蘋(píng)果LRR-RLK基因家族鑒定和表達(dá)分析

黃金鳳，呂天星，王尋，王穎達(dá)，王冬梅，閆忠業(yè)，劉志

蘋(píng)果LRR-RLK基因家族鑒定和表達(dá)分析

1遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所，遼寧營(yíng)口 115009；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018

【】從蘋(píng)果全基因組中鑒定LRR-RLK家族蛋白成員，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，為研究蘋(píng)果LRR-RLK的潛在功能提供理論基礎(chǔ)。利用BLASTp基于GDR數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蘋(píng)果LRR-RLK家族成員，通過(guò)ExPASy Proteomics Server、Cell-PLoc、CD-Search Tool、MEGAX、MG2C等軟件分析LRR-RLK蛋白序列基本信息、亞細(xì)胞定位情況、結(jié)構(gòu)域組成、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及染色體定位情況。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)蘋(píng)果12個(gè)的組織表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)特性。蘋(píng)果LRR-RLK基因家族包含378個(gè)成員，這些LRR-RLK蛋白包括318—1 827個(gè)不等的氨基酸殘基，等電點(diǎn)分布在5.16—9.75。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示LRR-RLK蛋白均定位在細(xì)胞膜。系統(tǒng)進(jìn)化分析可將其分為15類，各亞家族基因數(shù)量分布在1—111。染色體定位結(jié)果顯示，LRR-RLK在蘋(píng)果17條染色體上均有分布，其中第7條染色體數(shù)量最多，為40個(gè)。LRR-RLK家族基因具有2個(gè)特定的保守結(jié)構(gòu)域，分別是LRR結(jié)構(gòu)和蛋白激酶結(jié)構(gòu)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，其次是-螺旋，-轉(zhuǎn)角所占比例最小。通過(guò)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)篩選的12個(gè)家族成員在各組織中均有表達(dá)（除MD00G1105400外），且多數(shù)基因在莖中表達(dá)水平相對(duì)較高。低溫條件下，7個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，其中MD09G1153800上調(diào)最明顯，最高為對(duì)照的6.8倍，而MD06G1170200和MD05G1061600均下調(diào)表達(dá)；在干旱條件下，8個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，其中MD00G1105400上調(diào)最明顯，最高為對(duì)照的9.6倍；在鹽脅迫條件下，MD04G1150400、MD13G1108000和MD02G1071800始終處于上調(diào)表達(dá)狀態(tài)，其中MD02G1071800上調(diào)最明顯，最高為對(duì)照的14.9倍。蘋(píng)果新梢接種輪紋病菌后，12個(gè)LRR-RLK家族基因表達(dá)基本上呈先上升后下降的趨勢(shì)。并且在‘望山紅’中，1 d時(shí)表達(dá)水平較高，而在‘雞冠’中，3 d時(shí)表達(dá)水平較高。MD09G1153800和 MD05G1065800在‘雞冠’響應(yīng)輪紋病菌侵染過(guò)程中顯著上調(diào)表達(dá)，而在‘望山紅’中無(wú)響應(yīng)，可作為進(jìn)一步開(kāi)展抗病研究和功能分析的候選基因。蘋(píng)果LRR-RLK基因家族包含378個(gè)成員，進(jìn)化上可分為15組，在17條染色體上均有分布，多數(shù)基因具有在莖中高表達(dá)的組織表達(dá)特征，多數(shù)基因受逆境和輪紋病菌調(diào)控。

蘋(píng)果；LRR-RLK；基因家族；鑒定；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】富含亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor like kinase，LRR-RLK）是植物類受體激酶家族中最大的一類，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫和病原體防御中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1-4]。對(duì)蘋(píng)果（×Borkh.）富含亮氨酸重復(fù)的受體蛋白家族基因進(jìn)行全面的生物信息學(xué)、組織表達(dá)特征及逆境脅迫的響應(yīng)研究，有利于更深入了解LRR-RLK家族基因的功能，并對(duì)蘋(píng)果品種的遺傳改良具有重要的參考意義。【前人研究進(jìn)展】富含亮氨酸受體蛋白激酶含有胞外LRR結(jié)構(gòu)域（2—35個(gè)）、單次跨膜區(qū)和胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域[5-6]。LRR-RLK由N-胞外結(jié)構(gòu)域感受胞外信號(hào)并將信息經(jīng)跨膜區(qū)傳遞至C-胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，使其發(fā)生磷酸化或去磷酸化等反應(yīng)，開(kāi)啟或關(guān)閉下游靶蛋白，從而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和防衛(wèi)反應(yīng)[7]。雖然，植物中存在大量的LRR-RLKs，但大多數(shù)LRR-RLK家族成員的生物學(xué)功能仍不清楚，而且已進(jìn)行功能分析的LRR-RLK也大部分局限于模式植物。這源于LRR-RLKs的配基多數(shù)未知，且參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑復(fù)雜[8-9]。在擬南芥（）中，識(shí)別病原體的鞭毛蛋白后誘發(fā)一系列防衛(wèi)反應(yīng)，如活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)形成等，這些防衛(wèi)反應(yīng)限制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而起到抗病作用[10]。擬南芥的特異識(shí)別細(xì)菌延伸因子中高度保守的18個(gè)氨基酸多肽，用以激活防衛(wèi)反應(yīng)[11]。水稻（L.）抗白葉枯病基因，通過(guò)識(shí)別由細(xì)菌細(xì)胞分泌的硫酸化多肽引發(fā)胞內(nèi)的抗逆反應(yīng)[12]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，參與水稻對(duì)白葉枯病菌的響應(yīng)，并且正調(diào)控介導(dǎo)抗病性[13]。在中感白粉病小麥（L.）品種‘揚(yáng)麥158’中過(guò)表達(dá)或，能顯著增強(qiáng)對(duì)白粉病的抗性[14]。是一種重要的植物類受體胞質(zhì)激酶相關(guān)基因，正向調(diào)控多條免疫防御反應(yīng)。而和是介導(dǎo)防御機(jī)制的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在靠近膜結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了高密度的-磷酸化位點(diǎn)，可被-磷酸化，發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。競(jìng)爭(zhēng)性抑制與相互作用，以阻止受體復(fù)合物形成[15-16]。表達(dá)譜分析顯示棉花（L.）的LRR-RLK廣泛參與防衛(wèi)反應(yīng)[17]。以上研究表明LRR-RLK在植物免疫抗病中起重要調(diào)控作用，但是不同LRR-RLK的功能和作用方式可能不同，有的仍需進(jìn)一步研究。LRR-RLK還參與對(duì)干旱、鹽等非生物脅迫的響應(yīng)：過(guò)表達(dá)可提高玉米（L）在干旱脅迫下的水分利用率和凈光合速率，表明在干旱脅迫中起著重要作用[18]；水稻的通過(guò)調(diào)節(jié)ROS清除系統(tǒng)、Na+/K+比率和MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)鹽脅迫的正調(diào)控作用[19]；在低硝酸鹽條件下，通過(guò)增加硝酸鹽同化作用并上調(diào)參與硝酸鹽同化的基因，如的過(guò)表達(dá)促進(jìn)蘋(píng)果愈傷組織和擬南芥的生長(zhǎng)[20]；在冷熱脅迫和干旱條件下，水稻均上調(diào)表達(dá)其啟動(dòng)子區(qū)包含與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，進(jìn)一步證明參與非生物脅迫耐受性[21]。LRR-RLK還參與生長(zhǎng)和發(fā)育的形態(tài)建成過(guò)程：擬南芥的參與木質(zhì)部纖維中次生細(xì)胞壁的形成[22]；擬南芥過(guò)表達(dá)株系比對(duì)照株系開(kāi)花早[23]；通過(guò)其近膜和激酶結(jié)構(gòu)域與相互作用，在花粉管的極性生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用[24]；擬南芥中的和既可調(diào)節(jié)側(cè)根原基發(fā)生，也可調(diào)節(jié)局部側(cè)根的形成，同時(shí)可通過(guò)響應(yīng)芽衍生的蔗糖控制側(cè)根延伸。此外，這兩種受體的突變都會(huì)阻止幼苗對(duì)蔗糖作出響應(yīng)，從而導(dǎo)致側(cè)根較長(zhǎng)[25]；是一種新型的富含亮氨酸的重復(fù)受體樣激酶，它通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)水稻中生長(zhǎng)素的極性轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)影響根系結(jié)構(gòu)[26]。以上研究表明，LRR-RLK廣泛參與了植物的防御反應(yīng)及多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在已有研究中，蘋(píng)果LRR-RLK基因家族已基于version 1.0版本基因組進(jìn)行過(guò)鑒定分析[9,27]。由于早期版本基因組拼接和注釋的質(zhì)量有限，所以基于更通用的GDDH13 v1.1 版本基因組對(duì)LRR-RLK家族進(jìn)行分析，將會(huì)提供更全面準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果[28]。并且蘋(píng)果LRR-RLK基因家族成員的組織表達(dá)特性、生物脅迫及非生物脅迫表達(dá)模式未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用生物信息學(xué)分析方法，分析蘋(píng)果LRR-RLK基因家族的成員數(shù)量及分類、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及系統(tǒng)進(jìn)化，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)的組織表達(dá)特異性和脅迫表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究蘋(píng)果LRR-RLK基因家族的生物學(xué)功能，并應(yīng)用于蘋(píng)果品種的遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年10月至2020年7月在遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所進(jìn)行。

1.1 材料與處理

試驗(yàn)材料為種植于遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所蘋(píng)果育種實(shí)驗(yàn)基地的‘望山紅’和‘雞冠’蘋(píng)果（Borkh.），砧木為平邑甜茶（），以及生長(zhǎng)于光照培養(yǎng)箱的‘平邑甜茶’幼苗。

取15年生‘望山紅’蘋(píng)果樹(shù)的莖、葉片、花（初花期）、果實(shí)（花后30 d），液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱貯藏，用于的組織表達(dá)分析。

取‘平邑甜茶’種子，催芽后播種于裝有混合基質(zhì)的紙杯中，置于人工氣候箱培養(yǎng)（溫度25℃，光照16 h/黑暗8 h）。選取生長(zhǎng)狀況較為一致的1個(gè)月大幼苗。分別用300 mmol?L-1NaCl和10%的PEG澆灌根系，以及用4℃低溫處理‘平邑甜茶’幼苗。以上各處理培養(yǎng)0、6、12、24和48 h時(shí)分別全株取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取實(shí)生苗5株，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。液氮速凍，-80℃貯藏備用，用于開(kāi)展非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析。

在田間選取長(zhǎng)勢(shì)一致的2年生抗病蘋(píng)果品種‘雞冠’和感病品種‘望山紅’新梢，長(zhǎng)度約15 cm，用于輪紋病菌接種試驗(yàn)。輪紋病病原菌（）由筆者課題組分離純化獲得。配置濃度為1×105個(gè)/mL病菌孢子懸液，用10 cm長(zhǎng)的濾紙條蘸取孢子懸液，包裹于蘋(píng)果新梢上，保濕培養(yǎng)。于0、1、3和5 d分別取新梢接種部位的韌皮部。每個(gè)處理取5條新梢，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。液氮速凍，-80℃貯藏備用，用于開(kāi)展的輪紋病誘導(dǎo)表達(dá)分析。

1.2 蘋(píng)果LRR-RLK家族成員進(jìn)化分析及基本性質(zhì)

蘋(píng)果全基因組數(shù)據(jù)下載于薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR（http://www.rosaceae.org/）。擬南芥（）LRR-RLK蛋白序列下載自擬南芥在線信息資源TAIR（http://www.arabidopsis.org/）。以擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中225個(gè)已知LRR-RLK蛋白為問(wèn)詢序列，利用BLAST（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/）軟件逐一比對(duì)，檢索本地蘋(píng)果數(shù)據(jù)庫(kù)中LRR-RLK蛋白，并刪除重復(fù)序列[9]。對(duì)初步鑒定獲得的候選基因，利用保守域預(yù)測(cè)軟件Pfam（https://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）進(jìn)行分析，確保上述候選基因同時(shí)含有胞外LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。利用MEGA X（http://www.megasoftware.net）軟件，以最大釋然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)分析，選擇WAG+G+F模型、部分刪除（Partial deletion）和1 000次重復(fù)（Bootstrap replicated 1 000 times）。并利用在線軟件iTOL（https://itol.embl.de/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行可視化展示。

采用ExPASyProteomics Server（http://web.expasy. org/protparam/）在線分析蘋(píng)果LRR-RLK蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度、分子量和等電點(diǎn)。利用在線軟件Cell-PLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進(jìn)行亞細(xì)胞預(yù)測(cè)分析。

1.3 蘋(píng)果LRR-RLK基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

利用MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）工具進(jìn)行基因染色體位置可視化分析。采用GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 蘋(píng)果LRR-RLK家族基因motif及結(jié)構(gòu)域分析

鑒于蘋(píng)果LRR-RLK基因家族數(shù)目較多，為了便于展示，選取數(shù)目中等的III亞家族蛋白（50個(gè)）進(jìn)行motif與結(jié)構(gòu)域分析。其中motif分析利用在線軟件MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行，基序數(shù)量設(shè)置15個(gè)，其余參數(shù)默認(rèn)。利用在線工具Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)蘋(píng)果LRR-RLK蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.5 蘋(píng)果LRR-RLK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

因LRR-RLK家族蛋白數(shù)目龐大，每個(gè)亞組隨機(jī)選出1個(gè)代表，共21個(gè)，利用在線分析工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量分析

采用CTAB法，選取‘望山紅’蘋(píng)果樹(shù)的根、莖、葉、花、果不同組織，4℃低溫、10% PEG和300 mmol?L-1NaCl處理不同時(shí)間點(diǎn)取樣的‘平邑甜茶’蘋(píng)果幼苗，以及輪紋病菌侵染的‘望山紅’與‘雞冠’新梢韌皮部組織提取RNA。使用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑盒（CW2582，康為世紀(jì)），將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA供熒光定量使用。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，Thermo Nano Drop 2000儀器檢測(cè)濃度和質(zhì)量。選取前期研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序抗（‘望山紅’）/感（‘雞冠’）輪紋病材料差異表達(dá)基因（未發(fā)表）12個(gè)，推測(cè)這些基因在生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫中發(fā)揮重要功能，開(kāi)展熒光定量表達(dá)分析。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，所有引物特異性均經(jīng)過(guò)NCBI的Nucleotide BLAST和Primer-BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）驗(yàn)證。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見(jiàn)表1，選用作為內(nèi)參基因[29]。試驗(yàn)儀器為QuantStudio? 6 Flex熒光定量PCR儀（Thermo公司）。反應(yīng)體系：SYBR Green（CW2601，康為世紀(jì)）10 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物（生工生物工程有限公司）各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，cDNA 2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3次重復(fù)。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT計(jì)算，利用SPSS 18.0進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平為＜0.05，并用Excel作圖。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

2 結(jié)果

2.1 蘋(píng)果LRR-RLK家族成員進(jìn)化分析及基本信息

2.1.1 蘋(píng)果LRR-RLK成員進(jìn)化分析 從蘋(píng)果基因組序列中鑒定得到378個(gè)LRR-RLK家族成員。為分析蛋白間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用MEGAX軟件對(duì)378個(gè)蘋(píng)果和225個(gè)擬南芥的LRR-RLK蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。如圖1所示，根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近將所有LRR-RLK蛋白分成15組（I—XV），進(jìn)一步細(xì)化可分成21個(gè)亞組。在蘋(píng)果中成員最多的為XII亞家族，包含111個(gè)基因；其次為XI-1亞家族，包含74個(gè)成員；然后是III亞家族，包含50個(gè)成員；而XIIIb亞家族成員最少，只包含1個(gè)蛋白。

2.1.2 蘋(píng)果LRR-RLK成員基本信息 通過(guò)保守域預(yù)測(cè)軟件Pfam和SMART分析表明，所有鑒定出的378個(gè)LRR-RLK均具有N-末端LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-末端Pkinase結(jié)構(gòu)域。各亞家族基因數(shù)目差異較大，從1—111個(gè)不等。其序列氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)和LRR數(shù)分別介于318—1 827、34.95— 199.33、5.16—9.75和1—20（表2）。利用在線軟件CELLO v.2.5對(duì)所有基因成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)均定位于細(xì)胞質(zhì)膜。

圖1 蘋(píng)果LRR-RLK基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表2 蘋(píng)果LRR-RLK家族成員信息

2.2 蘋(píng)果LRR-RLK家族染色體定位及結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，LRR-RLK基因家族的378個(gè)成員在蘋(píng)果的17條染色體上均有分布。7號(hào)染色體（Chr 07）分布的LRR-RLK成員最多，為40個(gè)，其次為5號(hào)染色體（Chr 05），共29個(gè)成員，且基因大多分布在染色體下端；定位在6號(hào)染色體（Chr 06）的LRR-RLK最少，僅包含7個(gè)成員。

因蘋(píng)果LRR-RLK家族數(shù)目較龐大，每個(gè)亞家族隨機(jī)選一個(gè)基因，共21個(gè)，經(jīng)在線軟件GSDS 2.0對(duì)其進(jìn)行可視化分析。由圖3可知，該家族基因結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，外顯子數(shù)量從1—27，內(nèi)含子子數(shù)目0—26。氨基酸在外顯子上的分布位置差異較大，序列的長(zhǎng)度也各不相同，推測(cè)不同亞族之間功能上可能差異較大。

2.3 III亞家族motif及結(jié)構(gòu)域分析

2.3.1 III亞家族motif分析 由于蘋(píng)果LRR-RLK基因家族成員數(shù)目較多，選取數(shù)目中等的III亞家族為代表，利用MEME在線工具開(kāi)展motif分析。經(jīng)分析得到15個(gè)保守基序，50個(gè)基因的motif分布（圖 4）存在以下規(guī)律：順序?yàn)閙otif 14-motif 11-motif 9-motif 10-motif 12-motif 1-motif 15-motif 7-motif 4-motif 5-motif 8-motif 13-motif 2-motif 6-motif 3。III亞家族成員motif 1—motif 15比例分別為100.0%、92.0%、82.0%、88.0%、96.0%、74.0%、100.0%、94.0%、100.0%、100.0%、100.0%、74.0%、78.0%、72.0%、94.0%。由此可知III亞家族成員結(jié)構(gòu)相似且較為保守，可能在蘋(píng)果的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮相似的功能。對(duì)每個(gè)motif分析發(fā)現(xiàn)，motif 1和motif 13均含有29個(gè)保守氨基酸，而motif 15含保守氨基酸較少，只有11個(gè)。III亞家族最主要的motif 有5個(gè)，分別為motif 1、motif 7、motif 9、motif 10和motif 11。N端均含有3個(gè)LRR結(jié)構(gòu)保守核心氨基酸殘基：XXLXLXX（motif 14、motif 9和motif 11）。

圖2 蘋(píng)果LRR-RLK基因家族染色體定位分析

圖3 蘋(píng)果LRR-RLK家族基因結(jié)構(gòu)

2.3.2 III亞家族保守結(jié)構(gòu)域分析 III亞家族基因主要結(jié)構(gòu)域有3個(gè)，包括LRRNT-2、PLN00113超級(jí)家族和PKc-like超級(jí)家族（圖5）。對(duì)比圖5的motif與圖7的結(jié)構(gòu)域可知motif 14-motif 11-motif 9-motif 10-motif 12-motif 1-motif 15-motif 7-motif 4-motif 5- motif 8-motif 13-motif 2-motif 6-motif 3屬于PLN00113超級(jí)家族，而其中的motif 1-motif 15-motif 7-motif 4- motif 5-motif 8-motif 13-motif 2-motif 6-motif 3又屬于PKc-like超級(jí)家族。

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件SOPMA對(duì)21個(gè)亞家族代表LRR-RLK蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。所有蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)都以螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，其中螺旋占26.88%—41.63%，無(wú)規(guī)則卷曲占38.59%— 52.26%，此外二級(jí)結(jié)構(gòu)中還包含轉(zhuǎn)角（占1.80%— 7.75%）和延長(zhǎng)鏈（占11.3%—19.48%），兩者所占比例較小。

2.5 蘋(píng)果LRR-RLK表達(dá)分析

2.5.1 組織表達(dá)分析 利用qRT-PCR技術(shù)分析12個(gè)在蘋(píng)果莖、葉、花和果實(shí)中的表達(dá)情況（圖6），引物見(jiàn)表1。除MD00G1105400外，其余11個(gè)基因在各組織中均有表達(dá)。MD03G1138500、MD05G1061600、MD13G1108000、MD05G1261100、MD02G1071800和MD15G1288500主要在莖中表達(dá)，MD06G1170200、MD03G1036900和MD05G1065800主要在花中表達(dá)，MD04G1150400主要在果實(shí)中表達(dá)。

2.5.2 非生物脅迫下的表達(dá)分析 利用qRT-PCR分析‘平邑甜茶’蘋(píng)果LRR-RLK基因家族中12個(gè)代表基因分別在4℃、10% PEG以及300 mmol?L-1NaCl處理下的相對(duì)表達(dá)量（圖7）。

4℃處理下，MD09G1153800、MD04G1150400、MD03G1138500、MD06G1170200、MD03G1036900、MD05G1061600、MD00G1105400至少在其中一個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生了差異表達(dá)。在以上差異表達(dá)的中，MD09G1153800上調(diào)表達(dá)最為明顯，在4℃處理6 h后表達(dá)量為對(duì)照的6.8倍。而MD06G1170200和MD05G1061600在0—48 h均下調(diào)表達(dá)，表達(dá)量不到對(duì)照的20%，推測(cè)兩者可能在響應(yīng)低溫時(shí)起到負(fù)調(diào)控作用。

A：III亞家族motif 分析；B：15個(gè)保守位點(diǎn)LOGO圖 A: III subfamily motif analysis; B: Logo of 15 conserved motif

圖5 III亞家族保守結(jié)構(gòu)域

10% PEG處理下，除MD04G1150400、MD02G1071800、MD05G1065800和MD15G1288500對(duì)干旱脅迫無(wú)響應(yīng)外，其余基因至少在其中一個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生了差異表達(dá)。其中MD00G1105400上調(diào)表達(dá)最明顯，PEG處理24 h時(shí)的表達(dá)量為對(duì)照的9.6倍。

NaCl處理下，MD04G1150400、MD13G1108000和MD02G1071800在鹽脅迫條件下始終處于上調(diào)表達(dá)。推測(cè)其在響應(yīng)鹽脅時(shí)起正調(diào)控作用。其中MD02G1071800在鹽脅迫下處理12 h的表達(dá)量最高為對(duì)照的14.9倍。而MD03G1138500、MD06G1170200、MD03G1036900、MD05G1061600和MD15G1288500對(duì)鹽脅迫信號(hào)均無(wú)響應(yīng)。

2.5.3 輪紋病菌誘導(dǎo)表達(dá)分析 分別用1×105個(gè)/mL輪紋病菌孢子懸液處理2年生‘望山紅’與‘雞冠’新梢。由圖8可知，接種3 d時(shí)，MD09G1153800在‘雞冠’中表達(dá)量顯著上調(diào)，為對(duì)照的75.6倍，而在‘望山紅’中表達(dá)量為對(duì)照的1.9倍，推測(cè)MD09G1153800在抗輪紋病過(guò)程中可能起到正調(diào)控作用。MD05G1065800在輪紋病侵染‘望山紅’過(guò)程中表達(dá)量始終無(wú)差異，表明在感病品種中此基因不受誘導(dǎo)，而在抗病品種‘雞冠’中，3 d時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量為對(duì)照的11倍，推測(cè)其可能在抗病中起到正調(diào)控作用。MD02G1071800在‘雞冠’中呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，接種3 d時(shí)，表達(dá)量顯著上調(diào)，為對(duì)照的16.3倍，而感病品種‘望山紅’與對(duì)照差異不顯著。MD00G1105400在‘望山紅’接種輪紋病菌1 d時(shí)表達(dá)量是對(duì)照的286.9倍，抗病品種‘雞冠’接種3 d時(shí)，表達(dá)量是對(duì)照的191倍，表明MD00G1105400參與蘋(píng)果響應(yīng)輪紋病侵染的過(guò)程。從整體上看，12個(gè)表達(dá)基本上呈先上升后下降趨勢(shì)。

表3 蘋(píng)果LRR-RLK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

圖7 不同非生物脅迫下蘋(píng)果LRR-RLK的相對(duì)表達(dá)量

圖8 蘋(píng)果LRR-RLK響應(yīng)輪紋病菌侵染的表達(dá)模式

3 討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中因受到外界環(huán)境及內(nèi)部信號(hào)的刺激，引發(fā)一系列的信號(hào)傳遞。植物類受體蛋白激酶是植物許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分[30-31]。而富含亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶是RLKs家族中當(dāng)中最大的一類。目前，LRR-RLK已經(jīng)在許多植物中被鑒定，如擬南芥225個(gè)[9]、大豆（(L.) Merr.）467個(gè)[32]、棉花543個(gè)[33]、可可（L.）253個(gè)[34]、柑橘（L.）300個(gè)[35]。本研究依據(jù)LRR-RLK的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可將LRR-RLK分為15組，這與擬南芥和棉花中對(duì)LRR-RLK的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究具有相似性[9,17]。蘋(píng)果LRR-RLK家族的蛋白質(zhì)大小在318— 1 827、分子量在34.95—199.33 kD，PI在5.19—9.14，表明LRR-RLK家族成員間的蛋白質(zhì)大小、PI等特征差異較大，這一結(jié)果與其他物種相似[36]。基因結(jié)構(gòu)分析顯示CDS數(shù)量1—27個(gè)，內(nèi)含子數(shù)目0—26個(gè)，表明該家族基因結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，推測(cè)不同亞族之間功能上可能差異較大。這與Liu等[37]對(duì)擬南芥、苜蓿、狐米草和異葉卷柏等4種植物的LRR-RLK研究結(jié)果類似。Motif結(jié)構(gòu)與分析表明，在LRR-RLK基因家族中各亞家族內(nèi)部成員結(jié)構(gòu)類似且相對(duì)保守，可能在蘋(píng)果的生命過(guò)程中發(fā)揮相似的功能。II與III亞家族主要存在2個(gè)保守序列，分別是LRR基序、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。該基因家族與擬南芥、大豆LRR-RLK基因家族高度相似[9,32]。

LRR-RLK廣泛參與了根、葉、花、莖和果的生長(zhǎng)發(fā)育[4,38-39]。本研究通過(guò)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，篩選的12個(gè)家族成員在各組織中均有表達(dá)（除MD00G1105400外），且多數(shù)基因在莖中表達(dá)水平相對(duì)較高。MD09G1153800、MD00G1105400對(duì)低溫、干旱、鹽脅迫均有響應(yīng)，與在馬鈴薯和水稻中的研究結(jié)果類似[4,40]。由此推測(cè)兩者可能參與了蘋(píng)果對(duì)逆境的響應(yīng)調(diào)控。而MD15G1288500對(duì)上述3種非生物脅迫均無(wú)響應(yīng)，此現(xiàn)象在其他基因家族中也存在[41]。

輪紋病是蘋(píng)果三大真菌病害之一，而抗病基因的鑒定可為綜合防控提供理論參考[42]。目前，LRR-RLK在植物抗病方面已經(jīng)開(kāi)展了較為廣泛的研究，如通過(guò)QTL定位發(fā)現(xiàn)在基因座中編碼LRR-RLK家族蛋白的基因與葡萄霜霉病抗性有關(guān)[43]。是蘋(píng)果中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的LRR型受體蛋白激酶相關(guān)基因[44]。和參與對(duì)黑星病的抗性[45-46]。和在抗黑星病基因存時(shí)對(duì)病原菌做出響應(yīng)，可能參與病原體信號(hào)的識(shí)別。而和的表達(dá)譜不依賴于的存在，可能參與了植物的基礎(chǔ)防御[47]。本研究中，接種輪紋病菌后，蘋(píng)果LRR-RLK家族多個(gè)成員差異表達(dá)，但MD00G1105400在抗感蘋(píng)果品種響應(yīng)輪紋病誘導(dǎo)過(guò)程中均出現(xiàn)較高表達(dá)水平，僅可表明其參與對(duì)病原菌入侵的響應(yīng)，而非抗病的關(guān)鍵成員。

4 結(jié)論

從蘋(píng)果全基因組中獲得378個(gè)LRR-RLK基因家族成員，均含有LRR區(qū)、跨膜區(qū)和激酶區(qū)等保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析可將LRR-RLK分為15大類和21個(gè)亞類。多數(shù)蘋(píng)果LRR-RLK在莖中高表達(dá)。低溫條件下，7個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；在干旱條件下，8個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；在鹽脅迫條件下，MD04G1150400、MD13G1108000和MD02G1071800始終處于上調(diào)表達(dá)狀態(tài)；MD09G1153800和MD05G1065800可能參與‘雞冠’對(duì)輪紋病菌的抗性形成。

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Genome-Wide Identification and Expression Pattern Analysis of LRR-RLK Gene Family in Apple

1Liaoning Institute of Pomology, Yingkou 115009, Liaoning;2College of Horticultural Science and Engineering, Shangdong Agricultural University, Tai’an 271018, Shangdong

【】 The study was carried out to explore the whole genome characteristics and expression patterns ofin apple, to reveal the expression specificity of family members in different tissues and their responses to biological and abiotic stress, and further understand its biological function in apple. 【】 The members of LRR-RLK gene family in the whole genome of apple were identified based on the local BLAST database and Pfam database. The LRR-RLK amino acid sequence prediction, subcellular localization prediction, domain analysis, phylogenetic tree and chromosome localization were completed by software of ExPASy Proteomics Server, Cell-PLoc, CD-Search Tool, MEGAX and MG2C. In addition, the expression pattern of 12genes in different tissues and stress were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR).【】 A total of 378genes were identified from apple genome. Thesegenes encoded proteins containing 318-1 827 amino acid, and the theoretical isoelectric point ranged from 6.14 to 9.01. The prediction subcellular localization of apple LRR-RLK proteins was all distributed in the cell membrane. The gene family could be divided into 15 subgroups, containing 1-111 genes. The 378 genes in this family were distributed on all 17 chromosomes of the apple, and the chromosome 7 contained 40 genes. The LRR-RLKgene family had two conserved domains, namely the leucine-rich repeat structure and the protein kinase domain. Irregular curl and α-helix was the main secondary structure in the LRR-RLK gene family, and the rotation of β-turn was very small. It was found that the 12 selected family members were expressed in all tissues (except MD00G1105400), and most genes were expressed at relatively high levels in stem. Seven genes were up-regulated under low temperature conditions, and the expression of MD09G1153800 was the most obvious. The expression of MD09G1153800 was raised to 6.8 times of that under the control. While MD06G1170200 and MD05G1061600 were both down-regulated. Eight genes were up-regulated under drought conditions, and MD00G1105400 was the most obvious one. The expression of MD00G1105400 was raised to 9.6 times of that under the control; under salt conditions, MD04G1150400, MD13G1108000 and MD02G1071800 were always up-regulated. Among them, MD02G1071800 had the highest expression after 24 hours of salt stress treatment, which was 14.9 times of that under the control. After inoculatingthe expression of 12genes increased first and then decreased. After inoculating, the expression level of Wangshanhong was higher on the first day, however the expression level of Jiguan was higher on the third day. The expression of MD09G1153800 and MD05G1065800 were up-regulated significantly in Jiguan,in relativeto have no change in Wangshanhong, suggesting that these twocould serve as candidate genes for further functional characterization. 【】 A total of 378members were identified from apple whole genome sequences, which could be divided into 15 groups and distributed on 17 chromosomes, and the most ofgenes were responsive to stress stimulus and.

apple; LRR-RLK; gene family; identification; expression analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.015

2020-08-30；

2020-12-29

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（NYZS201905）、遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金（20180022）、遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2020DD165004）

黃金鳳，E-mail：huangfeng1002@163.com。通信作者劉志，Tel：0417-7033412；E-mail：lnliuzhi@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）