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    寧夏賀蘭山東麓赤霞珠葡萄籽提取物抑菌活性的研究*

    2021-08-02 09:21:28劉永衡王學(xué)英
    食品工程 2021年2期
    關(guān)鍵詞:赤霞珠葡萄籽正丁醇

    陳 彬 劉永衡 王學(xué)英

    (寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院,寧夏銀川 750021)

    近年來,寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,寧夏賀蘭山東麓成為業(yè)界公認(rèn)的世界上最適合種植釀酒葡萄和生產(chǎn)高端葡萄酒的黃金地帶之一。2021 年1 月,寧夏九大重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)之一葡萄酒產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展實(shí)施方案出臺(tái),其總體任務(wù)是力爭(zhēng)用5—10 年時(shí)間,釀酒葡萄基地規(guī)模達(dá)到666 7 萬公頃,年產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒3 億瓶以上,努力實(shí)現(xiàn)葡萄酒產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值1 000億元、賀蘭山東麓葡萄酒品牌價(jià)值翻番的目標(biāo)。隨著葡萄種植、加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,產(chǎn)生了大量的葡萄皮渣據(jù)估計(jì),目前每年產(chǎn)生約占葡萄加工量25%左右的皮渣。張瑩等研究表明,釀酒后的葡萄皮渣中含有大量花色苷、白藜蘆醇、膳食纖維等功能性成分,具有良好的醫(yī)療、保健作用。然而只有少量的皮渣被回收利用,絕大部分被用做肥料、飼料甚至當(dāng)垃圾處理掉,造成了資源的極大浪費(fèi)。同時(shí),隨著人們對(duì)食品安全問題愈加重視,使得從草藥、香料等植物中提取天然抗菌化合物的研究也愈加迫切。本試驗(yàn)選用寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄籽為材料,對(duì)不同溶劑提取物的抑菌效果進(jìn)行了對(duì)比研究,旨在為深入研究葡萄籽的抑菌活性機(jī)理及其在食品保鮮中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ),也為提升葡萄酒釀造產(chǎn)品附加值提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 試驗(yàn)材料

    釀酒葡萄:赤霞珠由寧夏西夏王葡萄酒業(yè)(集團(tuán))有限公司提供。

    菌株:供試菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC),試驗(yàn)室低溫保存。

    1.1.2 試劑

    營養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨(購自北京奧海星生物技術(shù)有限公司)、氯化鈉、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(購自廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心),均為國產(chǎn)AR 級(jí)別試劑。

    1.1.3 儀器

    R-3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士BUCHI 公司;SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD 型無菌操作臺(tái),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;PHSJ-4F 型試驗(yàn)室pH 計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;梅特勒ME3002E 型分析天平,梅特勒-托利多國際股份有限公司;T6 紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)樣品制備

    采用傳統(tǒng)工藝釀造葡萄酒后收集皮渣,于烘箱中60 ℃~70 ℃烘干,分離葡萄籽和葡萄皮。將葡萄籽研磨至粉末狀,浸漬于95%乙醇,避光密閉保存1 個(gè)月,備用。取葡萄籽95%乙醇浸漬液減壓蒸餾除去溶劑后得265.3 g 粗浸膏(即95%乙醇總提取物樣品),將粗浸膏溶于1 L 溫水中(60 ℃),再用石油醚(60 ℃~90 ℃)、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,萃取溶劑均為1 L。石油醚萃取層減壓濃縮得18.5 g 浸膏(即95%乙醇總提取物石油醚萃取樣品),乙酸乙酯萃取層減壓濃縮得10.2 g 浸膏,正丁醇萃取層減壓濃縮得26.3 g 浸膏。各提取浸膏用二甲基亞砜DMSO 溶解,制備成5 g/mL 的原始溶液,保藏備用。

    1.2.2 供試菌株的活化及平板涂布培養(yǎng)

    制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,在121 ℃、0.1 Mpa~0.15 Mpa 條件下高壓滅菌30 min,一部分制備試管斜面培養(yǎng)基,接種供試菌種后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。另一部分制備平板培養(yǎng)基,挑取斜面培養(yǎng)菌落于EP 管中,接種于250 mL 三角瓶中,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h 后,將菌液取出,無菌水稀釋成濃度為每毫升106 個(gè)細(xì)胞的菌液,即OD 值0.5~0.6 的菌液。取5 mL 稀釋菌液分散涂布于直徑100 mm 培養(yǎng)皿上,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12 h。

    1.2.3 抑菌圈及抑菌效果的評(píng)價(jià)方法

    抑菌試驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法,將1.2.1 中DMSO溶解試驗(yàn)樣品溶液分別配成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL、0.50 g/mL、0.25 g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用打孔器制作直徑5 mm 濾紙圓片,高壓滅菌后將濾紙片放入各濃度試驗(yàn)樣品溶液中浸泡30 min,以浸泡過DMSO 溶液的濾紙片作為空白對(duì)照(CK),干燥備用。無菌條件下,將供試樣品浸泡干燥濾紙片用無菌鑷子放置在含菌平板上,每個(gè)平皿放置4 片,且間隔一定的距離,然后將培養(yǎng)皿置于恒溫生化箱37 ℃培養(yǎng)24 h,最后觀察菌落生長情況,并用精密測(cè)量尺測(cè)定抑菌圈直徑。

    抑菌活性大小依據(jù)抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn):即抑菌圈直徑大于20 mm,為極度敏感;抑菌圈直徑介于15 mm~20 mm 之間,為高度敏感;抑菌圈直徑介于10 mm~14 mm 之間,為中度敏感;抑菌圈直徑介于7 mm~9 mm 之間,為低度敏感;小于7 mm為不敏感;直徑越大抗菌活性越強(qiáng)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    所有試驗(yàn)重復(fù)3 次,利用Excel2007、IBM SPSS Statistics 19 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 石油醚萃取物抑菌效果

    赤霞珠葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物在質(zhì)量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL、0.05 g/mL3 個(gè)水平下對(duì)3 種典型細(xì)菌的生長有一定的影響,結(jié)果如下頁表1 所示。

    從表1 中可以看出,石油醚萃取物質(zhì)量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL 時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果,達(dá)到了中等抑菌效果,而當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 時(shí)抑菌作用不明顯。石油醚萃取物對(duì)大腸桿菌抑菌作用不明顯,在0.20 g/mL、0.10 g/mL 濃度下,雖然表現(xiàn)出一定的抑菌作用,但抑菌圈直徑均小于7 mm,說明大腸桿菌對(duì)這2 個(gè)濃度的萃取物不敏感。同樣,枯草芽孢桿菌對(duì)3 個(gè)濃度梯度的樣品液均不敏感。

    表1 赤霞珠葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物的抑菌活性

    2.2 乙酸乙酯萃取物抑菌效果

    從表2 中可以看出,乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌沒有抑菌作用,對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在樣品質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 時(shí)表現(xiàn)出較弱的抑制作用,低于0.20 g/mL 時(shí)無抑菌效果。

    表2 葡萄籽95%乙醇總提取物乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

    2.3 正丁醇萃取物抑菌效果

    從表3 中可以看出,正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果,樣品質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 時(shí),抑菌圈的直徑到達(dá)21.3 mm 以上,表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌效果,樣品質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí),抑菌圈直徑在15 mm~20 mm 之間,說明對(duì)菌體高度敏感。質(zhì)量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL 正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果與對(duì)大腸桿菌的抑菌效果無顯著差異,但對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果具有顯著差異;質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 的樣品對(duì)3 種菌種的抑菌效果均具有顯著性差異。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對(duì)正丁醇萃取物的敏感性明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。

    表3 葡萄籽95%乙醇總提取物正丁醇萃取物的抑菌活性

    2.4 赤霞珠葡萄籽各溶劑萃取物的抑菌活性分析

    赤霞珠葡萄籽各極性萃取物在質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 時(shí)對(duì)3 種典型的腐敗菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)的抑菌活性結(jié)果如下頁圖1 所示。

    由圖1 可知,赤霞珠葡萄籽各極性萃取物對(duì)三種典型腐敗菌的抑菌能力由強(qiáng)到弱為:正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物,結(jié)果表明,發(fā)揮主要抑菌能力的活性成分主要集中在高極性的正丁醇萃取物中,因此,在后續(xù)分析、分離及應(yīng)用研究中,可將正丁醇萃取物作為重點(diǎn)研究對(duì)象。

    圖1 赤霞珠葡萄籽各溶劑萃取物的抑菌活性

    3 討論

    植物提取物對(duì)不同微生物有不同程度的抑制效果,同一種植物提取的活性物質(zhì)對(duì)不同細(xì)菌的抑制程度不一樣,同一細(xì)菌對(duì)不同提取物的敏感性亦有差異。Subramanian M 等研究表明,葡萄籽中含有的白藜蘆醇等酚類化合物具有抑菌活性;此外,葡萄籽中含有的原花青素也屬于多酚類化合物,也具有一定的抑菌活性。本試驗(yàn)研究了赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物對(duì)3 種典型細(xì)菌的抑菌效果,結(jié)果表明,葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物對(duì)革蘭氏陽性菌(特別是金黃色葡萄球)抑菌活性強(qiáng),對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌效果較弱;葡萄籽95%乙醇總提取物正丁醇萃取物對(duì)3 種典型菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性,這可能是由于正丁醇萃取物含有大量生物堿、多酚之類的大極性化合物,對(duì)細(xì)菌有較明顯的廣譜抑菌作用;與正丁醇、石油醚萃取樣品相比,乙酸乙酯萃取物對(duì)3 種細(xì)菌的抑菌效果最差。各極性萃取物的抑菌能力由強(qiáng)到弱為:正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物。枯草芽孢桿菌對(duì)所有樣品溶液的敏感性均弱于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,這可能是因?yàn)檠挎邔?duì)外界不良環(huán)境抵抗能力較強(qiáng)的緣故。

    赤霞珠品種在寧夏賀蘭山東麓地區(qū)的種植面積占到紅色品種的70%以上,本試驗(yàn)對(duì)赤霞珠葡萄籽提取物的抑菌活性進(jìn)行了初步研究,為葡萄籽的開發(fā)利用及其作為抑菌劑在食品保鮮加工中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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