SIRT1抑制ox-LDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的機制研究

周 毅，王雪笠，康玉萊，張明杰，楊海梅，郭 露，張莉莉

動脈粥樣硬化病變中，巨噬細胞和血管平滑肌細胞(VSMC)攝取大量脂質(zhì)成分，在細胞內(nèi)合成膽固醇酯，形成泡沫細胞，同時伴細胞因子和趨化因子等炎性介質(zhì)的增多。尤其是在動脈粥樣硬化中晚期，VSMC是泡沫細胞的主要來源[1]。但VSMC轉(zhuǎn)化為泡沫細胞的具體機制目前尚不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是Sirtuins家族中的一員，廣泛分布于真核細胞中，可使組蛋白和很多下游靶蛋白去乙?；⒄{(diào)節(jié)其活性，進而調(diào)控能量、脂質(zhì)和葡萄糖代謝，并參與細胞分化、代謝、修復和炎癥反應等過程[2]。激活SIRT1可以上調(diào)肝細胞低密度脂蛋白(LDL)受體的表達從而促進LDL向肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和排出體外，最終降低血漿膽固醇水平[3]。在巨噬細胞中，激活SIRT1能夠抑制細胞對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的攝取，進而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成[4]。泡沫細胞的堆積是動脈粥樣斑塊形成的基礎(chǔ)，而脂質(zhì)代謝紊亂是泡沫細胞形成的關(guān)鍵，上述研究提示SIRT1能夠通過調(diào)控脂質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制動脈粥樣硬化病變進程。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(ABCA1)可將細胞內(nèi)的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運至細胞外的載脂蛋白，從而降低細胞內(nèi)膽固醇含量，是細胞內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)途徑的重要分子[5]。研究證實，ABCA1功能障礙導致高密度脂蛋白減少和細胞組織中脂質(zhì)沉積[6]。同時，ABCA1失活還能增加膽固醇在腸道的吸收，表達主要受肝X受體α(LXRα)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[7]。LXRα是核激素受體蛋白質(zhì)超家族成員，與維A酸X受體形成異二聚體后，能分別與ABCA1啟動子區(qū)LXR反應元件(LXRE)結(jié)合，從而刺激ABCA1轉(zhuǎn)錄[8]。研究表明，SIRT1在巨噬細胞和肝細胞中能夠通過去乙?；头核鼗饔眉せ頛XRα，進而上調(diào)細胞中ABCA1的表達[9]。在單核細胞泡沫化過程中，SIRT1可能通過激活LXRα-ABCA1/ABCG1信號通路抑制細胞的泡沫樣變[10]。本研究旨在探討SIRT1是否能夠通過LXRα/ABCA1信號通路調(diào)控VSMC的脂質(zhì)代謝，進而抑制ox-LDL誘導的細胞泡沫化。

1 材料與方法

1.1試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS液購自美國Hyclone公司。SIRT1一抗購自美國Santa Cruz公司。ABCA1一抗、LXRα一抗購自中國碧云天公司。β-actin一抗及所有二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗購自美國Abcam公司，所用熒光二抗購自江蘇碧云天公司。SRT1720購自美國Selleck Chemicals公司，Nicotinamide購自美國Supelco公司。ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng) 組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC。取小鼠胸主動脈，用含青、鏈霉素的無菌PBS液潤洗，仔細剝除纖維層和外膜?？v行剖開血管使內(nèi)膜面向上，用眼科彎剪輕刮2～3遍以去除血管內(nèi)皮細胞。更換培養(yǎng)皿，將血管中層組織剪切成1 mm3小塊，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，組織塊間隙大約0.5 cm，瓶內(nèi)加入含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，直立于37℃、5% CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中2～4 h，待組織塊緊貼瓶底后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基浸沒組織塊，3 d后第一次更換培養(yǎng)基。待組織塊有細胞爬出，且足夠傳代后進行第一次傳代，此后待細胞生長至瓶底面積的80%～90%即可傳代培養(yǎng)。傳代至第三代時，應用α-SMA對原代培養(yǎng)的VSMC進行鑒定。

1.3細胞分組 取5～10代細胞用于實驗，細胞鋪板培養(yǎng)，換無血清DMEM饑餓培養(yǎng)24 h。加入80 μg/ml ox-LDL誘導體外培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠VSMC泡沫化，VSMC作為空白對照，Western blot法檢測SIRT1的表達。應用SIRT1激動劑SRT1720(SRT，1 μmol/L)、抑制劑Nicotinamide(Nic，100 μmol/L)，將培養(yǎng)細胞分為對照組(con組)、ox-LDL組、ox-LDL+SRT組、ox-LDL+Nic組，檢測各組細胞中SIRT1、ABCA1及LXRα表達及對細胞泡沫化的影響。應用LXRα激動劑GW3965(10 μmol/L)和抑制劑GGPP(10 μmol/L)將細胞分為對照組(con組)、ox-LDL組、ox-LDL+GW3965組、ox-LDL+GGPP組，檢測各組細胞ABCA1表達及細胞泡沫化情況。

1.4油紅染色 用異丙醇配制0.5%油紅O儲存液備用。待染色組織或細胞用PBS液洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min。油紅O儲存液經(jīng)濾紙過濾后與去離子水按照3︰2比例稀釋成工作液，再次經(jīng)濾紙過濾后靜置10 min。PBS液清洗去除多聚甲醛，加入油紅O工作液，避光染色30～60 min。去離子水沖洗去除多余染液后鏡下觀察。

1.5Western blot法分析蛋白表達 采用Western blot法分析細胞中SIRT1、ABCA1及LXRα蛋白表達水平。從小鼠主動脈或培養(yǎng)的VSMC中提取蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)樣品通過10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF膜與抗SIRT1(1︰600)、抗ABCA1(1︰500)、抗LXRα(1︰2000)及抗β-actin(1︰2000)一抗體在4℃共同孵育過夜。洗滌后，PVDF膜與辣根過氧化物共軛二抗體在室溫下孵育2 h?；瘜W發(fā)光法曝光，通過Labworks4.6(UVP，Upland，CA，美國)測定蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1ox-LDL誘導VSMC源性泡沫細胞中SIRT1的表達 ox-LDL明顯誘導VSMC泡沫化，油紅染色可見細胞內(nèi)大量紅色脂滴形成，呈“戒環(huán)樣”聚集于細胞周邊。同時，ox-LDL組細胞中SIRT1的表達與con組相比顯著下降(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 Western blot法檢測氧化型低密度脂蛋白誘導血管平滑肌細胞中SIRT1表達情況

圖2 油紅染色檢測氧化型低密度脂蛋白誘導血管平滑肌細胞泡沫化的程度(×400)

2.2SIRT1對VSMC源性泡沫細胞形成的影響 SRT可使VSMC中SIRT1水平顯著升高(P<0.05)，同時細胞內(nèi)紅色脂滴明顯減少，泡沫化程度被明顯抑制；應用Nic后，細胞中SIRT1的表達明顯下降(P<0.05)，細胞內(nèi)紅色脂滴顯著增多。見圖3、圖4。

圖3 Western blot法檢測SIRT1對各組血管平滑肌細胞中SIRT1的表達

圖4 油紅染色檢測SIRT1對各組血管平滑肌細胞泡沫化的影響(×400)

2.3SIRT1對VSMC源性泡沫細胞中ABCA1表達的影響 ox-LDL刺激培養(yǎng)VSMC 24 h后，細胞中ABCA1表達較con組顯著降低(P<0.05)。應用SRT后VSMC中ABCA1表達較ox-LDL組顯著升高(P<0.05)；應用Nic則使VSMC中ABCA1表達顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 SIRT1對血管平滑肌細胞源性泡沫細胞中ABCA1表達的影響

2.4LXRα介導VSMC中SIRT1對ABCA1表達的促進作用 進一步檢測ox-LDL誘導VSMC源性泡沫細胞中LXRα的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL組LXRα表達較con組顯著降低(P<0.05)；SRT可顯著上調(diào)VSMC中LXRα的表達(P<0.05)；應用Nic則使細胞中LXRα的表達進一步降低(P<0.05)。見圖6。GW3965可顯著上調(diào)ABCA1的表達(P<0.05)，同時細胞中紅色脂滴顯著減少；而GGPP則使細胞中ABCA1表達進一步降低(P<0.05)，油紅染色陽性細胞數(shù)顯著增多。見圖7、圖8。

圖6 Western blot法檢測LXRα介導各組血管平滑肌細胞中LXRα的表達

圖8 油紅染色檢測LXRα介導各組血管平滑肌細胞泡沫化的程度(×400)

3 討論

動脈粥樣硬化是發(fā)生在動脈壁，以血管內(nèi)皮下泡沫細胞大量堆積為特征的慢性血管性疾病。泡沫細胞是由巨噬細胞或VSMC攝取脂質(zhì)成分，在細胞內(nèi)大量合成膽固醇酯并形成脂質(zhì)小體。泡沫細胞沉積是動脈粥樣硬化的重要標志，也是構(gòu)成粥樣斑塊的主要成分，抑制泡沫細胞的形成已成為動脈粥樣硬化防治的重要內(nèi)容。既往認為泡沫細胞主要為巨噬細胞源性，后來研究認為VSMC也具有在細胞內(nèi)聚積膽固醇酯并泡沫樣變的能力。在動脈粥樣硬化中晚期,僅有30%的泡沫細胞為巨噬細胞源性，而45%為VSMC源性[11]。因此，深入研究VSMC源性泡沫細胞的形成機制，確定調(diào)節(jié)這一過程的關(guān)鍵因子，是延緩動脈粥樣硬化進程的重要環(huán)節(jié)。

SIRT1是高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰化酶的家族成員之一[12-14]。研究證實，SIRT1通過乙?；瘍?nèi)皮型一氧化氮合酶和增加一氧化氮生物利用度，起到調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性血管舒縮張力的作用[15]，SIRT1過表達能夠抑制ox-LDL誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡[16]，表明SIRT1對血管健康發(fā)揮有益作用。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL能顯著誘導VSMC泡沫化；活化SIRT1能夠顯著減輕ox-LDL的作用，油紅染色陽性細胞明顯減少，而應用Nic抑制細胞中SIRT1表達后VSMC中脂質(zhì)沉積明顯增多。提示SIRT1可能為防治動脈粥樣硬化的潛在靶點。

VSMC中脂質(zhì)的聚集涉及細胞對脂質(zhì)的攝取、膽固醇酯的胞內(nèi)合成及RCT等過程。RCT是指外周細胞(包括動脈壁細胞)在各級脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體作用下，將細胞中過剩的膽固醇經(jīng)膽汁酸代謝排出體外。機體通過這一過程清除細胞內(nèi)過量的膽固醇，抑制泡沫細胞的形成。RCT的關(guān)鍵步驟是由細胞膜上的ABCA1以ATP為能源進行物質(zhì)轉(zhuǎn)運，可將細胞內(nèi)的膽固醇、磷脂等脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞膜外的載脂蛋白A-I(ApoA-I)，從而清除細胞中的多余脂質(zhì)。ABCA1在泡沫細胞形成和動脈粥樣硬化病變發(fā)病過程中的重要作用已被各種臨床和基礎(chǔ)研究證實，血小板衍生生長因子可顯著降低VSMC中ABCA1的表達，同時使ApoA-I介導的膽固醇外流顯著減少[17]。Choi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化病變內(nèi)膜VSMC中的ABCA1表達較中膜明顯下降,伴有ApoA-I結(jié)合異常、高密度脂蛋白形成障礙及細胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著增多。因此，ABCA1異常是引起VSMC中RCT障礙和膽固醇聚集的重要原因。為探究ABCA1在VSMC泡沫化中的作用，我們檢測激活或抑制細胞中SIRT1時的ABCA1表達情況，結(jié)果表明在原代培養(yǎng)的VSMC中激活SIRT1能夠上調(diào)細胞中ABCA1的表達，應用抑制劑抑制細胞中SIRT1的表達后VSMC中ABCA1的表達也明顯下調(diào)。提示在VSMC源性泡沫細胞形成過程中，SIRT1是通過上調(diào)ABAC1的表達來抑制VSMC的泡沫化。

肝X受體(LXRs)是核受體超家族成員，是受配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，包括LXRα和LXRβ[19]。LXRs主要參與脂質(zhì)和膽固醇代謝的調(diào)節(jié)[20]，近年研究表明，LXRs通過與配體結(jié)合還參與炎癥[21]和免疫功能[22]的調(diào)節(jié)。其中，LXRα廣泛分布于肝臟、脂肪、腸道等組織，在體內(nèi)膽固醇代謝中起調(diào)節(jié)作用[23]。LXRα活化后與上游靶基因LXRE結(jié)合，調(diào)節(jié)包括ABCA1在內(nèi)的多種基因表達，參與細胞內(nèi)膽固醇流出，減少細胞內(nèi)膽固醇蓄積[24]。研究顯示，SIRT1可使組蛋白和很多下游靶蛋白去乙?；⒄{(diào)節(jié)其活性，其中包括LXRs。抑制SIRT1的表達能夠減弱LXRs在心肌損傷中的保護作用[25]。巨噬細胞源性SIRT1能夠在K432位點通過去乙?；饔眉せ頛XRα，進而上調(diào)LXRα靶蛋白ABCA1等的表達，并促進細胞內(nèi)膽固醇的外流[9]。為探討LXRα在激活SIRT1時是否減輕ox-LDL誘導VSMC泡沫化的作用，我們分別檢測予SRT及Nic時細胞中LXRα的表達情況。結(jié)果表明，激活SIRT1后LXRα的表達隨之升高，抑制SIRT1后LXRα的表達隨之降低。之后，我們在細胞中分別加入LXRα激動劑GW3965及抑制劑GGPP后檢測ABCA1的表達情況，結(jié)果顯示激活LXRα后ABCA1的表達上調(diào)，油紅染色陽性細胞較ox-LDL組明顯減少；抑制LXRα后ABCA1表達明顯下降，細胞中脂質(zhì)沉積情況又明顯增強。

綜上，激活VSMC中SIRT1能夠抑制ox-LDL誘導的細胞泡沫化，這一過程是通過SIRT1激活下游靶蛋白LXRα，進而上調(diào)細胞中ABCA1的表達而實現(xiàn)的。本研究為抑制VSMC源性泡沫細胞形成、改善動脈粥樣硬化程度提供了新的理論依據(jù)。