柚皮素通過(guò)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激和血管鈣化

周 芹，宋 艷，李金河，梁青春

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州 510080；3.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510630）

血管鈣化（vascular calcification）是常見(jiàn)的慢性腎臟病血管病變，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為血管鈣化僅僅是鈣磷礦物質(zhì)被動(dòng)沉積于血管壁的過(guò)程。但是，越來(lái)越多的研究報(bào)道：在血管鈣化過(guò)程中，大量的骨相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，改變基因的表達(dá)水平可影響血管鈣化的發(fā)展［1-3］，說(shuō)明血管鈣化是可調(diào)控的，治療血管鈣化成為可能。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致慢性腎臟病血管鈣化的關(guān)鍵因素［4-5］，抑制氧化應(yīng)激可成為干預(yù)血管鈣化的有效策略。血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是抑制氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，目前臨床上尚無(wú)誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)的藥物用來(lái)干預(yù)血管鈣化。柚皮素（Naringenin，NRG）是一種天然的黃酮類化合物，具有清除自由基和抗氧化的作用［6］。研究報(bào)道柚皮素可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管內(nèi)膜增生［7-8］，然而柚皮素對(duì)高磷高鈣誘導(dǎo)的血管鈣化是否有效尚不清楚。在本研究中，我們采用血管平滑肌細(xì)胞和血管環(huán)鈣化模型，研究NRG 對(duì)高磷高鈣誘導(dǎo)的血管鈣化的作用，并闡明HO-1 介導(dǎo)NRG 抑制血管鈣化的機(jī)制，為慢性腎臟病血管鈣化的防治提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清（FBS）、TRIzol、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；NRG、茜素紅、β-甘油磷酸、活性氧試劑盒購(gòu)自Sigma 公司；鈣檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京雷根生物公司；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、SYBR green 試劑盒購(gòu)自Ta‐KaRa 公司；Western blot 超敏發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

參考文獻(xiàn)［9-10］的方法，從雄性SD 大鼠（南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2011-0015）的胸主動(dòng)脈分離血管平滑肌細(xì)胞。使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞，代細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代。鈣化培養(yǎng)基（10 mmol∕L 的β-甘油磷酸+3 mmol∕L 的CaCl2）處理血管平滑肌細(xì)胞7 d誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化，普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。為了研究NRG對(duì)細(xì)胞鈣化的影響，在高磷高鈣的條件下，用不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）處理血管平滑肌細(xì)胞7 d。動(dòng)物的使用已獲中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 血管環(huán)組織培養(yǎng)和藥物處理

分離主動(dòng)脈血管環(huán)［11］，使用1%戊巴比妥鈉麻醉處死雄性SD 大鼠，暴露和分離胸主動(dòng)脈，用眼科剪將其剪成5 mm 左右長(zhǎng)的血管環(huán)，加入鈣化培養(yǎng)基，藥物處理組血管環(huán)加入不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）7 d 后，收集血管標(biāo)本檢測(cè)鈣化程度。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞鈣化

參考文獻(xiàn)［11-12］，采用茜素紅染色法檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞和血管環(huán)鈣化。將培養(yǎng)皿從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，放置室溫下，去除培養(yǎng)基，用PBS溶液洗3 次，加入40 g∕L 的多聚甲醛，固定細(xì)胞10 min，然后用去離子水洗培養(yǎng)皿，加入2%茜素紅（pH 4.2）溶液孵育5 min，加入去離子水洗去背景色，倒置顯微鏡下拍攝細(xì)胞。加入1 mL 甲酸液體，充分混勻后液體變成黃色，用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為405 nm處檢測(cè)吸光值。

1.5 檢測(cè)血管環(huán)鈣化

血管環(huán)茜素紅染色：用40 g∕L 的多聚甲醛固定動(dòng)脈環(huán)，使用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸泡血管環(huán)，包埋好血管環(huán)制成血管石蠟塊，將其切成5 μm 厚的組織切片，然后脫蠟水化，把切片組織浸泡在2%茜素紅溶液中孵育5 min，去除多余染色液，用中性樹(shù)膠封片保存，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 檢測(cè)鈣離子濃度

采用比色法檢測(cè)鈣離子濃度，參考鈣檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，先用預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞和血管組織，加入蛋白裂解液處理，然后低溫離心（3 000×g，4 ℃，3 min），將上清樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，將2.5 μL 的待測(cè)樣品和鈣標(biāo)準(zhǔn)品加入96 孔板中，配制鈣離子顯色工作液，每孔各加入200 μL 顯色液，室溫避光靜置孵育10 min，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)在610 nm處的吸光值。

1.7 活性氧水平檢測(cè)

采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，去除培養(yǎng)基，用PBS 溶液洗3 次，洗細(xì)胞后加入熒光染料二氫乙啶（dihy‐droethidium，DHE），37 ℃避光孵育30 min，然后用PBS清洗細(xì)胞，熒光顯微鏡下拍照。

1.8 熒光定量qPCR

將細(xì)胞培養(yǎng)基吸取丟棄，加入1 mL RNA 提取試劑TRIzol，參照試劑公司說(shuō)明提取血管平滑肌細(xì)胞總RNA。取1 μg mRNA，加入Takara PrimeScript RT試劑，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制20 μL PCR反應(yīng)體系：2×SYBR premix（10 μL），50× ROX Ref‐erence Dye Ⅱ（0.4 μL），Primer mix（0.4 μL），cD‐NA（1μL），ddH2O（8.2 μL），將PCR 反應(yīng)物混勻隨后放入Real Time PCR 儀上，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性15 s 和60 ℃退火延伸1 min（40 次循環(huán)）。所用的引物信息如下：βactin（forward）：TGTCACCAACTGGGACGATA，βactin（reverse）：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA；HO-1（forward）：TTCAGAAGGGTCAGGTGTCC，HO-1（reverse）：CTGTGTGGCTGGTGTGTAAG。采用β-actin為內(nèi)參基因，2ΔΔCt的方法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)量表達(dá)水平。

1.9 Western blot

加入蛋白裂解液提取血管平滑肌細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。蛋白樣品100 ℃加熱10 min 后蛋白質(zhì)充分變性。每孔上樣20 μg蛋白樣品，采用8% SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，TBST 洗膜3次，加入5%脫脂奶粉封閉液在室溫下孵育1 h。加入一抗HMOX-1 抗體（Proteintech，1：1 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，然后加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，加入超敏發(fā)光液ECL 試劑，將膜放入LAS 500發(fā)光成像儀內(nèi)曝光顯影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 軟件分析數(shù)據(jù)，兩組以上均值比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA）檢驗(yàn)，兩兩比較采用Turkey法。當(dāng)P＜0.05時(shí)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 NRG抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化

我們采用含高磷高鈣的鈣化培養(yǎng)基（calcifying medium，CM）誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化。為研究NRG 對(duì)高磷高鈣誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用，在CM 的條件下，不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞7 d。茜紅素染色結(jié)果顯示：普通培養(yǎng)基（Growth medium，GM）處理的細(xì)胞未見(jiàn)鈣化沉積，CM 組的血管平滑肌細(xì)胞鈣化明顯增強(qiáng)（圖1A）；使用不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）后，大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化程度減輕（圖1A），其中以濃度為20 μmol∕L 的NRG效果最為明顯。定量分析茜素紅染色結(jié)果顯示（方差分析的F=178.183，P=0.000 3）：與GM 組比較，CM組的細(xì)胞鈣化明顯增強(qiáng)（圖1B，P=0.000 02）；與CM 組比較，NRG 處理組的細(xì)胞鈣化程度明顯減輕（圖1B，P＜0.001）。另外，不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）都能降低細(xì)胞鈣離子濃度（圖1C，P＜0.001），20 μmol∕L 的NRG 效果最好。這些結(jié)果說(shuō)明NRG 可以濃度依賴性地抑制高磷高鈣誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，且濃度為20 μmol∕L 的NRG 抑制血管鈣化的作用最為明顯。

圖1 NRG對(duì)高磷高鈣誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響Fig.1 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced calcification of rat VSMCs

五組定量分析茜素紅染色結(jié)果比較，經(jīng)單因素方差分析，五組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=178.183，P=0.000 3）；采用Turkey 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 02），NRG（5 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 16），NRG（10 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 37），NRG（20 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 83）。

2.2 NRG抑制大鼠血管環(huán)鈣化

為進(jìn)一步研究NRG 對(duì)血管鈣化的作用，我們采用不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）處理血管環(huán)7 d。染色結(jié)果和定量分析顯示（方差分析的F=267.048，P=0.000 04）：與GM 組比較，CM 組的血管環(huán)鈣化程度明顯加重（P＜0.001；圖2A、B）；與CM組比較，NRG 處理組的血管環(huán)鈣化程度明顯減弱（P＜0.001；圖2A、B）。另外，我們發(fā)現(xiàn)：NRG 可顯著降低血管組織鈣離子濃度（P＜0.001；圖2C）。

圖2 NRG對(duì)高磷高鈣誘導(dǎo)的大鼠血管環(huán)鈣化的影響Fig.2 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced calcification of rat aortic rings

五組定量分析茜素紅染色結(jié)果比較，經(jīng)單因素方差分析，五組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=267.048，P=0.000 04）；采用Turkey法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 37），NRG（5 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 32），NRG（10 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 17），NRG（20 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 44）。

2.3 NRG抑制血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激

由于NRG 具有清除自由基和抗氧化的作用，因此我們研究了NRG 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果顯示（方差分析的F=29.89，P=0.000 1）：CM 處理可升高血管平滑肌細(xì)胞ROS 水平，而使用NRG 可明顯降低ROS 水平（圖3A、B），說(shuō)明NRG 可減輕血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖3 柚皮素對(duì)高磷高鈣誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.3 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced oxidative stress in rat VSMCs

四組定量分析茜素紅染色結(jié)果比較，經(jīng)單因素方差分析，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.89，P=0.0001）；采用Turkey 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00094），NRG（10 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），NRG（20 μmol∕L）組與CM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 5）。

2.4 NRG上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞HO-1的表達(dá)水平

HO-1 是抑制氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，我們研究了NRG 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞HO-1 表達(dá)水平的影響。qPCR 結(jié)果顯示（F=248.488，P=0.000 02）NRG（20 μmol∕L）能明顯增加血管 平滑肌細(xì)胞HO-1 mRNA 的表達(dá)水平（P＜0.001；圖4A）；Western blot結(jié)果也顯示NRG 能明顯上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞HO-1 蛋白的表達(dá)水平（P＜0.001；圖4B）。

圖4 NRG對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞HO-1表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of NRG on HO-1 expression in rat VSMCs

三組HO-1 mRNA 結(jié)果比較，經(jīng)單因素方差分析，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=248.488，P=0.000 02）；采用Turkey 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009），CM+NRG 組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 8）。

2.5 抑制HO-1 阻斷NRG 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的抑制作用

為了研究HO-1 是否參與了NRG 抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化的過(guò)程，我們觀察了HO-1 抑制劑ZnPP9 對(duì)NRG 抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響。結(jié)果顯示（F=241.933，P=0.000 03）：與CM 組比較，NRG（20 μmol∕L）處理的細(xì)胞鈣化明顯減輕，加入ZnPP9（10-7mol∕L）能明顯阻斷NRG 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的抑制作用（圖5A、B）；另外，鈣定量分析顯示：ZnPP9能對(duì)抗NRG降低細(xì)胞鈣離子濃度的作用效應(yīng)（圖5C）。

圖5 HO-1抑制劑ZnPP9對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞鈣化的影響Fig.5 Effect of HO-1 inhibitor ZnPP9 on calcification of rat VSMCs

四組定量分析茜素紅染色結(jié)果比較，經(jīng)單因素方差分析，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=241.933，P=0.000 03）；采用Turkey法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 49），CM+NRG 組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 69），CM+NRG+ZnPP9 組與CM+NRG 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 02）。

3 討論

慢性腎臟病血管鈣化臨床上尚無(wú)有效的治療方法，闡明血管鈣化的分子調(diào)控機(jī)制，尋找其干預(yù)靶點(diǎn)具有極其重要的臨床價(jià)值。在本研究中，我們采用平滑肌細(xì)胞和血管環(huán)鈣化模型，研究NRG 對(duì)血管鈣化的作用。結(jié)果顯示：不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）均可明顯減輕高磷高鈣誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞和血管環(huán)鈣化。由于我們?cè)谘芯縉RG 對(duì)血管鈣化的作用時(shí)，采用了多個(gè)濃度NRG（5、10、20 μmol∕L）處理細(xì)胞和血管環(huán)，其中以NRG（20 μmol∕L）對(duì)血管鈣化的作用效果最佳。因此，在后續(xù)研究NRG 對(duì)HO-1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平的影響時(shí)，采用了20 μmol∕L 的NRG 處理細(xì)胞。NRG 降低細(xì)胞ROS 的水平，上調(diào)HO-1 的表達(dá)水平，而抑制HO-1可阻斷NRG 減輕血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用效應(yīng)。這些結(jié)果提示：NRG 可通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激和血管鈣化。

氧化應(yīng)激的增強(qiáng)是許多血管鈣化相關(guān)疾病如慢性腎臟病、高血壓、糖尿病等的共同特征。慢性腎臟病血管鈣化的病理機(jī)制十分復(fù)雜，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致慢性腎臟病血管鈣化的重要發(fā)病機(jī)制［5］。在慢性腎臟病血管鈣化發(fā)展過(guò)程中，主動(dòng)脈氧化應(yīng)激程度明顯增加，而抑制氧化應(yīng)激可改善動(dòng)脈鈣化［13］。高磷水平能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和血管鈣化，抗氧化劑能明顯抑制氧化應(yīng)激，延緩血管鈣化的發(fā)展［14］。本研究表明：高磷高鈣可刺激血管平滑肌細(xì)胞ROS 的水平升高，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化。使用NRG 后可明顯降低ROS 的水平，抑制血管平滑肌細(xì)胞和血管環(huán)鈣化。另外，既往研究表明：NRG 可通過(guò)促進(jìn)HO-1 的表達(dá)發(fā)揮其抗氧化，抗細(xì)胞損傷等生物學(xué)作用［15-16］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)：NRG 可增加血管平滑肌細(xì)胞HO-1 的表達(dá)水平，抑制血管鈣化；而采用HO-1 抑制劑后，NRG 抑制平滑肌細(xì)胞鈣化的作用明顯減弱了。這些結(jié)果首次證實(shí)：NRG可通過(guò)調(diào)控HO-1抑制血管鈣化。

綜上所述，在鈣磷代謝失調(diào)的條件下，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)血管鈣化。NRG 可上調(diào)HO-1 的表達(dá)水平，抑制氧化應(yīng)激和血管細(xì)胞鈣化。調(diào)節(jié)HO-1 的表達(dá)水平可成為干預(yù)血管鈣化的新策略，我們將采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NRG 通過(guò)調(diào)控HO-1 的表達(dá)抑制慢性腎臟病血管鈣化，為NRG 治療血管鈣化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。