基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討赤芍-白芍藥對(duì)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的作用機(jī)制

李坤淋，周豪坤，李全鑫，李 楊

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 400700)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及全身的多系統(tǒng)、多臟器、病程遷延反復(fù)的慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于育齡期女性，屬結(jié)締組織病范疇[1]。近幾十年來(lái)，該病的治療取得了一定進(jìn)展，但是目前可用的藥物如糖皮質(zhì)激素等尚不能很好地控制疾病，并且常受到脫靶效應(yīng)的限制[2]。中醫(yī)古籍對(duì)本病早有記載，古代醫(yī)家多根據(jù)其臨床表現(xiàn)及特征將其命名為“面游風(fēng)”“茱萸丹”“馬纓丹”等，中醫(yī)藥治療該病具有一定特色和優(yōu)勢(shì)，運(yùn)用恰當(dāng)?shù)闹委煼椒?，可大大減少藥物產(chǎn)生的副反應(yīng)，提高療效。

芍藥之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3]，經(jīng)歷代醫(yī)家發(fā)展運(yùn)用，后逐漸分化為赤芍與白芍兩種，均為臨床常用中藥。赤芍、 白芍雖為兩種藥物，但性味相近，且來(lái)源皆為毛茛科芍藥的干燥根，二者化學(xué)成分有諸多相似之處，由于原植物生長(zhǎng)環(huán)境、藥材加工方法以及飲片炮制工藝等方面的不同，所以導(dǎo)致功用各有偏重[4]?，F(xiàn)代研究表明，在臨床治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面，赤白二芍不論是單用或是合用都可在多個(gè)環(huán)節(jié)影響系統(tǒng)性紅斑狼瘡的細(xì)胞免疫、體液免疫以及炎癥過(guò)程，取得較好療效[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)有的多藥理學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)對(duì)多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的一門(mén)新型學(xué)科[7]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)性、整體性的網(wǎng)絡(luò)研究理念與中藥復(fù)方“多成分、多層次、多靶點(diǎn)、多通路”的調(diào)節(jié)模式和作用特點(diǎn)相似，為中醫(yī)中藥“病-證-方”研究提供了新技術(shù)與方法[8]。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，本研究深入探討了赤芍、白芍治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的潛在作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 赤芍-白芍藥對(duì)有效活性成分的挖掘與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)進(jìn)行成分的查詢(xún)及篩選，分別以“赤芍”“白芍”作為檢索條件，得到各自相應(yīng)成分，再進(jìn)行ADME參數(shù)設(shè)置，以口服吸收利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件，結(jié)合文獻(xiàn)學(xué)研究方法，獲取赤芍、白芍的有效活性成分。

1.2 活性成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將收集到的有效活性成分的化學(xué)名分別輸入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，即有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，以獲得其SMILE結(jié)構(gòu)。對(duì)于PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收錄的成分，則先在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載該化合物的MOL2結(jié)構(gòu)文件，再將MOL2文件鍵入到在線(xiàn)計(jì)算網(wǎng)站ALOGPS 2.1(Computational Chemistry Laboratory，http：//www.vcclab.org/lab/alogps)進(jìn)行SMILE結(jié)構(gòu)的計(jì)算，以獲取該化合物的SMILE結(jié)構(gòu)。將得到的SMILE結(jié)構(gòu)整合后，分別輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行有效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，剔除沒(méi)有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的成分，從而獲取芍藥的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)及靶點(diǎn)的相關(guān)信息。

1.3 系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病靶點(diǎn)獲取

主要利用TTD和Drugbank兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。在TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)頁(yè)上下載“TTD all target date”和“TTD 自轉(zhuǎn)UNIPROT ID”文件，利用excel的查找和篩選功能，獲得系統(tǒng)性紅斑狼瘡的部分相應(yīng)靶點(diǎn)和Uniprot號(hào)。在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)頁(yè)檢索框中輸入“systemic lupuseryth ematosus”，獲得SLE靶點(diǎn)的名稱(chēng)，再借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的“Retrieve/ID mapping”功能，將獲得的靶點(diǎn)名稱(chēng)校正為Uniprot號(hào)，以便后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)整合，得到系統(tǒng)性紅斑狼瘡相應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。

1.4 赤芍、白芍成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

將上述獲得的成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)通過(guò)Uniprot號(hào)進(jìn)行映射，得到二者的交集靶點(diǎn)，再借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的“Retrieve/ID mapping”功能將這些靶點(diǎn)的Uniprot號(hào)校正為基因名，從而解決藥物靶點(diǎn)存在的名稱(chēng)不規(guī)范等問(wèn)題。把得到的有效活性成分和基因名稱(chēng)用Excel進(jìn)行整合，繪制成分疾病靶點(diǎn)三列表，將其導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件，建立“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。在該網(wǎng)絡(luò)圖中，Node(節(jié)點(diǎn))表示活性成分和靶點(diǎn)，Edge(邊)表示成分與靶點(diǎn)相互作用的關(guān)系。并借助Cytoscape3.6.0軟件中的Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰜?lái)評(píng)價(jià)活性成分和靶點(diǎn)的重要性。

1.5 Metascape基因列表分析

Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//metascape.org/)可提供自動(dòng)化元分析工具和一鍵式Express Analysis輸出，并支持基于BioGrid(https：//thebiogrid.org/)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析，基因本體論(GO)網(wǎng)絡(luò)的交互式可視化和富集熱圖生成[9]。將前面得到的映射靶點(diǎn)名稱(chēng)鍵入到Metascape的輸入框中創(chuàng)建基因列表，物種選擇為“Homo Sapiens”，點(diǎn)擊Express Analysis得到Metascape基因列表分析報(bào)告的各項(xiàng)輸出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 赤芍、白芍有效活性成分

通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，剔除無(wú)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的活性成分，最終得到包括芍藥苷、單萜糖苷在內(nèi)的21種重要有效活性成分，其中赤芍16個(gè)，白芍8個(gè)，二者共同有效成分3個(gè)，分別是谷甾醇、β-谷固醇和芍藥苷，說(shuō)明二芍之間具有一定的協(xié)同作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 赤芍、白芍的有效活性成分

2.2 芍藥活性成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和SLE疾病靶點(diǎn)

將通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)或通過(guò)ALOGPS 2.1計(jì)算所得的有效成分的SMILE結(jié)構(gòu)輸入到SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)Excel去重總計(jì)得到成分靶點(diǎn)608個(gè)。借助TTD和Drugbank兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，整理得到疾病靶點(diǎn)總計(jì)114個(gè)。將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到二者交集靶點(diǎn)38個(gè)，說(shuō)明這些靶點(diǎn)為赤芍、白芍直接作用于SLE的靶點(diǎn)。見(jiàn)表2。

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

將得到的芍藥有效成分與交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入到Excel中構(gòu)建成分靶點(diǎn)關(guān)系三列表，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件繪制成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表成分和交集靶點(diǎn)，邊代表二者之間的關(guān)系，總計(jì)得到59個(gè)節(jié)點(diǎn)，170條邊，見(jiàn)圖1。借助Cytoscape 3.6.0件中的Network Analyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)其中Degree值靠前的5個(gè)成分分別是δ(7)-甾烯醇、喜樹(shù)堿、樺木酸、菠菜甾醇和黃芩素，其Degree值分別為12、12、12、11、10。而Degree值前5的靶點(diǎn)為CYP19A1、BCHE、PTGS2、ABCB1和CYP2C19，其Degree值分別為14、12、11、11、9。

表 2 芍藥與SLE的交集靶點(diǎn)

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析

將得到的38個(gè)交集靶點(diǎn)的基因名輸入到Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因列表分析，從報(bào)告中提取蛋白質(zhì)相互作用富集分析的CYS文件，導(dǎo)入到Cytoscape3.6.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥Ｔ揚(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)總共包含27個(gè)節(jié)點(diǎn)，54條邊，分為3個(gè)模塊，見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示Degree值排名靠前的5個(gè)靶點(diǎn)為CYP3A4、CYP2C9、HSPA5、MAPK3、和CYP2C19，說(shuō)明這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，提示這些靶點(diǎn)在芍藥調(diào)控SLE的作用中具有較大意義。應(yīng)用分子復(fù)合物檢測(cè)(MCODE)算法識(shí)別提取富集程度較高的2個(gè)子網(wǎng)絡(luò)組件，見(jiàn)圖3。MCODE子網(wǎng)絡(luò)組件1主要參與的生物過(guò)程為細(xì)胞色素P450-底物型排列、Ⅰ-化合物的官能化和類(lèi)固醇代謝過(guò)程；MCODE子網(wǎng)絡(luò)組件2主要參與的生物過(guò)程為細(xì)胞對(duì)饑餓的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)金屬離子的反應(yīng)和饑餓反應(yīng)，見(jiàn)表3。

圖 3 MCODE子網(wǎng)絡(luò)

表3 相應(yīng)組件的功能描述

2.5 基因本體論(GO)分析和KEGG富集熱圖

提取Metascape基因列表分析中的GO分析和KEGG通路分析，在該分析報(bào)告中，采用了基于累積的超幾何分布計(jì)算P值，并使用Banjamini-Hochberg程序計(jì)算q值以說(shuō)明多次測(cè)試[12]，從而收集P值<0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子>1.5的術(shù)語(yǔ)。GO分析顯示，這些靶點(diǎn)主要參與的生物過(guò)程有類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)外源刺激的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等；KEGG通路分析表明這些靶點(diǎn)基因主要參與調(diào)控的通路有抗葉酸抵抗、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和卵巢類(lèi)固醇生成等通路，見(jiàn)表4。挑選具有代表性的富集術(shù)語(yǔ)的前20個(gè)集群構(gòu)建條形圖以更好地展示他們之間的聯(lián)系，見(jiàn)圖4。為了進(jìn)一步捕獲術(shù)語(yǔ)之間的關(guān)系，Metascape選擇了富集術(shù)語(yǔ)的子集并將其呈現(xiàn)為網(wǎng)絡(luò)圖，將其中相似性>0.3的術(shù)語(yǔ)通過(guò)邊連接。從20個(gè)聚類(lèi)中的每個(gè)聚類(lèi)中選擇具有最佳P值的項(xiàng)，并限制每個(gè)聚類(lèi)不超過(guò)15個(gè)項(xiàng)，且合計(jì)不超過(guò)250個(gè)。將CYS文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件對(duì)標(biāo)簽進(jìn)行著色調(diào)整，見(jiàn)圖5。

圖4 按P值大小著色的富集術(shù)語(yǔ)條形圖

表 4 GO分析和KEGG通路分析富集結(jié)果

3 討論

目前對(duì)SLE的治療目標(biāo)主要為控制疾病活動(dòng)、減少合并癥和藥物毒性，以確?；颊吣軌蜷L(zhǎng)期存活，并防止器官損傷，從而改善患者生活質(zhì)量[13]。中醫(yī)藥講究“整體觀”診療模式，對(duì)SLE患者的管理具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可顯著提高患者預(yù)后和生活質(zhì)量。二芍自古便是中醫(yī)醫(yī)師常用藥物，白芍柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)；赤芍清熱涼血、散瘀止痛，均可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的對(duì)癥治療。

注：(a)用集群ID著色，其中共享相同集群ID的節(jié)點(diǎn)通常彼此靠近；(b)用P值著色，其中包含更多基因的術(shù)語(yǔ)傾向于具有更重要的P值。

本次研究共篩選出21種重要有效活性成分，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示，δ(7)-甾烯醇、喜樹(shù)堿、樺木酸等有效成分的Degree值較高，說(shuō)明這些化合物具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如樺木酸能提高機(jī)體的抗氧化能力、增強(qiáng)免疫力，在機(jī)體的抗氧化損傷和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]。而喜樹(shù)堿作為世界上第三大植物抗癌藥，喜樹(shù)堿及其多種衍生物對(duì)于免疫調(diào)節(jié)亦具有較好療效，羥基喜樹(shù)可堿通過(guò)降低Dnmt1基因表達(dá)水平，下調(diào)p16基因啟動(dòng)子的甲基化水平，從而增加SLE患者單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中p16表達(dá)水平[15]。加用白芍總苷治療SLE患者時(shí)可明顯改善患者相關(guān)癥狀和免疫功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷作為二芍的共同化合物，亦具有重要的調(diào)節(jié)作用，而芍藥苷在白芍總苷中往往占到90%以上，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了二芍對(duì)于SLE的療效。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，Degree值較高的靶點(diǎn)有CYP3A4、HSPA5、MAPK3等。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，對(duì)參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和自身免疫反應(yīng)具有重要作用[17]。SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的磷蛋白組學(xué)分析顯示，MAPK通路含差異的磷酸化位點(diǎn)最多[18]，說(shuō)明MAPK相關(guān)靶點(diǎn)在SLE疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

根據(jù)GO分析可以得知，二芍主要通過(guò)參與調(diào)節(jié)免疫、控制炎癥等過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。MCODE子網(wǎng)絡(luò)顯示，P值最高的生物學(xué)過(guò)程為細(xì)胞色素P450-底物型排列，細(xì)胞色素P450酶中的CYP2E1與腦部疾病的關(guān)系密切，SLE患者常合并神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)缁杳?、腦卒中等，因此可以推測(cè)在針對(duì)治療有腦部病變的SLE患者時(shí)，配伍二芍進(jìn)行治療或許可以取得一定療效。

KEGG通路富集分析表明，赤芍、白芍主要通過(guò)抗葉酸抵抗、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、癌癥MicroRNAs、卵巢類(lèi)固醇生成等通路參與調(diào)控，發(fā)揮其抗SLE作用。葉酸對(duì)于DNA復(fù)制至關(guān)重要，細(xì)胞內(nèi)葉酸輔因子在炎性自身免疫性疾病和癌癥生物學(xué)中具有重要作用，說(shuō)明該通路對(duì)于SLE的調(diào)節(jié)較為重要。ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白催化轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)，例如微量營(yíng)養(yǎng)素對(duì)細(xì)菌的高親和力吸收以及細(xì)胞毒性化合物從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的輸出[19]。有研究表明，血清P-糖蛋白水平與SLE與疾病活動(dòng)性之間具有一定聯(lián)系[20]，可見(jiàn)通過(guò)調(diào)控該蛋白通路，可以影響SLE的疾病活動(dòng)度。

綜上所述，赤芍、白芍對(duì)于SLE的調(diào)控具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多層次的特點(diǎn)。本研究總計(jì)得到21種有效活性成分、38個(gè)作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物學(xué)過(guò)程14個(gè)、相關(guān)通路6條，有些靶點(diǎn)或通路已被證實(shí)在SLE的發(fā)揮中具有重要作用。但通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法仍具有一定限制，可能存在忽視二芍配伍前后的活性成分差異、作用靶點(diǎn)的功能還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證支持等。因此，本研究為中藥二芍的研究提供了預(yù)測(cè)性思路，可為今后設(shè)計(jì)體內(nèi)體外驗(yàn)證試驗(yàn)提供參考。