超高效液相色譜法測(cè)定醬香型白酒高溫大曲中的乳酸含量

趙尚碧，趙振宇，劉 松，曾穩(wěn)穩(wěn)，王和玉，王 莉

（貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

白酒中的有機(jī)酸主要有甲酸、乙酸、己酸、丁酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸等數(shù)十種，其來(lái)源不一，但都是微生物發(fā)酵或醇氧化而成[1]。酸類物質(zhì)是白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)，在白酒微量芳香成分中占很大比例，同時(shí)酸類也是形成酯類的前體物質(zhì)[2-3]。乳酸為揮發(fā)性較弱的有機(jī)酸，在白酒有機(jī)酸中占據(jù)著很大的比例，是醬香型白酒發(fā)酵過程中一種必不可少的有機(jī)酸，適量的乳酸在白酒生產(chǎn)中可以起到抑制雜菌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)酸度的作用，但乳酸含量偏高容易造成淀粉的糖化率降低，出酒率也會(huì)降低[4-7]。因此，監(jiān)測(cè)白酒發(fā)酵過程中乳酸的含量至關(guān)重要。

高溫大曲是醬香型白酒生產(chǎn)過程中重要的糖化劑和發(fā)酵劑，也是釀酒原料的一部分，通過自然接種、高溫發(fā)酵而制成，是醬香型白酒香氣成分的主要來(lái)源之一[8-10]。高溫制曲、用曲量大是生產(chǎn)醬香型白酒的一大特點(diǎn)，乳酸菌是大曲中含有的一種耐高溫的厭氧型或兼性厭氧型細(xì)菌，主要代謝產(chǎn)物為乳酸[11-12]。醬香型白酒經(jīng)過多輪次堆積發(fā)酵，大曲的加入會(huì)使酒醅的乳酸逐漸積累，從而導(dǎo)致酸度持續(xù)增加，酸度增加過度會(huì)影響產(chǎn)酒酵母和其他產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)微生物的生長(zhǎng)代謝，影響酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[13-14]。目前行業(yè)中對(duì)酒醅中乳酸的檢測(cè)已有報(bào)道[15-20]，但大曲中的乳酸檢測(cè)還未見報(bào)道，本文旨在建立一種能夠準(zhǔn)確、快速測(cè)定醬香型高溫大曲中乳酸含量的方法，為白酒釀造過程中乳酸的監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

醬香型高溫大曲：某酒廠提供；L-乳酸（色譜純，98 %，Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)），甲醇（色譜純，TEDIA 公司，美國(guó)），磷酸（色譜純，阿拉?。粚?shí)驗(yàn)室用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜儀帶PDA 檢測(cè)器（I-Class，Waters，美國(guó)）；ACQUITYUPLC?HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm，Waters，美國(guó)）；超純水儀（Milli-Q）；多管渦旋振蕩器（Talboys，美國(guó)）高速冷凍離心機(jī)（MIKRO220R，Hettich，德國(guó)）；超聲波清洗器（KQ-500DA 型，昆山市超聲儀器有限公司）；漩渦混合器（Vortex-Genie2T，美國(guó)）；電子天平（0.01 g，梅特勒-托利多）；0.22 μm 濾頭（親水性PTFE針式濾器，安譜）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大曲樣品處理

大曲樣品粉碎后，稱取5 g 粉末樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 水，渦旋振蕩10 min 后，以6000 r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，吸取上清液1 mL于2 mL 離心管中，以12000 r/min 冷凍離心10 min，再吸取一定量的上清液用水稀釋30 倍，最后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件

流動(dòng)相：0.12%磷酸溶液作為流動(dòng)相A，100%甲醇作為流動(dòng)相B，梯度洗脫；柱溫：45 ℃；流速：0.45 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量的L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，得到2000 mg/L 的乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存。取一定量的乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，分別配成20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，漩渦混勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 浸提方式的選擇

乳酸易溶于水，并且超純水純度高，不會(huì)引入雜質(zhì)污染，因此選擇超純水作為浸提溶劑。選取1份大曲樣品，稱取5 g 加入10 mL 水，分別采用浸泡、超聲和渦旋振蕩的方式提取10 min，并測(cè)定乳酸含量，每種浸提方式做3 次平行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 浸提方式的選擇（n=3）

由圖1 可知，3 種浸提方式均能提取出大曲樣品中的乳酸，浸泡和超聲兩種方式的提取效率差不多，渦旋振蕩方式比浸泡和超聲的提取效率高19%左右。因此，選取渦旋振蕩方式進(jìn)行提取。

2.1.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)中分別將ZORBXRRHTSB-C18（2.1×50 mm，1.8 μm）和ACQUITYUPLC? HSS T3 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）色譜柱進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。如圖2 所示，當(dāng)使用ZORBX RRHT SB-C18色譜柱時(shí)，樣品中乳酸峰與雜質(zhì)峰不能完全分離，而選用ACQUITYUPLC? HSS T3 柱時(shí)，能把乳酸峰和雜質(zhì)峰很好地分離，并且具有良好的靈敏度。

圖2 色譜柱的選擇

2.1.3 進(jìn)樣量的優(yōu)化

該研究對(duì)色譜條件中的進(jìn)樣量進(jìn)行了優(yōu)化，取一份大曲樣品，按1.2.1 的方法處理后，在其他色譜條件相同的情況下，改變進(jìn)樣量，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL 和5 μL 時(shí)，樣品中乳酸峰和它前后的峰不能完全分離，會(huì)使定量不準(zhǔn)確，當(dāng)進(jìn)樣量為1 μL 時(shí)，乳酸峰不受其他峰的干擾，分離得很好，所以進(jìn)樣量確定為1 μL。

圖3 不同進(jìn)樣量色譜圖

2.2 定性與定量

乳酸標(biāo)品和大曲樣品檢測(cè)分析結(jié)果分別見圖4和圖5，由圖4 和圖5 可以看出，大曲樣品中乳酸與乳酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，出峰時(shí)間在0.913 min，且分離效果較好，能夠滿足檢測(cè)需求。

圖4 乳酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5 大曲樣品色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6，由圖6 可看出，乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在20～800 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.026X+5.473，R2=0.9997，滿足檢測(cè)要求。以信噪比S/N=3 計(jì)算出儀器檢出限（LOD）為4.05 μg/kg，以信噪比S/N=10 計(jì)算出儀器定量限（LOQ）為13.50 μg/kg。

圖6 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 大曲樣品的測(cè)定

2.4.1 精密度分析

取1 份大曲樣品，按1.2.1 的方法處理后平行測(cè)定6 次，結(jié)果見表2，RSD 值為3.03 %，精密度滿足分析要求。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果

2.4.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一大曲樣品6 份，按1.2.1 的方法處理后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3 重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果

由表3 可看出，6 份相同大曲樣品的RSD 值為0.96%，方法重現(xiàn)性較好。

2.4.3 回收率試驗(yàn)

向已知乳酸濃度的大曲樣品中分別按照5000 mg/L、10000 mg/L 和20000 mg/L 3 個(gè)不同添加水平進(jìn)行乳酸加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平做3 次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定乳酸含量，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表4。

由表4 可看出，大曲樣品的平均加標(biāo)回收率在93.4 %～97.2 %之間，表明方法的準(zhǔn)確性較好，滿足定量檢測(cè)要求。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜法檢測(cè)醬香型高溫大曲中的乳酸含量，乳酸在20～800 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997，平均加標(biāo)回收率在93.4 %～97.2%之間，儀器檢出限為4.05 μg/kg，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。該方法前處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，滿足定量檢測(cè)要求，適用于大曲中乳酸的測(cè)定，可為白酒發(fā)酵過程的乳酸監(jiān)測(cè)提供一定的參考和技術(shù)支持。