正交設(shè)計(jì)優(yōu)選元胡止痛方乙醇提取工藝研究

于定榮，翁小剛，杜茂波，李 麗，劉 穎，陳 暢，王海林

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

元胡止痛方由延胡索加白芷組成，在臨床上用于治療氣滯血瘀引起的多種疼痛，包括胃痛、肋痛及頭痛等證。目前，研究報(bào)道中關(guān)于元胡止痛方的醇提取方法主要有超聲提取法，如甲醇超聲提取[1]、濃氨-甲醇超聲提取[2]，回流提取法，如甲醇、乙醇回流提取[3-7]，但多集中在元胡止痛軟膠囊、元胡止痛滴丸、元胡止痛片[8-9]等制劑的提取研究，而對(duì)元胡止痛方的提取報(bào)道較少。此外，2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中收錄的元胡止痛方制劑如元胡止痛滴丸、元胡止痛軟膠囊、元胡止痛口服液等制劑中采用的乙醇濃度各不相同，且均無(wú)明確的提取溶劑量。在查閱、分析元胡止痛方醇提取相關(guān)文獻(xiàn)后，結(jié)合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中元胡止痛方類制劑的提取工藝，并在前期元胡止痛方正交設(shè)計(jì)水提取工藝研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以乙醇濃度、加入溶劑體積、提取時(shí)間以及提取次數(shù)為考察因素，以正交設(shè)計(jì)對(duì)延胡止痛方進(jìn)行乙醇提取工藝優(yōu)選，通過(guò)建立HPLC法，采用梯度洗脫的同時(shí)測(cè)定方中藥效成分延胡索乙素、歐前胡素2個(gè)指標(biāo)的含量，通過(guò)加權(quán)法評(píng)判其最佳提取工藝條件，可為元胡止痛方的提取工藝及其工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號(hào)為L(zhǎng)C-20AT，購(gòu)于日本島津)、二極管陣列檢測(cè)器(SPD-M20A-型，購(gòu)于日本島津)；十萬(wàn)分之一天平(型號(hào)為ME155DU，購(gòu)于瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 飲片

延胡索飲片購(gòu)自聚藥堂藥業(yè)有限公司(河北省安國(guó)市，批號(hào)為1907004)；白芷飲片來(lái)源于同一公司，批號(hào)為1907002；符合 2015版《中華人民共和國(guó)藥典：一部》延胡索、白芷飲片項(xiàng)下規(guī)定。將延胡索、白芷飲片以2∶1的量(延胡索∶白芷=2∶1)進(jìn)行混合、粉碎，得其粗粉用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 對(duì)照品

延胡索乙素對(duì)照品來(lái)源于曼思特生物科技有限公司(四川省成都市，批號(hào)為MUST-20032011，其純度為99.86%)；歐前胡素來(lái)源于同一公司(批號(hào)為MUST-20031810，其純度98.27%)。

1.4 試劑

甲醇為色譜純，娃哈哈礦泉水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素及水平確定

在元胡止痛方的粉碎度、浸泡時(shí)間、過(guò)濾等條件相同的前提下，參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》元胡止痛方類制劑的提取工藝以及相關(guān)研究報(bào)道，選擇醇提濃度為60%、70%、80%；提取溶劑為藥物的6倍量、8倍量、10倍量；提取時(shí)間為1.5 h、2.0 h、3.0 h；提取次數(shù)分別為1次、2次、3次[10]，正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交設(shè)計(jì)因素、水平

2.2 延胡索乙素及歐前胡素含量測(cè)定[1，11]

2.2.1 色譜條件 Inertsil?ODS-2型 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇(A)、0.1%磷酸水溶液(B)，通過(guò)梯度洗脫：(0～7 min，45%～55%A；7～9 min，55%～63%A；9～12 min，63%～64%A；12～20 min，64%～78%A)。進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL·min-1。結(jié)果：延胡索乙素及歐前胡素二個(gè)色譜峰可完全分離，峰型良好，見(jiàn)圖1-圖4。

注：1.延胡索乙素；2.歐前胡素。

注：1.延胡索乙素。

注：2.歐前胡素。

注：1.延胡索乙素；2.歐前胡素。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“1.2”項(xiàng)中的元胡止痛方粗粉，精密稱定，得9個(gè)試驗(yàn)號(hào)，置于500 mL圓底燒瓶中，按表1中正交設(shè)計(jì)方案操作。分別加入不同體積、不同濃度的乙醇進(jìn)行回流提取。將各次提取液以紗布過(guò)濾，濾液合并，定容，精密量取一定量濾液于蒸發(fā)皿中，以水浴濃縮，蒸干得浸膏。所得浸膏以甲醇溶解于5 mL量瓶中，定容至刻度，再以0.22 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得9個(gè)供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取7.28 mg延胡索乙素、5.42 mg歐前胡素置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制備得延胡索乙素、歐前胡素對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取延胡索乙素、歐前胡素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，定容至刻度，即配制得混合對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度：每1 mL含延胡索乙素291.2 μg、含歐前胡素162.6 μg)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取延胡索乙素、歐前胡素混合對(duì)照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、40 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以各對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(μg)、峰面積為縱坐標(biāo)(mAU)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得延胡索乙素回歸方程：Y1=2.0×106X+ 7 746，R2=0.999 9；歐前胡素回歸方程：Y2=4.0×106X+ 5 478，R2=0.999 8。結(jié)果：延胡索乙素在0.582 4～11.648 μg，歐前胡素在0.325 2～6.504 μg，對(duì)照品的進(jìn)樣量與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取第2實(shí)驗(yàn)號(hào)樣品供試品溶液(加8倍量60%的乙醇，提取2次，每次提取2 h)10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，結(jié)果測(cè)得延胡索乙素的峰面積RSD為0.43%，歐前胡素的峰面積RSD為0.52%，儀器精密度良好。

2.2.6 供試品溶液測(cè)定 分別精密吸取9個(gè)供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)分別進(jìn)樣，測(cè)定樣品中延胡索乙素及歐前胡素的含量。見(jiàn)表2。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取第2實(shí)驗(yàn)號(hào)樣品供試品溶液，放置0 h，1 h，2 h，4 h，12 h、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)測(cè)得延胡索乙素峰面積的RSD為0.99%，歐前胡素峰面積的RSD為1.02%，表明供試品溶液在測(cè)定的24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按第2實(shí)驗(yàn)號(hào)方案，取“1.2”項(xiàng)同量的元胡止痛方粗粉6份，按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備得供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)條件，依法測(cè)得延胡索乙素峰面積的RSD為1.12%，歐前胡素峰面積的RSD為1.33%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 取“1.2項(xiàng)”相同量的元胡止痛方粗粉，精密稱定9份，置250 mL圓底燒瓶中，按“2.1”項(xiàng)正交設(shè)計(jì)表中第1實(shí)驗(yàn)號(hào)方案，分別精密加入對(duì)照品適量，制備低、中、高質(zhì)量濃度樣品，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，依法測(cè)定延胡索乙素、歐前胡素含量并計(jì)算回收率。結(jié)果延胡索乙素平均加樣回收率為98.81%，RSD為1.39%；歐前胡素平均加樣回收率為99.41%，RSD為1.84%。

2.3 結(jié)果

2.3.1 直觀分析與方差分析 結(jié)果表明，4因素中A、B、C三因素均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中A(乙醇濃度)對(duì)提取效果有顯著性影響(P<0.05)，故A選A3；而B(niǎo)(提取溶劑體積)、C(提取時(shí)間)對(duì)提取效果均有極顯著性影響(P<0.01)；故B選B3；C選C3；而D(提取次數(shù))無(wú)顯著性差異，其水平可以任取，結(jié)合R值及生產(chǎn)實(shí)際，D選D2。各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響由大到小依次為：B>C>A>D；B、C及A起主要作用，而D影響較小。確定元胡止痛方醇提取的最佳方案為A3B3C3D2，即加10倍量的80%乙醇，回流提取2次，每次提取3 h。見(jiàn)表2、表3。

表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)及延胡索乙素、歐前胡素含量加權(quán)評(píng)判結(jié)果

表3 延胡索乙素、歐前胡素含量測(cè)定方差分析結(jié)果

2.3.2 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按“1.2” 項(xiàng)稱取處方比例量元胡止痛方粗粉，共3份，按優(yōu)選出的A3B3C3D2工藝條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按“2.2.1”項(xiàng)分別測(cè)定延胡索乙素及歐前胡素的含量，經(jīng)加權(quán)評(píng)判，測(cè)定得其平均含量分別為0.682 1%、0.682 3%、0.681 6%，高于正交設(shè)計(jì)表中其他實(shí)驗(yàn)號(hào)的平均含量，說(shuō)明優(yōu)選出的最佳乙醇提取工藝條件穩(wěn)定、可行。見(jiàn)表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中收錄的元胡止痛口服液、元胡止痛顆粒的提取工藝以60%乙醇浸泡24 h再回流提取2次(第1次3 h，第2次2 h)，以延胡索乙素含量為其質(zhì)控指標(biāo)。元胡止痛片、元胡止痛滴丸的提取工藝與其相同，但在質(zhì)控指標(biāo)中增加了歐前胡素含量。而元胡止痛軟膠囊的提取工藝則以80%乙醇浸泡12 h，再分別回流提取2次(每次2 h)，以延胡索乙素含量為其質(zhì)控指標(biāo)?？梢?jiàn)，元胡止痛方類制劑的提取工藝中采用的乙醇濃度各不相同，且均無(wú)明確的提取溶劑量。目前的元胡止痛方研究報(bào)道也以元胡止痛滴丸、元胡止痛軟膠囊、元胡止痛片等制劑的研究居多。

本實(shí)驗(yàn)以乙醇濃度、溶劑體積、提取時(shí)間及提取次數(shù)為考察因素，以HPLC法同時(shí)測(cè)定元胡止痛方中指標(biāo)成分延胡索乙素、歐前胡素的含量，以加權(quán)法進(jìn)行評(píng)判，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出其最佳醇提工藝。考慮到元胡止痛方中延胡索為君藥，白芷為臣藥，故將延胡索乙素含量加權(quán)系數(shù)定為0.6，歐前胡素含量的加權(quán)系數(shù)定為0.4，通過(guò)綜合評(píng)分公式Y(jié)=(延胡索乙素含量×0.6)+(歐前胡素含量×0.4)進(jìn)行評(píng)判，并對(duì)其評(píng)判結(jié)果進(jìn)行顯著性分析[12]。這種采用多指標(biāo)評(píng)價(jià)提取工藝的方式較采用單一的延胡索乙素或歐前胡素成分含量作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)更科學(xué)、合理，也提高了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果優(yōu)選出元胡止痛方的最佳乙醇提取工藝條件為 A3B3C3D2，即將元胡止痛方以10倍量80%乙醇回流提取2次，每次3 h為最佳，三批工藝驗(yàn)證結(jié)果表明該工藝可行，穩(wěn)定性好，可為元胡止痛方的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。