爭(zhēng)議, 如塞舌爾角毛藻與金色角毛藻是否為同種異名(Taylor, 1966)的問(wèn)題。對(duì)于塞舌爾角毛藻在系統(tǒng)學(xué)劃分上也存在一些疑問(wèn), 有學(xué)者將塞舌爾角毛藻歸入北方組SectionBorealia(Taylor, 1966),也有學(xué)者將其單獨(dú)成組, 并命名為塞舌爾組SectionSeychellari(Hernández-Becerrilet al, 2001)。

為全面界定塞舌爾角毛藻的物種信息, 本文從臺(tái)灣海峽和海南島三亞海域分離并建立了單克隆培養(yǎng)株系, 利用光鏡和掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)進(jìn)行了較為詳盡的形態(tài)學(xué)觀察,首次擴(kuò)增了該種的核糖體大亞基D1～D3區(qū)序列, 構(gòu)建并分析了其分子系統(tǒng)樹。相關(guān)研究成果豐富了我國(guó)海洋硅藻的分類學(xué)資料, 也為硅藻系統(tǒng)學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

通過(guò)搭載國(guó)家自然科學(xué)基金委2016年度臺(tái)灣海峽春季共享航次, 采集了浮游植物活體樣品, 此外在海南島三亞海域也開展了相關(guān)樣品的采集。采樣時(shí), 使用浮游植物網(wǎng)(孔徑10μm)進(jìn)行水平拖網(wǎng),并同步記錄水溫、鹽度等水文參數(shù), 回到實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行目標(biāo)藻株的分離、純化和擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 單克隆培養(yǎng)株系的建立

利用毛細(xì)玻璃管分離法在生物倒置顯微鏡(Mshot MI-12)下挑取目標(biāo)藻細(xì)胞, 經(jīng)多次復(fù)洗后快速轉(zhuǎn)移至滴有L1培養(yǎng)液的48孔培養(yǎng)板內(nèi), 待其存活并繁殖達(dá)到100個(gè)細(xì)胞, 再轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。藻株保存于光照培養(yǎng)室內(nèi), 培養(yǎng)條件是恒溫22±2℃、光暗周期比12∶12, 光照強(qiáng)度約50～80μmol·m-2·s-1。建立的塞舌爾角毛藻培養(yǎng)株系共5個(gè), 詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 塞舌爾角毛藻培養(yǎng)藻株信息Tab. 1 Information of monoclonal strains used in this study

1.3 休眠孢子的誘導(dǎo)

在上述培養(yǎng)條件下, 分別吸取5mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液, 轉(zhuǎn)移到100mL三角瓶中, 以L1培養(yǎng)液(缺氮)誘導(dǎo)休眠孢子(Kooistra et al, 2010)。每個(gè)藻株均誘導(dǎo) 3 次以上, 每次誘導(dǎo)時(shí)間持續(xù)兩周, 期間觀察休眠孢子的產(chǎn)生。

1.4 形態(tài)學(xué)特征的觀察

光鏡觀察: 取5μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液, 置于載玻片上, 壓片后在顯微鏡(Olympus BX53)下進(jìn)行微分干涉(differential interference contrast, DIC)觀察, 并使用Olympus DP27數(shù)碼相機(jī)記錄其形態(tài)特征。

掃描電鏡觀察: 取3mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液,加入等體積濃硫酸(＞95%), 酸化10min, 以去除有機(jī)質(zhì), 用滅菌雙蒸水(ddH2O)多次洗滌至中性。將藻細(xì)胞過(guò)濾到濾膜上, 放置在避光干燥處待其晾干后,利用碳導(dǎo)電膠貼于SEM樣品臺(tái), 噴金后置于掃描電鏡(Zeiss Ultra 55)下觀察和記錄其形態(tài)特征。

1.5 分子系統(tǒng)學(xué)研究

利用離心法收集藻細(xì)胞, 提取總DNA, 擴(kuò)增核糖體大亞基基因D1～D3區(qū)(Lundholm et al, 2002; Xu et al, 2020)。LSU rDNA引物為D1R-F(5’-ACC CGC TGA ATT TAA GCA TA-3’)和D3B-R (5’-TCG GAG GGA ACC AGC TAC TA-3’)。采用50μL的PCR反應(yīng)體系: 25μL的PCR Mix, 正、反向引物各1μL,21μL滅菌ddH2O和 2μL目標(biāo)藻株總DNA。擴(kuò)增條件為: 首先94℃預(yù)變性5min; 然后進(jìn)行如下36個(gè)循環(huán): 94℃變性30s, 56℃復(fù)性30s, 72℃延伸45s; 之后72℃再延伸7min。PCR產(chǎn)物于4℃保存, 并送往華大基因公司(The Beijing Genomics Institute, BGI)進(jìn)行測(cè)序。從美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載角毛藻物種的 LSU nrDNA序列, 運(yùn)用BioEdit軟件進(jìn)行比對(duì)和矩陣分析(Nylander, 2004)?；贛rModeltest 2.3選擇最適模型, 分別用RAxML-HPC2(Miller et al, 2010)和MrBayes 3.2(Ronquist et al, 2012)構(gòu)建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯推理樹(Bayesian Inference, BI)。選用冕孢角毛藻C.diadema(EF42 3433)作為群外對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 塞舌爾角毛藻的形態(tài)學(xué)描述Chaetoceros seychellarusG.Kasten

Kasten, 1907: 987, Fig.4a～e; Hustedt, 1920: Pl.327, Fig.12～13; Hendey, 1937: 296; Simonsen, 1974:32; Hernández-Becerril, 1993: 121, Fig.16～27;Hernández-Becerril et al, 2001: 400, Fig.1～15.

根據(jù)鏡下顯示(圖1), 塞舌爾角毛藻細(xì)胞鏈直、粗壯, 常形成6～23個(gè)細(xì)胞不等的長(zhǎng)鏈(圖1a), 也有單細(xì)胞(圖1c)。細(xì)胞和角毛內(nèi)散布有數(shù)量眾多的顆粒狀色素體(圖1a、1c—f)。細(xì)胞寬環(huán)面觀為矩形, 殼面長(zhǎng)軸短于貫殼軸, 殼面長(zhǎng)軸介于12.85～14.73μm(中位值±標(biāo)準(zhǔn)差: 13.15±0.60μm), 貫殼軸高 20.51～45.51μm (中位值±標(biāo)準(zhǔn)差:28.55±6.27μm)。窗孔呈矩形(圖 1e、1f), 高2.56～4.61μm(中位值±標(biāo)準(zhǔn)差: 3.22±0.73μm)。殼套較高, 高度大于貫殼軸的三分之一, 與環(huán)帶相接處有明顯凹溝(圖1d—f、1i、1j)。角毛粗壯, 殼面觀時(shí)角毛長(zhǎng)度較為一致, 向四周呈輻射狀(圖1b)。殼面和殼套上布滿細(xì)小孔紋(圖1g—i), 殼面孔紋散布, 角毛基部孔紋明顯密集(圖1h)。殼面呈圓形或近圓形(圖1h)。

圖1 塞舌爾角毛藻(株系編號(hào): MC2054)a. 群體環(huán)面觀; b. 群體殼面觀; c. 單細(xì)胞; d. 上殼面; e. 下殼面; f. 鏈中細(xì)胞(箭頭指示殼套與環(huán)帶連接處); g. 鏈中相鄰殼面(箭頭指示唇形突); h. 內(nèi)殼面觀; i. 上殼面; j. 下殼面; k、l. 角毛; m. 角毛截面Fig.1 Chaetoceros seychellarus (MC2054). a: Chain in girdle view; b: chain in valve view; c: solitary cell; d: terminal anterior valve; e:terminal posterior valve; f: intercalary cells and arrows showing connection between mantle and bands; g: sibling valves and arrows showing two rimoportulae; h: valve; i: terminal anterior valve; j: terminal posterior valve; k-l: setae structure; and m: setae section

鏈中角毛相交于基部, 融合后向外延伸, 末端向鏈端彎曲(圖1a、1e、1f)。鏈狀群體的兩個(gè)鏈端殼面形態(tài)不同(圖1a、1d、1e), 上殼面角毛先向殼面中心延伸, 彼此相交之后再分離(圖1a、1d、1i), 下殼面角毛不相交, 從殼面伸出即向兩側(cè)延伸(圖1a、1e、1j)。單細(xì)胞兩個(gè)殼面亦為異形(圖1c)。角毛呈四棱形(圖1m), 每條棱上分布有箭頭狀的刺, 大小介于0.70～3.00μm(中位值±標(biāo)準(zhǔn)差: 1.74±0.59μm),密 度 為 0.121～0.166 個(gè)·μm-1(中 位 值±標(biāo) 準(zhǔn) 差:0.150±0.118個(gè)·μm-1)。角毛上有兩種孔紋, 一種是沿著角毛徑向排列的大孔, 密度為0.574～0.890個(gè)·μm-1(中位值±標(biāo)準(zhǔn)差: 0.739±0.092個(gè)·μm-1); 另外一種是橫向排列的小孔, 密度為6.3～9.3個(gè)·μm-1(中位值±標(biāo)準(zhǔn)差: 7.6±1.2個(gè)·μm-1) (圖1k、1l)。

每個(gè)殼面均有兩個(gè)唇形突, 在殼面短軸兩側(cè)呈對(duì)稱分布(圖1g、1h)。其在外殼面具有短的外管, 末端呈嘴唇狀結(jié)構(gòu)(圖1g、1i); 而在內(nèi)殼面上則為裂縫狀, 呈“工”字形(圖1h)。

未見(jiàn)休眠孢子。

2.2 塞舌爾角毛藻的生態(tài)分布

本文藻株采自我國(guó)臺(tái)灣海峽(117°48'36"E,22°42'38"N; 120°20'24"E, 25°33'00"N)與三亞海域(111°54'00"E, 19°45'94"N)。根據(jù)已有的研究報(bào)道,塞舌爾角毛藻分布于印度洋(Karsten, 1907)、北美加利福尼亞沿岸、墨西哥灣(Hernández-Becerril, 1993;Hernández-Becerril et al, 1998)和韓國(guó)沿海(Lee, 2011)等。塞舌爾角毛藻為罕見(jiàn)的暖水種(Hernández-Becerril et al, 2001), 因此主要分布在熱帶和亞熱帶海域。

2.3 基于LSU nrDNA部分序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹分析

使用NCBI的blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能, 檢索塞舌爾角毛藻鄰近物種的LSUnr DNA D1～D3區(qū)序列, 得到31條鄰近物種和外類群序列, 另外本文研究獲得1條塞舌爾角毛藻藻株序列, 因此共有32條序列用于最終的分子系統(tǒng)學(xué)分析?；诤颂求w大亞基DNA(LSU nrDNA)部分序列構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示, 兩者具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 其中ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在本文中展示(圖2)。

圖2 基于核糖體大亞基部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹斜杠左側(cè)值為BI, 右側(cè)值為ML, -表示BI值＜0.9或者M(jìn)L值＜80 Fig.2 Phylogenetic analysis inferred from LSU partial sequences

該分子系統(tǒng)樹與De luca等(2019)的報(bào)道一致,有色角毛藻亞屬的物種聚集在一個(gè)大的分支上, 反映出較好的單系起源(BI/ML=1.00/100)。塞舌爾角毛藻首先與丹麥角毛藻(C. danicus)聚在一起(BI/ML=1.00/81), 之后與扭曲角毛藻(C. convolutus)聚在一個(gè)分支(BI/ML=1.00/94)上, 說(shuō)明它們之間具有較近的遺傳關(guān)系。

3 討論

3.1 塞舌爾角毛藻的形態(tài)學(xué)研究

塞舌爾角毛藻的典型特征是鏈端殼面異形, 即上殼面與下殼面的特征不一致, 單細(xì)胞的上、下殼面亦為異形(圖1c), 這一特征也見(jiàn)于秘魯角毛藻(C.peruvianus)和均等角毛藻(C. aequatoralis) (Hernández-Becerril, 1993; Tomas et al, 1997; Hernández-Becerril et al, 2001)。此外, 本研究還觀察到另一新的形態(tài)學(xué)特征——鏈中角毛的走勢(shì)。當(dāng)從殼面觀察漂浮狀態(tài)群體時(shí), 角毛并非整齊地排列在兩側(cè), 而是以細(xì)胞為中心向四周呈放射狀(圖1b)。角毛走勢(shì)也是角毛藻物種鑒定的重要依據(jù)(Tomas et al, 1997; Hernández-Becerril et al, 2001), 角毛走勢(shì)作為物種鑒定依據(jù)在聚生角毛藻復(fù)合群(C. socialiscomplex)(Chamnansinp et al, 2013)和柔弱角毛藻復(fù)合群(C. debiliscomplex)(Xu et al, 2020)中已有成功應(yīng)用, 因此本文建議將鏈中角毛的走勢(shì)納入到塞舌爾角毛藻的識(shí)別特征中。

本文構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹顯示(圖2), 塞舌爾角毛藻與丹麥角毛藻具有最近的親緣關(guān)系, 它們也具有較多相似的形態(tài)特征, 如殼套較高、窗孔狹窄、殼套上有硅質(zhì)增厚帶等(Hernández-Becerril, 1993)。兩者之間的形態(tài)學(xué)差異主要在于: 1) 塞舌爾角毛藻可形成長(zhǎng)鏈狀群體, 也可單細(xì)胞生活(圖1c), 而丹麥角毛藻則常為單細(xì)胞生活, 偶見(jiàn)2～3個(gè)細(xì)胞的短鏈群體; 2) 塞舌爾角毛藻的鏈端殼面異形(圖1a、1d、1e、1i、1j), 丹麥角毛藻的鏈端殼面同形; 3) 塞舌爾角毛藻的每個(gè)殼面均具有兩個(gè)唇形突, 而丹麥角毛藻僅具有一個(gè)(Hernández-Becerril, 1996)。此外, 塞舌爾角毛藻的相似物種還有北方角毛藻和密連角毛藻, 上述形態(tài)學(xué)差異也同樣適用于塞舌爾角毛藻與后兩者之間的區(qū)別。

金色角毛藻(C. aurivillius)與塞舌爾角毛藻的形態(tài)特征基本一致, 尤其是鏈端殼面異形。學(xué)者們根據(jù)優(yōu)先原則認(rèn)為塞舌爾角毛藻是金色角毛藻的同種異名(Taylor et al, 1966; 郭玉潔 等, 2003), 同時(shí)兩者也具有細(xì)微的差異, 如塞舌爾角毛藻殼套和環(huán)帶相接處有凹溝(圖1d—f、1i、1j), 而金色角毛藻卻沒(méi)有。但是, 以往關(guān)于上述兩個(gè)物種的研究多以光鏡為觀察手段, 尤其是金色角毛藻, 其在電鏡下的超微形態(tài)特征至今未見(jiàn)報(bào)道, 有關(guān)其分子系統(tǒng)學(xué)的研究更是空白。因此有學(xué)者持保留觀點(diǎn), 認(rèn)為在獲得詳盡的形態(tài)特征之前, 仍將它們作為獨(dú)立的物種(Manguin, 1957; Hernández-Becerril et al, 2001)。本研究并未建立金色角毛藻培養(yǎng)株系, 故未獲得其形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù), 建議暫時(shí)仍將金色角毛藻與塞舌爾角毛藻作為兩個(gè)獨(dú)立物種, 待后續(xù)研究獲取充分的物種信息后再進(jìn)行分析。

3.2 塞舌爾角毛藻的系統(tǒng)學(xué)研究

根據(jù)形態(tài)特征, 有色角毛藻亞屬被劃分為7個(gè)組(section), 其中塞舌爾角毛藻被劃分到北方組SectionBorealia, 該組的典型特征是: 1) 細(xì)胞和角毛中含色素體; 2) 直鏈狀或單細(xì)胞生活; 3) 寬環(huán)面呈矩形; 4) 殼面呈橢圓形或圓形; 5) 角毛具刺和孔紋; 6) 窗孔狹窄; 7) 唇形突無(wú)明顯外管(Hernández-Becerril, 1996)。塞舌爾角毛藻也表現(xiàn)出上述典型特征。本文的分子系統(tǒng)學(xué)研究中, 引用了3個(gè)北方組物種: 塞舌爾角毛藻、丹麥角毛藻和卡氏角毛藻(C.castracanei), 分子系統(tǒng)樹顯示它們不在一個(gè)分支上。雖然塞舌爾角毛藻與丹麥角毛藻聚在一個(gè)分支上, 但是卡氏角毛藻(EF423453)卻位于另一個(gè)分支,兩分支之間被其他有色角毛藻亞屬的物種分割, 如大西洋角毛藻(C. atlanticus)和雙刺角毛藻(C.dichaeta)。根據(jù)系統(tǒng)樹顯示, 北方組并非單系起源,目前該組的劃分可能仍存在問(wèn)題, 后續(xù)需要引入更多的分子數(shù)據(jù)來(lái)加以完善和修訂。

鑒于塞舌爾角毛藻的每個(gè)殼面均具有兩個(gè)唇形突, 顯著區(qū)別于北方組的其他物種, Hernández-Becerril等(2001)建議將塞舌爾角毛藻單獨(dú)劃分為塞舌爾組(SectionSeychellari)。該組的典型特征為:1) 適中或較長(zhǎng)的鏈狀群體; 2) 鏈狀群體兩端細(xì)胞不同; 3) 窗孔為窄矩形狀; 4) 群體中每個(gè)殼面具有兩個(gè)唇形突, 對(duì)稱地位于殼面短軸末端, 相鄰殼面的唇形突位于相同位置(Hernández-Becerril et al, 2001)。根據(jù)本文構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示, 塞舌爾角毛藻與丹麥角毛藻相鄰, 表明兩者之間有較近的親緣關(guān)系。但是, 丹麥角毛藻并不具有上述特征,以往報(bào)道的北方組物種亦不具有上述特征, 因此本文認(rèn)為上述特征可能是塞舌爾角毛藻獨(dú)有的特征, 并非其隸屬小類群的共有特征, 因而不足以成為系統(tǒng)劃分的形態(tài)學(xué)依據(jù), 更為復(fù)雜的復(fù)合特征或許能夠解答它們之間的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。至于塞舌爾角毛藻是否應(yīng)該獨(dú)立成組, 目前尚不能給出結(jié)論, 后續(xù)還需要有色角毛藻亞屬物種更多分子數(shù)據(jù)的引入。