巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

張偉，王世銀，高莉，楊力偉，鄧雙義，劉曉娜，石國(guó)慶，甘尚權(quán)

巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

張偉1,2，王世銀1，高莉1，楊力偉1，鄧雙義1，劉曉娜1，石國(guó)慶2，甘尚權(quán)2

1新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000

【】為了深入挖掘巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miR-486的靶基因，為最終闡明巴什拜羊優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為巴什拜羊的持續(xù)選育提供理論依據(jù)。分別采集了巴什拜羊胎兒期40，50，60，80，100和120 d，以及出生當(dāng)天，出生后30，60和90 d共計(jì)10個(gè)不同發(fā)育階段的骨骼肌組織，分別利用胎兒期6個(gè)階段的混合mRNA和出生后4個(gè)階段的混合mRNA構(gòu)建了胎兒期和出生后骨骼肌中miR-486調(diào)控靶基因的cDNA文庫(kù)，并利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)cDNA文庫(kù)中的靶基因信息進(jìn)行了深入挖掘。在對(duì)所得候選靶基因功能分析的基礎(chǔ)上，選擇10個(gè)候選靶基因，使用qRT-PCR檢測(cè)其在巴什拜羊上述10個(gè)不同發(fā)育階段骨骼肌中表達(dá)量的變化，結(jié)合課題組前期獲得的miR-486在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)其靶向調(diào)控關(guān)系及生物學(xué)功能進(jìn)行初步驗(yàn)證和分析。進(jìn)而選擇其中的4個(gè)候選靶基因使用熒光素酶報(bào)告載體試驗(yàn)和巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的靶向調(diào)控試驗(yàn)最終確認(rèn)其靶向調(diào)控關(guān)系。通過(guò)對(duì)兩個(gè)cDNA文庫(kù)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，胎兒期和出生后分別獲得了123個(gè)和118個(gè)miR-486的靶基因，因其靶向調(diào)控關(guān)系未經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，故暫稱(chēng)為候選靶基因。其中有96個(gè)為兩個(gè)階段共表達(dá)的候選靶基因，其余27個(gè)和22個(gè)分別為胎兒期和出生后骨骼肌中特異表達(dá)的候選靶基因。GO和KEGG分析結(jié)果表明所得候選靶基因顯著富集于與肌肉分化和肌纖維發(fā)育相關(guān)的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，諸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明所選10個(gè)候選靶基因在不同發(fā)育階段巴什拜羊骨骼肌中均有表達(dá)，但其表達(dá)變化規(guī)律有所不同。、、、、、和在胎兒期巴什拜羊骨骼肌中呈高表達(dá)，出生后其表達(dá)量顯著下調(diào)，而的表達(dá)量則呈相反的變化趨勢(shì)，和在胎兒期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化。對(duì)其中4個(gè)候選靶基因的進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，雙熒光素酶報(bào)告載體試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-486可以高效結(jié)合在其候選靶基因、、和的靶位點(diǎn)上，進(jìn)而極顯著抑制其后螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性；巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的靶向調(diào)控試驗(yàn)結(jié)果亦表明miR-486可以顯著下調(diào)上述4個(gè)候選靶基因的mRNA水平，抑制其生物學(xué)功能。所以可以確證在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向調(diào)控、、和的表達(dá)。對(duì)巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miR-486的靶基因進(jìn)行了深入挖掘，全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，所得候選靶基因數(shù)據(jù)可靠性高，可為闡明巴什拜羊優(yōu)良肉質(zhì)性狀的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

巴什拜羊；miR-486；靶基因；骨骼肌；cDNA文庫(kù)

0 引言

【研究意義】巴什拜羊（Ovis aries）是我國(guó)一個(gè)優(yōu)良的肉脂兼用型地方綿羊品種，以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羔羊肉而著稱(chēng)，原產(chǎn)于新疆塔城地區(qū)裕民縣，現(xiàn)主要分布在塔城地區(qū)的裕民縣、額敏縣和托里縣等地，2014年存欄量約150萬(wàn)只[1]，該品種羊的養(yǎng)殖一直是當(dāng)?shù)啬撩袷杖氲闹饕獊?lái)源。巴什拜羊素有貴族羊之稱(chēng)，其優(yōu)良的肉質(zhì)性狀在國(guó)內(nèi)外綿羊品種中亦不多見(jiàn)[2]。但是，近年來(lái)隨著人們健康意識(shí)的提高以及肉食品消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，低脂肪羊肉的需求量在逐漸增加。巴什拜羊由于胴體脂肪含量較高[3]，已無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求，亟需進(jìn)行遺傳改良[4]。本研究對(duì)巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miR-486的靶基因進(jìn)行深入研究，將為最終闡明巴什拜羊優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成的分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)其科學(xué)選育奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNA（microRNA）是一類(lèi)小分子非編碼RNA，約為22個(gè)核苷酸大小，在骨骼肌的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5-6]。miR-486首先是從人胚胎肝組織中鑒定出來(lái)，在心肌和骨骼肌中高表達(dá)，Alexander等發(fā)現(xiàn)miR-486作為PTEN/AKT 途徑中重要的調(diào)節(jié)因子在抗肌萎縮蛋白缺陷型肌肉和杜氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥中（duchenne muscular dystrophy, DMD）發(fā)揮著重要的作用[7]。miR-486在敲除小鼠的骨骼肌中顯著上調(diào)，體外過(guò)表達(dá)miR-486 可以誘導(dǎo)肌管肥大，抑制miR-486可以降低AKT 的活性，說(shuō)明miR-486是骨骼肌中連接MSTN信號(hào)和IGF-1/Akt/ mTOR途徑重要的中間調(diào)控因子[8]。目前對(duì)miR-486的研究主要集中在人類(lèi)肌肉相關(guān)疾病方面，在綿羊等家畜肌肉發(fā)育中的相關(guān)研究鮮有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miRNA的差異表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)miR-486在出生后巴什拜羊骨骼肌中的表達(dá)量極顯著上調(diào)，為胎兒期的100多倍[9]。進(jìn)一步研究表明miR-486在巴什拜羊100 d胎兒骨骼肌和心肌中的表達(dá)量顯著高于胃腸組織（＜0.05），而極顯著高于肝、脾和肺等其他組織（＜0.01）[10]，提示miR-486在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。miRNA通過(guò)調(diào)控其靶基因而發(fā)揮其生物學(xué)功能，但miR-486在巴什拜羊骨骼肌中的靶基因尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)構(gòu)建miR-486靶基因cDNA文庫(kù)結(jié)合高通量測(cè)序，對(duì)巴什拜羊胎兒期和出生后骨骼肌中miR-486的靶基因進(jìn)行深入研究，并對(duì)部分靶基因進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，將為闡明miR-486在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及骨骼肌樣品采集

試驗(yàn)用巴什拜羊購(gòu)自裕民縣巴什拜種羊繁育中心。試驗(yàn)羊的飼養(yǎng)、前期處理及樣品采集工作于2017年8月至2018年2月在新疆雪羚生物科技有限責(zé)任公司種羊場(chǎng)完成。

選擇20只體況良好，胎次在2—3胎，來(lái)自不同家系的巴什拜羊（Ovis aries）母羊，統(tǒng)一進(jìn)行飼養(yǎng)管理。15 d后進(jìn)行同期發(fā)情和人工授精處理。從輸精后的第15天開(kāi)始每天分別在早上10點(diǎn)和下午6點(diǎn)觀察母羊的發(fā)情狀態(tài)，剔除返情的母羊，結(jié)合B超檢查最終選擇10只妊娠母羊進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別在妊娠期的第40，50，60，80，100和120天屠宰1頭妊娠母羊，采集胎兒的四肢骨骼肌組織并投入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ溆?只母羊繼續(xù)飼養(yǎng)至羔羊出生，并于出生當(dāng)天，及出生后30，60和90 d屠宰羔羊，按照上述方法采集和保存骨骼肌組織。

1.2 RNA提取及基因組DNA消化

參照TRIzol（Invitrogen, USA）說(shuō)明從上述骨骼肌樣品中提取總RNA，使用Bioanalyzer 2100（Agilent, Germany）評(píng)估總RNA完整性。參照Oligotex?mRNA純化試劑盒（Promega, USA）的說(shuō)明，從總RNA中分離純化mRNA，然后使用RNase-free DNase I（Ambion Inc., USA）消化所得mRNA，以去除微量基因組DNA污染，避免其對(duì)cDNA文庫(kù)質(zhì)量的影響。

1.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和高通量測(cè)序

將胚胎期6個(gè)階段骨骼肌mRNA混合為一個(gè)樣品，出生后4個(gè)階段骨骼肌mRNA混合為另一個(gè)樣品，參照甘尚權(quán)等[11]建立的方法分別構(gòu)建胎兒期和出生后巴什拜羊骨骼肌miR-486的靶基因cDNA文庫(kù)?，F(xiàn)以胎兒期cDNA文庫(kù)為例，簡(jiǎn)要說(shuō)明建庫(kù)的過(guò)程。將胎兒期骨骼肌mRNA混合樣品分為兩份，分別用反轉(zhuǎn)錄引物A（5￠-3￠: CTCGACTGAGTTGCCG，斜體加粗堿基為巢式引物的上游引物序列，下劃線所示堿基為miR-486與其靶基因結(jié)合的種子序列）和B（5￠-3￠: AACGCG+oligodT20，下劃線所示堿基為巢式引物的下游引物互補(bǔ)序列），參照PrimeScript? Double Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA）試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA雙鏈，分別稱(chēng)之為A庫(kù)和B庫(kù)。由于用于構(gòu)建A庫(kù)的反轉(zhuǎn)錄引物3￠末端的10個(gè)堿基為miR-486與其靶基因結(jié)合的種子序列，只有該序列與mRNA上的序列互補(bǔ)結(jié)合，才能完成反轉(zhuǎn)錄，所以A庫(kù)中的cDNA應(yīng)主要為miR-486的靶基因序列；用于構(gòu)建B庫(kù)的反轉(zhuǎn)錄引物3￠末端是20個(gè)oligodT，所以B庫(kù)中的cDNA應(yīng)是相應(yīng)骨骼肌組織中所有表達(dá)功能基因序列的集合。使用酚/氯仿法抽提純化A庫(kù)和B庫(kù)的cDNA雙鏈后將二者等體積混合，95 ℃變性5 min，然后50 ℃保溫5 min形成A庫(kù)和B庫(kù)的雜交cDNA文庫(kù)。最后以雜交的cDNA為模板，使用巢式引物（上游引物5￠-3￠: TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG和下游引物5￠-3￠: AGCGCAGCTCATCATCTGCAT）進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。此時(shí)，只有A庫(kù)中miR-486的靶基因鏈與其在B庫(kù)中對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈形成的雜交雙鏈同時(shí)帶有上下游巢式引物，所以在巢式PCR反應(yīng)中可以被指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。而其他形式的雜交雙鏈只帶有上游或者下游巢式引物，在巢式PCR反應(yīng)中只能被線性擴(kuò)增。所以，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，絕大部分為miR-486的靶基因序列，本研究中稱(chēng)之為miR-486靶基因cDNA文庫(kù)。將構(gòu)建的兩個(gè)cDNA文庫(kù)分別采用Illumina HiSeq 3000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙向高通量測(cè)序。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理

測(cè)序原始數(shù)據(jù)使用SOAPnuke過(guò)濾，除去接頭序列以及未知堿基超過(guò)10%和低質(zhì)量堿基（Q≤10）超過(guò)50%的低質(zhì)量reads。獲得的clean reads使用SOAPaligner和SOAP2以牛（v3.1）和綿羊（v3.1）基因組序列為參考進(jìn)行拼接組裝和注釋。

1.5 候選靶基因序列篩選及分析

按照靶基因cDNA文庫(kù)建庫(kù)原理，所得miR-486靶基因序列應(yīng)該含有反轉(zhuǎn)錄引物A的末端10堿基序列（GTCATGTCCT）。因此以該10堿基序列為種子序列對(duì)上述分析獲得的基因序列進(jìn)行比對(duì)篩選，含有該序列的基因序列即為miR-486靶基因序列，由于所得靶基因尚未經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，存在一定數(shù)量的假陽(yáng)性結(jié)果，所以暫時(shí)稱(chēng)為候選靶基因。為了深入了解所得候選靶基因的生物學(xué)功能，利用David在線軟件進(jìn)行基因本體論[12]（gene ontology, GO）（http://geneontology. org）分析，從細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程和分子功能3方面對(duì)其進(jìn)行功能注釋?zhuān)缓罄镁┒蓟蚝突蚪M百科全書(shū)[13]（Kyoto encyclopedia of genes and genome, KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kegg.jp/kegg ）分析所得miR-486候選靶基因參與調(diào)控的信號(hào)通路，設(shè)置≤0.05為顯著性閾值。

1.6 部分候選靶基因在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中表達(dá)量檢測(cè)

在以上靶基因cDNA文庫(kù)測(cè)序結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，查閱近年來(lái)骨骼肌發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路的文獻(xiàn)報(bào)道，從靶基因cDNA文庫(kù)中選擇10個(gè)與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)的候選靶基因，以-actin為內(nèi)參基因，以出生后第90天的表達(dá)量為對(duì)照，使用qRT-PCR對(duì)其在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量，并參照課題組前期檢測(cè)的miR-486的表達(dá)規(guī)律[10]，對(duì)10個(gè)候選靶基因與巴什拜羊骨骼肌發(fā)育的關(guān)聯(lián)性，及其與miR-486的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行初步分析。10個(gè)候選靶基因及內(nèi)參基因在Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)（http://asia.ensembl.org/index.html）中的登錄號(hào)及qRT-PCR引物信息見(jiàn)表1。引物使用oligo6.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）有限公司合成。mRNA的反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScript Ⅳ 1st strand cDNA Synthesis Mix（TAKARA）完成，qRT-PCR擴(kuò)增采用20 μL體系：TB Green Premix ExⅡTli RNaseH Plus）（2×）（TAKARA, 大連）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 6.4 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后以 0.1 ℃/s 的速度進(jìn)行熔解曲線分析。qRT-PCR檢測(cè)由LightCycler 96（Roche, Germany）完成。

表1 10個(gè)候選靶基因qRT-PCR引物信息表

*登錄號(hào)指基因在Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)（http://asia.ensembl.org/index.html）中的Transcript ID

*Accession number means the transcript ID of gene in Ensemble database (http://asia.ensembl.org/index.html)

1.7 miR-486與部分候選靶基因靶向調(diào)控關(guān)系的驗(yàn)證

由于通過(guò)構(gòu)建靶基因文庫(kù)獲取的靶基因存在一定比例的假陽(yáng)性結(jié)果，為了驗(yàn)證上述靶基因文庫(kù)的可靠性，結(jié)合上述10個(gè)候選靶基因在巴什拜羊不同發(fā)育階段表達(dá)量的變化規(guī)律，以及課題組前期檢測(cè)到的miR-486的表達(dá)規(guī)律[10]，從上述10個(gè)候選靶基因中選擇、、和4個(gè)表達(dá)量與miR-486的表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)的候選靶基因作進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.7.1 雙熒光素酶報(bào)告載體試驗(yàn) 在候選靶基因序列上miR-486結(jié)合靶位點(diǎn)上下游約100 bp片段范圍設(shè)計(jì)PCR引物，以巴什拜羊基因組為模板PCR擴(kuò)增獲得靶位點(diǎn)區(qū)域約200 bp大小的野生型片段，同時(shí)根據(jù)種子序列設(shè)計(jì)突變引物，與上述PCR引物進(jìn)行重疊PCR對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得靶位點(diǎn)處4個(gè)堿基突變的突變型片段。將野生型片段和突變型片段經(jīng)I和dIII雙酶切后連入PGL4雙熒光素酶報(bào)告載體（Promega, USA），并使用雙酶切和測(cè)序確認(rèn)載體構(gòu)建的正確性。上述載體構(gòu)建引物信息見(jiàn)表2。

表2 熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建引物

用于載體構(gòu)建引物序列中小寫(xiě)字母為限制性內(nèi)切酶I和dIII的切割序列及保護(hù)堿基；用于靶位點(diǎn)突變引物中小寫(xiě)字母為致突變堿基

The bases in lowercase of vector construction primer were restriction enzyme cutting sites (italics and bold) and protective bases ofI anddIII restriction enzyme cutting sites and protective bases, the ones of mutating bind site primer were mutated bases of the miR-27b target site in MSTN 3-UTR

參照Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）的操作說(shuō)明，將構(gòu)建好的報(bào)告載體及miR-486 mimics（表3）分別轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，按照Dual-Luriferase Reporter Assay System（Promega, USA）的操作說(shuō)明檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.7.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中miR-486干擾表達(dá)試驗(yàn) 檢索miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)其收錄的bta-miR-486序列（MIMAT0009329）設(shè)計(jì)其模擬物miR-486 mimics，抑制物miR-486 inhibitor及其陰性對(duì)照negative control（表3）并由上海吉瑪基因合成。擴(kuò)大培養(yǎng)巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（通過(guò)原代培養(yǎng)獲得），參照Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）的操作說(shuō)明將miR-486 mimics，miR-486 mimics negative control，miR-486 inhibitor和miR-486 inhibitor negative control分別轉(zhuǎn)入骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，以不轉(zhuǎn)染任何試劑的細(xì)胞組作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至24、48和72 h時(shí)分別消化收集細(xì)胞，按照1.2所述方法提取總RNA，并按照1.6所述方法及引物檢測(cè)不同處理組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中4個(gè)候選靶基因mRNA的水平。

表3 miR-486 mimics、miR-486 inhibitor及其陰性對(duì)照序列

1.8 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果采用螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性計(jì)算。試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 靶基因cDNA文庫(kù)高通量測(cè)序及分析

胎兒期和出生后miR-486靶基因cDNA文庫(kù)高通量測(cè)序分別得到6.21M和5.94M原始數(shù)據(jù)，剔除接頭序列以及低質(zhì)量reads后分別獲得5.73M和5.42M的clean reads。進(jìn)一步拼接組裝、剔除冗余序列后分別得到283條和276條Unigenes，平均序列長(zhǎng)度分別為673 bp和681 bp。將胎兒期和出生后Unigenes序列進(jìn)行blastn比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分別有68和61個(gè)為胎兒期和出生后特異表達(dá)Unigenes，有215個(gè)為兩個(gè)時(shí)期的共表達(dá)Unigenes。

2.2 候選靶基因注釋及功能分析

按照靶基因cDNA文庫(kù)建庫(kù)原理，所得miR-486候選靶基因序列應(yīng)該含有反轉(zhuǎn)錄引物A的末端10堿基序列（GTCATGTCCT）。因此以該10堿基序列為種子序列對(duì)上述分析獲得的Unigenes序列進(jìn)行比對(duì)篩選，胎兒期和出生后分別獲得123個(gè)和118個(gè)符合條件的Unigenes，其中96個(gè)為兩個(gè)階段共表達(dá)Unigenes，其余27個(gè)和22個(gè)分別為胎兒期和出生后骨骼肌中特異表達(dá)的Unigenes。由于miR-486與所得Unigenes的靶向調(diào)控關(guān)系尚未經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，所以暫時(shí)稱(chēng)之為miR-486的候選靶基因。

GO分析結(jié)果表明，胎兒期和出生后分別有96個(gè)和87個(gè)候選靶基因得到注釋信息，胎兒期的候選靶基因顯著富集于26個(gè)細(xì)胞組分條目，32個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目和18個(gè)分子功能條目。出生后的候選靶基因顯著富集于20個(gè)細(xì)胞組分條目，36個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目和23個(gè)分子功能條目，富集基因數(shù)前10的GO條目及富集于相應(yīng)條目的候選靶基因占該階段檢測(cè)到候選靶基因的比例見(jiàn)圖1。

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，胎兒期和出生后候選靶基因顯著富集于多個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3k-Akt、MAPK、Wnt和Adherens junction等，提示miR-486可能通過(guò)調(diào)控一些與肌肉發(fā)育相關(guān)的基因及信號(hào)通路，在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。胎兒期和出生后候選靶基因顯著富集的前20個(gè)信號(hào)通路見(jiàn)圖2。

2.3 miR-486及其部分候選靶基因在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)規(guī)律

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明所選10個(gè)候選靶基因在巴什拜羊骨骼肌中均有表達(dá)（圖3），但在不同發(fā)育階段的表達(dá)量存在差異。表達(dá)量在胎兒期呈持續(xù)下降趨勢(shì)，在胎兒期第40和50 天表達(dá)量最高，極顯著高于其他時(shí)期（＜0.01），胎兒期第60天開(kāi)始逐步下降，至出生后降至最低且保持相對(duì)穩(wěn)定（圖3-A）。表達(dá)量從胎兒期至出生后呈持續(xù)下降趨勢(shì)，在胎兒期第40、50和60天表達(dá)量最高且差異不顯著（＞0.05），但極顯著高于其他時(shí)期（＜0.01）；胎兒期第80、100和120天時(shí)表達(dá)量下調(diào)，但仍極顯著高于出生后各階段（＜0.01）；出生當(dāng)天至出生后第30天表達(dá)量進(jìn)一步下降，這2個(gè)時(shí)期差異不顯著（＞0.05），但極顯著高于出生后第60和90天的表達(dá)量（＜0.01），至出生后第90天降至最低（圖3-B）。和在胎兒期前期高表達(dá)，胎兒期第40、50、60和80天均極顯著高于其他各階段（＜0.01），但至胎兒期第100天迅速下調(diào)，至出生后第90天一直保持較低的表達(dá)水平（圖3-C和D）。表達(dá)量在胎兒期第40、50和60天表達(dá)量最高且差異不顯著（＞0.05），至胎兒期第80和100天時(shí)表達(dá)量極顯著下調(diào)（＜0.01），至胎兒期第120天時(shí)又出現(xiàn)極顯著上調(diào)（＜0.01），但至出生后即出現(xiàn)極顯著下調(diào)（＜0.01），直至出生后第90天降至最低水平（圖3-G）。在胎兒期第40和50天時(shí)呈高表達(dá)，至胎兒期第60和100天時(shí)出現(xiàn)2次極顯著下調(diào)（＜0.01），而胎兒期第80和120天時(shí)出現(xiàn)2次極顯著上調(diào)（＜0.01），至出生后一直呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)趨勢(shì)（圖3-H）。基因在胎兒期第40、50、60和80天表達(dá)量最高且差異不顯著（＞0.05），胎兒期第100 d時(shí)表達(dá)量極顯著下調(diào)（＜0.01），胎兒期第120 d時(shí)又出現(xiàn)極顯著上調(diào)（＜0.01），至出生后再次出現(xiàn)極顯著下調(diào)（＜0.01），并在出生當(dāng)天及出生后30、60和90 d保持穩(wěn)定表達(dá)（圖3-I）。上述7個(gè)基因在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)變化存在一定差異，但是總體而言呈胎兒期高表達(dá)，出生后低表達(dá)的趨勢(shì)。已有的研究結(jié)果表明miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)控一般為負(fù)調(diào)控，而課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-486在巴什拜羊胎兒期總體呈低表達(dá)，出生后表達(dá)量逐漸上調(diào)[10]。由此可以推斷，在上述7個(gè)候選靶基因與miR-486巴什拜羊骨骼肌中存在靶向調(diào)控關(guān)系的可能性很大。

A和B分別為胎兒期和出生后候選靶基因GO分析結(jié)果，Y軸為GO條目名稱(chēng)，X軸為相應(yīng)條目富集的候選靶基因占注釋于該類(lèi)型候選靶基因的比例

A和B分別為胎兒期和出生后候選靶基因參與通路分析結(jié)果，Y軸為pathway名稱(chēng)，X軸為富集因子，氣泡大小反映了富集到某個(gè)信號(hào)通路中的候選靶基因的數(shù)量占該通路已發(fā)現(xiàn)參與基因的比例，顏色變化反映了某個(gè)通路富集的顯著性水平

A-J分別為10個(gè)候選靶基因在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中相對(duì)表達(dá)量的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，橫軸為巴什拜羊骨骼肌不同發(fā)育階段，1-10分別指胎兒期第40、50、60、80、100和120天，以及出生當(dāng)天，出生后30、60和90 d共10個(gè)不同的發(fā)育階段，縱軸為相應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)量，圖中相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

和在胎兒期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化（圖3-E和3-J），推測(cè)這2個(gè)基因的表達(dá)可能是巴什拜羊骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育所必需，故其表達(dá)量保持相對(duì)穩(wěn)定；而胎兒期呈低表達(dá)，但表達(dá)量逐步上調(diào)，至出生后第90 天達(dá)到較高的表達(dá)水平（圖3-F）。結(jié)合miRNA與其靶基因靶向調(diào)控的規(guī)律，推測(cè)這3個(gè)候選靶基因與miR-486存在靶向調(diào)控關(guān)系的可能性不大。

2.4 熒光素酶報(bào)告載體驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-486與候選靶基因的靶向調(diào)控關(guān)系，從上述10個(gè)候選靶基因中選擇、、和4個(gè)候選靶基因進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將4個(gè)候選靶基因野生型（WT）和突變型（Mut）靶位點(diǎn)序列插入到雙熒光素酶報(bào)告載體海腎熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶之間（圖4-A），熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明miR-486與插入野生型靶位點(diǎn)序列報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性均極顯著低于對(duì)照組（＜0.01），而miR-486與插入突變型靶位點(diǎn)序列報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異（＞0.05，圖4-B），說(shuō)明miR-486可與候選靶基因靶位點(diǎn)序列高效結(jié)合，從而抑制其后螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)，由此也初步證明miR-486與、、和4個(gè)基因存在靶向調(diào)控關(guān)系。

2.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中靶向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證

巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的驗(yàn)證結(jié)果表明，對(duì)于和，當(dāng)轉(zhuǎn)入miR-486 mimics造成細(xì)胞中miR-486的表達(dá)水平呈上調(diào)狀態(tài)時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48和72 h的細(xì)胞中均檢測(cè)到和的mRNA水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著下調(diào)趨勢(shì)（＜0.05），空白對(duì)照組、miR-486 inhibitor組和兩個(gè)陰性對(duì)照組細(xì)胞中和的mRNA水平未見(jiàn)顯著變化（＞0.05）（圖5-A和C）；的mRNA水平在培養(yǎng)至24 h細(xì)胞中未見(jiàn)顯著變化（＞0.05），48 和72 h的mRNA水平變化與和相同（圖5-D）；mRNA水平在miR-486 inhibitor組24、48和72 h的細(xì)胞中均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)（＜0.05），在miR-486 mimics組48和72 h的細(xì)胞中均呈顯著下調(diào)趨勢(shì)（＜0.05），其余處理組之間無(wú)顯著差異（＞0.05）（圖5-B）。

A為候選靶基因片段插入雙熒光素酶報(bào)告載體位置及4個(gè)候選靶基因野生型（WT）和突變型（Mut）靶位點(diǎn)序列，序列中帶下劃線的堿基為通過(guò)重疊PCR獲得的突變堿基；B為插入野生型和突變型靶位點(diǎn)片段熒光素酶報(bào)告載體的熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)結(jié)果，NC指miR-486的陰性對(duì)照（Negative control）

綜合熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中靶向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確認(rèn)在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向調(diào)控、、和4個(gè)基因。

A、B、C和D分別為候選靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和 PIK3R1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中24、48和72 h的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

動(dòng)物的骨骼肌是由單核的成肌細(xì)胞相互融合而成的多核肌纖維構(gòu)成的[14]。成肌細(xì)胞來(lái)源于中胚層，遷移至軀干和四肢等骨骼肌發(fā)育的位置后，成肌細(xì)胞先增殖達(dá)到一定的數(shù)量，然后相互融合為肌管，并最終發(fā)育成肌纖維[15-16]，這一過(guò)程一直持續(xù)至動(dòng)物出生前才結(jié)束。在不同的動(dòng)物中，肌管的形成可以明顯的區(qū)分為兩至三個(gè)時(shí)期。就大部分動(dòng)物而言，第一波和第二波肌管分別來(lái)自于胚胎和胎兒成肌細(xì)胞，并分別發(fā)育成初級(jí)和次級(jí)肌纖維[15]。但在一些大型動(dòng)物中，例如牛、綿羊、豬和人，在妊娠后期還會(huì)有第三波肌管形成[17-20]，這可能與這些動(dòng)物具有發(fā)達(dá)的骨骼肌有一定的關(guān)系。利用光學(xué)顯微鏡定量研究綿羊骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)胎兒期的40—80 d和100—120 d為骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期[17]。李雪嬌等對(duì)中國(guó)美利奴羊骨骼肌發(fā)育進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)胎兒期第75天前后肌纖維的形成基本完成，至第105天時(shí)肌纖維的數(shù)量基本恒定，此后骨骼肌的發(fā)育主要表現(xiàn)為肌纖維直徑和長(zhǎng)度的增加[21-22]。石田培等利用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)χ袊?guó)美利奴羊胎兒期骨骼肌中circRNA的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)胎兒期第85、105和135天這3個(gè)階段顯著富集了大量與肌肉發(fā)育相關(guān)的基因和通路[23]。提示這些階段骨骼肌中的基因表達(dá)模式發(fā)生了變化，以支持骨骼肌細(xì)胞不同生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)的轉(zhuǎn)換和維持。鑒于此，本研究進(jìn)一步細(xì)化采樣階段，對(duì)巴什拜羊胎兒期第40、50、60、80、100和120天，以及出生當(dāng)天，出生后第30，60和90天骨骼肌中miR-486的靶基因進(jìn)行深入挖掘，發(fā)現(xiàn)有96個(gè)候選靶基因在胎兒期和出生后均有表達(dá)，有27個(gè)和22個(gè)候選靶基因分別在胎兒期和出生后特異表達(dá)。對(duì)其中10個(gè)候選靶基因mRNA水平的定量研究結(jié)果表明，即使是共表達(dá)的候選靶基因，在巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)量亦有很大的變化，、和等7個(gè)候選靶基因在胎兒期巴什拜羊骨骼肌中呈高表達(dá)，出生后其表達(dá)量顯著下調(diào)，而在胎兒期低表達(dá)，出生后表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，僅有和兩個(gè)候選靶基因的表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化。結(jié)合前人研究結(jié)果，推測(cè)這些候選靶基因可能在維持不同發(fā)育階段骨骼肌細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

miR-486由（）的第40個(gè)內(nèi)含子編碼[24]，第40—42外顯子編碼的一個(gè)小分子Ank1蛋白僅在肌肉中表達(dá)，可將肌小節(jié)連接在肌質(zhì)網(wǎng)上[25]。到目前為止未發(fā)現(xiàn)miR-486尚有其他家族成員，且僅在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，其序列高度保守，在鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)和更低等的后生動(dòng)物中均未檢測(cè)到miR-486的表達(dá)[24]。miR-486在巴什拜羊的骨骼肌和心肌中高表達(dá)[10]，且其表達(dá)量在出生后巴什拜羊骨骼肌中極顯著上調(diào)[9]，推測(cè)miR-486在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用，本研究中發(fā)現(xiàn)的miR-486部分候選靶基因已證明與骨骼肌發(fā)育調(diào)控和機(jī)能維持密切相關(guān)，初步支持這一推測(cè)的可靠性。（phosphatase and tensin homolog）是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因，可以通過(guò)抑制PI3K的活性以及降低Akt的磷酸化水平影響下游mTOR信號(hào)通路，最終影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[26]。在成年人的骨骼肌中，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞處于靜止、激活和分化的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但是當(dāng)被敲除，大量的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞將不經(jīng)過(guò)增殖即進(jìn)入激活、提前成熟分化狀態(tài)，進(jìn)而造成骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞的消耗而最終影響骨骼肌損傷的修復(fù)和再生[27]?？梢源龠M(jìn)小鼠肌細(xì)胞融合，同時(shí)參與骨骼肌纖維分化的調(diào)控，在富含快肌纖維的骨骼肌組織中的表達(dá)量顯著高于富含慢肌纖維的骨骼肌組織[28-29]。在小鼠肌細(xì)胞中，miR-486抑制其靶基因和的表達(dá)進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路參與肌肉的生長(zhǎng)的調(diào)控和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持[24]。在杜氏肌應(yīng)用不良癥（duchenne muscular dystrophy, DMD）患者的肌肉組織中miR-486的表達(dá)量顯著下調(diào)，同時(shí)在DMD動(dòng)物模型骨骼肌中過(guò)表達(dá)miR-486，可降低DOCK3和PTEN的水平，進(jìn)而提高AKT的磷酸化水平并使肌營(yíng)養(yǎng)不良癥狀得到明顯緩解[30]。慢性腎?。╟hronic kidney disease, CKD）患者由于E3連接酶的激活，泛素蛋白酶體系統(tǒng)被活化，進(jìn)而引起肌肉中蛋白質(zhì)的分解，但是若上調(diào)肌肉中miR-486的水平可顯著抑制E3連接酶的表達(dá)，使患者的肌肉量明顯增多，進(jìn)一步研究表明這一過(guò)程是miR-486通過(guò)抑制的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)增加Foxo1磷酸化水平，降低PTEN磷酸化水平，最終使Akt的磷酸化水平顯著升高進(jìn)而激活相關(guān)信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)[31-32]。本研究已證實(shí)，在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向調(diào)控、、和4個(gè)基因的表達(dá)，但其在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能尚有待后續(xù)試驗(yàn)闡明。

KEGG分析結(jié)果表明，miR-486通過(guò)調(diào)控其候選靶基因的表達(dá)同時(shí)參與多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控。例如同時(shí)參與mTOR signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、FoxO signaling pathway、MAPK signaling pathway、Ras signaling pathway 和Adherens junction等信號(hào)通路的調(diào)控，同時(shí)參與Phosphatidylinositol signaling system、PI3K-Akt signaling pathway、FoxO signaling pathway、mTOR signaling pathway和Insulin signaling pathway等信號(hào)通路的調(diào)控，很多信號(hào)通路已證明與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控密切相關(guān)[33-37]，在小鼠中的研究結(jié)果表明，其骨骼肌中miR-486的表達(dá)受的調(diào)控，通過(guò)miR-486轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可將myostatin信號(hào)通路和IGF-1/Akt/ mTOR信號(hào)通路有效整合[8]。在人類(lèi)骨骼肌中，miR-486可通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、ubiquitin proteasome、FoxO和mTOR信號(hào)通路，使骨骼肌組織很好地適應(yīng)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練[38-39]，提示miR-486可能在溝通和協(xié)調(diào)巴什拜羊骨骼肌內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用。

在細(xì)胞質(zhì)中miRNA首先與Argonaute蛋白組裝成為miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRISC），然后miRNA通過(guò)其種子序列與靶基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合引導(dǎo)miRISC結(jié)合到其靶基因mRNA的靶位點(diǎn)上，進(jìn)而調(diào)控其靶基因的翻譯[40-41]，但在動(dòng)物中miRNA是通過(guò)抑制其靶基因mRNA的翻譯還是誘導(dǎo)其降解實(shí)現(xiàn)其對(duì)靶基因的調(diào)控尚存在爭(zhēng)議，有研究結(jié)果表明在動(dòng)物細(xì)胞中miRNA主要是抑制其靶基因mRNA的翻譯，并不會(huì)誘導(dǎo)mRNA的降解[42]，但也有相關(guān)研究檢測(cè)到了miRNA誘導(dǎo)的mRNA降解[43]?；蛟SDjuranovic等的研究可以更好地解釋這一問(wèn)題，他們利用果蠅S2細(xì)胞建立了一個(gè)可控的表達(dá)系統(tǒng)，并以此研究了miRNA對(duì)其靶基因調(diào)控的動(dòng)力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)miRNA不論跟天然的或者人工合成的3′ UTR區(qū)靶位點(diǎn)結(jié)合，首先是抑制其翻譯，進(jìn)而引起mRNA的脫腺苷化和降解，所以miRNA可能是先抑制其靶基因mRNA的翻譯，然后再誘導(dǎo)其降解來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)靶基因的調(diào)控，若在抑制階段檢測(cè)細(xì)胞中mRNA的水平，則會(huì)得出miRNA不會(huì)誘導(dǎo)mRNA降解的結(jié)論[44- 45]。本研究中上調(diào)巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中miR-486的水平，至24 h其靶基因和的mRNA水平未見(jiàn)顯著降低（＞0.05），但是至48和72 h時(shí)和的mRNA水平顯著低于對(duì)照組（＜0.05），與此不同的是和的mRNA水平至24 h時(shí)即可檢測(cè)到顯著降低（＜0.05）。同為miR-486的靶基因，其調(diào)控方式卻存在不同，其機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。通過(guò)靶位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，miR-486在的mRNA上有3個(gè)靶位點(diǎn)，其中一個(gè)位于CDS區(qū)，在的mRNA上有2個(gè)靶位點(diǎn)，而在和的mRNA上僅檢測(cè)到1個(gè)靶位點(diǎn)，這種調(diào)控方式的差異是否與靶位點(diǎn)的位置和數(shù)量有關(guān)尚有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，當(dāng)下調(diào)巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中miR-486時(shí)，僅檢測(cè)到的mRNA水平較對(duì)照組顯著升高，其他3個(gè)靶基因mRNA水平未見(jiàn)顯著變化（＞0.05），其機(jī)理亦有待進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

本研究采用構(gòu)建cDNA文庫(kù)結(jié)合高通量測(cè)序的方法首次對(duì)巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miR-486的靶基因進(jìn)行了深入研究，在胎兒期和出生后骨骼肌中分別檢測(cè)到123個(gè)和118個(gè)miR-486的候選靶基因，功能分析結(jié)果表明候選靶基因顯著富集于PI3k-Akt、Wnt和MAPK等已證明與肌肉發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)的信號(hào)通路。其中、、、、、和7個(gè)候選靶基因在胎兒期巴什拜羊骨骼肌中呈高表達(dá)，出生后其表達(dá)量顯著下調(diào)，而候選靶基因呈相反的表達(dá)趨勢(shì)，提示這些基因在巴什拜羊胎兒期和出生后骨骼肌發(fā)育狀態(tài)轉(zhuǎn)換中可能發(fā)揮著重要作用。選擇、、和4個(gè)候選靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確認(rèn)miR-486與所選4個(gè)候選靶基因存在靶向調(diào)控關(guān)系，說(shuō)明本研究獲得的miR-486的靶基因數(shù)據(jù)可靠性高。

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Investigation of miR-486 Target Genes in Skeletal Muscle of Bashbay Sheep in Different Development Periods

ZHANG Wei1, 2, WANG ShiYin1, GAO Li1, YANG LiWei1, DENG ShuangYi1, LIU XiaoNa1, SHI GuoQing2, GAN ShangQuan2

1Xinjiang Agricultural Professional Technological College, Changji 831100, Xinjiang;2State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production/Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi 832000, Xinjiang

【】The aim of this study was to deeply reveal the target genes of miR-486 in skeletal muscle of Bashbay sheep during different development periods, and to get basic data for finally uncover the molecular regulation mechanism of excellent meat traits of this sheep breed, then finally to support to further breeding. 【】The skeletal muscle of Bashbay sheep were collected during 40 d, 50 d, 60 d, 80 d, 100 d and 120 d of fetal period, and 1, 2, and 3 months old of new born sheep. The total RNA was extracted, and two cDNA libraries of miR-486 target genes were constructed using mRNA of fetal and postnatal period, respectively, then the library was sequenced applied high-throughput sequencing technology. Based on the function analysis, 10 candidate target genes were selected, and their express patterns in Bashbay sheep skeletal muscle of 10 development periods mentioned above were detected by qRT-PCR. By analyzing the expression pattern of these 10 candidate target genes and miR-486 in skeletal muscle of Bashbay sheep, their target regulation relationship and functions were primarily verified. Finally, 4 candidate target genes were chosen to confirm their regulation relationship using the double luciferase reporter assay and target regulation assay in satellite cell of skeletal muscle of Bashbay sheep. 【】Total 123 and 118 target genes of fetal and postnatal period were obtained, respectively. Due to these target genes were not confirmed by further function assay, so they were called candidate target genes temporarily. Among of them, 96 genes were expressed in skeletal muscle of fetal and postnatal period, 27 and 22 genes were specially expressed in these two periods respectively. The result of GO and KEGG analysis showed that these candidate target genes regulated mass pathways related to muscle cell differentiation and development, just like PI3k-Akt, MAPK, Wnt, Adherens junction and Regulation of actin cytoskeleton, etc. All 10 candidate target genes were expressed in skeletal muscle of Bashbay sheep, but their expression patterns were different. Among of them,,,,,,andwere expressed at a relatively high level in the fetal period skeletal muscle of Bashbay sheep, but were significantly down regulated during postnatal period, andshowed an opposite expression pattern compared with above 7 genes. The expression ofandgene did not found significantly change in all 10 development periods of Bashbay sheep. The result of double luciferase reporter assay showed that miR-486 could bind the target sites of,,andefficiently, and significantly suppressed the activity of firefly luciferase. In skeletal muscle satellite cell, mir-486 also could down-regulate mRNA of these four genes significantly, and finally suppressed their biology functions. So it was ultimately confirmed that miR-486 could regulate these 4 target genes indeed in skeletal muscle of Bashbay sheep. 【】The investigation deeply revealed the target genes of miR-486 in skeletal muscle of Bashbay sheep during different development periods for the first time, and comprehensively analyzed the biology process and signaling pathway they participated. The further function assay proved that the data of target genes were reliable. These data would help to uncover the molecular regulation mechanisms related to excellent meat traits of Bashbay sheep.

Bashbay sheep; miR-486; target gene; skeletal muscle; cDNA library

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.018

2020-06-03；

2020-10-30

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2017D01A51）

張偉，E-mail：zhangweigsau@163.com。通信作者王世銀，E-mail：wangshiyinxjnzy@163.com。通信作者甘尚權(quán)，E-mail：shangquangan @163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）