高脂飼料誘導肥胖SD大鼠盲腸及糞便短鏈脂肪酸分析

★ 姜瓔娜 吉燕華 傅靈艷 張吉日木吐 聶鵬,2 徐國良,2,3 曾治君,2 劉紅寧,2（.江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌 330004；2.江西省中醫(yī)病因?qū)W重點實驗室 南昌 330004；3.江西省中藥藥理重點實驗室 南昌 330004）

現(xiàn)代不合理的飲食習慣引發(fā)的肥胖及代謝性疾病已經(jīng)成為了全球性健康問題。由于長期機體能量攝入大于能量消耗，脂肪組織緩沖能力不足，導致多余能量無法以甘油三酯的形式儲存而溢入體循環(huán)，進而機體發(fā)生高脂血癥，外周和肝臟發(fā)生胰島素抵抗最終形成2型糖尿病［1-3］。除了遺傳和生活方式導致的肥胖，越來越多的學者將目光聚焦到腸道菌群，腸道菌群可以將不能消化的碳水化合物轉(zhuǎn)化為可消化的能量［4-5］，微生物對能量代謝的調(diào)節(jié)作用可能是便捷有效的減肥方式，腸道微生物發(fā)酵最終產(chǎn)物為短鏈脂肪酸（SCFAs），其中乙酸、丙酸和丁酸占據(jù)SCFAs含量96%以上，SCFAs含量是評價腸道微生物環(huán)境的重要指標。大量研究表明SCFAs與能量代謝有關(guān)，其中SCFAs可刺激飽腹感激素產(chǎn)生是其研究最深入的機制之一，SCFAs可以通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)及相關(guān)機制刺激瘦素產(chǎn)生，腸腦軸抑制食欲和能量攝入［6-8］；激活棕色脂肪，上調(diào)脂質(zhì)氧化基因增加能量消耗［9］；其中丙酸鹽和丁酸鹽通過誘導腸道糖異生來預防肥胖和胰島素抵抗［10］。

SCFAs與中長鏈脂肪酸相比，其碳鏈更短，可以快速為腸道細胞提供能量，同時由于其易揮發(fā)的特性，人們多運用氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）等方法進行SCFAs的檢測［11］，本文尋求更簡便的樣品前處理方法和在大規(guī)模樣品中檢測SCFAs的方法，首先構(gòu)建氣相色譜法檢測SD大鼠糞便中SCFAs含量的方法學，再應用該方法檢測正常和肥胖SD大鼠糞便及盲腸內(nèi)容物SCFAs的含量，并對比盲腸內(nèi)容物與糞便SCFAs含量的差異。

1 材料

1.1 動物3～4周齡SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量（180±10）g，購自江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心，許可證號：SCXK（贛）2018-0003，飼養(yǎng)于該中心屏障系統(tǒng)實驗室［SYXK（贛）2017-0004］。

1.2 主要試劑與儀器標準品：乙酸（批號：A801294）、丙酸（批號：P816182）、丁酸（批號：B802730）均購于麥克林（上海）。儀器：氣相色譜儀Agligent 7890B，配備FID檢測器（安捷倫，美國）；超純水儀Millipore Milli-Q Advantage A10（默克，美國）；小型臺式高速冷凍離心機（賽默飛，德國）電子分析天平BT225（賽多利斯，德國）；渦旋儀（賽默飛，美國）。

2 方法

2.1 分組及造模20只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機分為空白組和模型組（n=10），空白組給予普通飼料（10 %脂肪含量），模型組給予高脂飼料（60 %脂肪含量），以體重超過正常體重的15 %，Lee’s指數(shù)有顯著差異視為肥胖模型造模成功。

2.2 大鼠糞便、盲腸內(nèi)容物采集糞便：無菌環(huán)境佩戴一次性手套采集糞便，采集糞便樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存；盲腸內(nèi)容物：剪斷盲腸連接處的腸道并以剪斷處為開口，將盲腸內(nèi)容物直接擠出到2.0 mL的無菌凍存管內(nèi)，并立刻放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 樣品制備糞便（盲腸內(nèi)容物）樣品室溫解凍，稱取糞便（盲腸內(nèi)容物）0.30 g± 0.05 g于2.0 mL無菌EP管中，按1∶5（W∶V）的體積加入1 500 μL的超純水，渦旋30 s，離心4 min（5 000 rpm，25 ℃），取上清液500 μL置于新2.0 mL 無菌EP管中，加入100 μL 25 %偏磷酸溶液，渦旋30 s，離心15 min（15,000 rpm，25 ℃）過0.45 μm水系膜，取上清液置于進樣小瓶用于氣相色譜（Agilent 7890B）分析。

2.4 氣相色譜條件儀器型號：Agilent 7890B；色譜 柱：DB-FFAP（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；進樣口溫度：220 ℃；載氣：高純氮氣，載氣流速1.0 mL/min；檢測器（FID）溫度：250℃；升溫條件：初始溫度100 ℃，每分鐘升高30 ℃保持6 min；分流模式：不分流。

2.5 SCFAs標準溶液的制備

2.5.1 標準曲線的制備取乙酸、丙酸、丁酸標準品加入偏磷酸并過0.45 μm水系膜，配制成1 000 μg/mL的標準儲備液，超純水稀釋為5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，800 μg/mL 8個濃度制作成標準工作液，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 空白基質(zhì)標準曲線的制備選取空白組大鼠糞便作為空白基質(zhì)加入“2.5.1”項下制備的混標（V空白基質(zhì)∶ V混標=1∶1），配制成8個濃度標準工作液，為了使?jié)舛确秶泳_，根據(jù)預實驗中樣品乙酸、丙酸、丁酸含量范圍選取濃度梯度制成空白基質(zhì)標準曲線。

2.6 SCFAs含量測定方法學考察

2.6.1 標準曲線取“2.4.1”項下配制的標準品混合工作液進入氣相，測定的結(jié)果作為標準曲線擬合回歸方程，橫坐標為標準品濃度，縱坐標為不同濃度條件下標準品的峰面積。最低檢測限（LOD）與最低定量限（LQD）一般使用信噪比（S/N）表示。國際純粹與應用化學聯(lián)合會規(guī)定，被測物的S/N=3時的濃度即為LOD；S/N=10時的濃度即為LQD。

2.6.2 基質(zhì)效應基質(zhì)效應指生物樣品基質(zhì)對于待測樣品的干擾，將純標準液標準曲線的斜率作為分母，空白基質(zhì)標準曲線的斜率作為分子，計算得到基質(zhì)效應。結(jié)果為100 %表示沒有基質(zhì)效應，大于100 %表明基質(zhì)對物質(zhì)的檢測具有增強信號的作用，低于100 %表明基質(zhì)對物質(zhì)的檢測具有減弱信號的作用。

2.6.3 準確度（相對回收率）準確度是指采用這種方法測定的結(jié)果，與真實值或者參考值比較后接近的程度，一般用相對回收率表示。方法：取高、中、低三個濃度的標準品加入空白基質(zhì)后平行進樣六次取平均值（中濃度樣品選取與生物樣品濃度一致，分別取其±50 %作為高低濃度，以下選取方式同此一致），代入空白基質(zhì)標準曲線回算標準品濃度，其結(jié)果與真實值的比值作為其準確度。

2.6.4 日內(nèi)和日內(nèi)精密度實驗

2.6.4.1 日內(nèi)精密度實驗24 h內(nèi)選高、中、低三個濃度標準品連續(xù)進樣6次，每個濃度配制平行三份樣品作為三組，每組三個濃度，每個濃度平行進6針，取其平均值計算RSD（%）值。

2.6.4.2 日間精密度實驗連續(xù)三天，選高、中、低三個濃度標準品每天連續(xù)進樣6次，每個濃度配制平行三份樣品作為三組，每組三個濃度，每個濃度平行進6針，取其平均值計算RSD（%）值。

2.6.5 穩(wěn)定性實驗穩(wěn)定性實驗考察待測樣品的能夠穩(wěn)定存放的時間，考察樣品于-20 ℃以及12 h -4℃/12 h -20 ℃循環(huán)在5天內(nèi)的穩(wěn)定性，測定于室溫下進行，實驗前樣品平行準備三份。

2.7 統(tǒng)計學處理方法實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以（）表示，兩組之間數(shù)據(jù)采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 標準曲線將“2.5”項下所配制的標準工作液與空白基質(zhì)工作液分別進樣，將系列標準工作液進入GC分析，純標準液氣相色譜圖與空白基質(zhì)標準液氣相色譜圖如圖1所示，專屬性結(jié)果、線性結(jié)果如表1、2所示，兩個標準曲線均顯示乙酸、丙酸、丁酸基線分離度良好，出峰時間快，測樣效率高，顯示了良好的相關(guān)性，取信噪比S/N大于3作為方法的檢測限，S/N大于10作為方法的定量限，見表3。

表1 SCFAs（標準液）的保留時間、標準曲線、線性范圍

圖1 氣相色譜圖

3.2 基質(zhì)效應通過基質(zhì)效應結(jié)果得出，基質(zhì)對于SCFAs檢測略有增強，但影響較小（106 %～111 %），見表3。

表2 SCFAs（空白基質(zhì)）的保留時間、標準曲線、線性范圍

表3 SCFAs的最低檢測限（LOD）、最低定量限（LOQ）和基質(zhì)效應

3.3 準確度（相對回收率）、日內(nèi)及日間精密度測定如表4所示，乙酸的相對回收率為104.27 %～ 111.21 %，丙酸的相對回收率為98.36 %～113.68 %，丁酸的相對回收率為95.19 %～107.00 %；SCFAs空白基質(zhì)標準液的日內(nèi)及日間精密度為1.94 %～ 3.68 %（n=6）和4.24 %～7.10 %（n=18），表現(xiàn)了較好的日間及日內(nèi)精密度。

表4 SCFAs的準確度、日內(nèi)、日間精密度

3.4 穩(wěn)定性檢測待測樣品5天內(nèi)在-20 ℃以及12 h -4 ℃/12 h -20 ℃循環(huán)溫度下的穩(wěn)定性。分別在第1、3、5天考察2種儲存狀態(tài)下待測樣品的穩(wěn)定性。-20 ℃存放條件下，3種SCFAs在5天內(nèi)的RSD %均小于6 %，而循環(huán)溫度下前3天中各種酸的RSD%均小于9 %，在兩種儲存條件下，乙酸、丙酸、丁酸儲存在-20 ℃時在5天內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在12 h -4 ℃/12 h -20 ℃循環(huán)溫度條件下在3天內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

3.5 大鼠糞便及盲腸內(nèi)容物檢測運用本文建立的方法學對空白組和模型組大鼠的糞便以及盲腸內(nèi)容物進行含量測定，結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠糞便和盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸含量均有顯著性下降（P＜0.01）；兩組大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs含量均高于糞便中SCFAs含量：盲腸內(nèi)容物與其糞便結(jié)果相比，模型組中乙酸和丙酸含量顯著增加（P＜0.01），空白組中呈現(xiàn)類似結(jié)果，丙酸和丁酸含量顯著增加（P＜0.01、P＜0.05），見圖2；模型組糞便和盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸和丁酸含量比值分別為10∶3∶4和18∶5.5∶4，在空白組該比值分別為9∶2∶3和7.25∶2∶3.25。與空白組相比，模型組糞便丙酸/丁酸比值上升（P＜0.05），與盲腸內(nèi)容物中比例趨勢一致（P＜0.01），見表5。

圖2 大鼠糞便和盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量的變化（，n=10）

表5 大鼠短鏈脂肪酸含量比值（，n=10）

表5 大鼠短鏈脂肪酸含量比值（，n=10）

注：模型組與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

基質(zhì) 組別 乙酸/丙酸/丁酸 乙酸/丙酸 丙酸/丁酸 乙酸/丁酸糞便空白組 9∶2∶3 5.10±2.21 0.68±0.13 3.41±1.54模型組 10∶3∶4 3.63±2.60** 0.90±0.33* 2.76±1.36*空白組 7.25∶2∶3.25 3.65±0.41 0.68±0.22 2.45±0.65模型組 18∶5.5∶4 4.07±2.54* 1.46±1.02** 4.99±2.89**盲腸內(nèi)容物

4 討論

大量動物實驗研究表明，SCFAs通過多種機制影響食欲和能量攝入，SCFAs在預防和治療肥胖相關(guān)的胰島素抵抗方面有著重要作用［12-14］。因此，建立一種快速穩(wěn)定的方法學來測定SCFAs含量有助于后續(xù)研究分析及臨床檢測。

SCFAs樣品具有揮發(fā)性強，極性大等特點，對SCFAs樣品前處理的方法有水提法、高速離心法、超濾法、蒸餾法和萃取法等［15-19］。為了快速檢測大規(guī)模生物樣品，本文采用水提法，該處理方法操作簡便，省去了衍生化的繁瑣步驟，加快了處理樣品時間。本研究制備了純標準品的標準工作液和加入空白基質(zhì)的標準工作液，其結(jié)果均展現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，通過計算兩個標準曲線斜率的比值得出基質(zhì)效應，證明水提法后的基質(zhì)對后續(xù)含量檢測略有增強，但影響不大，同時日內(nèi)、日間精密度的檢測結(jié)果均顯示此方法可以穩(wěn)定的檢測糞便以及盲腸內(nèi)容物的SCFAs含量，為了確保生物樣品穩(wěn)定，考察了SCFAs儲存在2種條件下在5天內(nèi)表現(xiàn)出的穩(wěn)定性，SCFAs在-20 ℃條件下至少可以保存5天，而12 h -4 ℃/12 h -20 ℃循環(huán)溫度下可保存3天，故樣品處理后建議低溫保存，且不宜反復凍融。

SCFAs含量在腸道是一個動態(tài)調(diào)節(jié)的過程，其比值約為60∶20∶20［20］，其中乙酸含量最高，丙酸與丁酸含量相似，這與本研究方法最后測得SCFAs含量結(jié)論一致。實驗結(jié)果表明肥胖組大鼠與正常組相比SCFAs含量均下降，并且SCFAs的動態(tài)比值也發(fā)生了變化，其中丙酸與丁酸的比值上升，該比值比較有代表意義，有報道指出，丙酸與T2D風險增加有因果關(guān)系［21］，而丁酸其衍生物對腸上皮細胞的正常生長發(fā)揮重要作用，此外，丁酸鹽還可以作為結(jié)腸細胞的燃料來源，促進結(jié)腸癌細胞的凋亡，減少腸道炎癥［22-24］。

盲腸是腸道菌群產(chǎn)生SCFAs主要部位之一，其位于遠端小腸和結(jié)腸之間，定植足夠數(shù)量并易于獲得的微生物群，微生物發(fā)酵就會產(chǎn)生大量SCFAs［4］。相比盲腸內(nèi)容物，體外糞便方便易取、無創(chuàng)傷，還可以及時反映大鼠生理和病理狀態(tài)，但糞便樣品雜質(zhì)多，因此，干擾性也大。SCFAs的濃度從盲腸遠端到糞便，在向下的傳遞過程中有明顯由高到低的變化趨勢［20］，實驗結(jié)果顯示糞便與盲腸內(nèi)容物中SCFAs含量確實存在差異（P＜0.05），盲腸內(nèi)容物中有更低的乙酸與更高的丁酸。在產(chǎn)生的SCFAs中，只有5 %～10 %隨糞便排出［25］，研究顯示，產(chǎn)生丁酸鹽的微生物群通路PWY-5022與體外糞便丁酸水平的相關(guān)性較差［21］，表明體外糞便丁酸水平不能很好地反映丁酸的生成和吸收，這可能是丁酸在體外糞便中含量下降的原因之一。

綜上所述，本文建立了高效穩(wěn)定的氣相檢測短鏈脂肪酸方法學，并應用此方法檢測了正常和肥胖SD大鼠的SCFAs含量，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，肥胖SD大鼠的SCFAs含量都顯著降低，相應比值也發(fā)生了變化，其中丙酸/丁酸比值上升；同時也發(fā)現(xiàn)盲腸內(nèi)容物與體外糞便SCFAs的含量與比值均存在差異，所以糞便中的SCFAs是否是微生物產(chǎn)生SCFAs的最佳預測因子還存在爭議，但其結(jié)果可以作為腸道產(chǎn)SCFAs含量的參考依據(jù)。