靶向沉默熱休克蛋白27對口腔鱗狀細胞癌CAL 27細胞侵襲和遷移的作用及其機制

曹 娟,李瑋柏,郭 秀,李 波,3,董春玲

（1.吉林大學口腔醫(yī)院實驗教學中心，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫(yī)院呼吸內科，吉林 長春130041；3.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院實驗教學中心 遼寧省口腔疾病重點實驗室，遼寧 沈陽110002）

口腔鱗狀細胞癌 （oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部惡性腫瘤中最常見的類型，在全球癌癥中排名第8位［1］。OSCC具有局部浸潤率高、轉移能力強和早期廣泛淋巴結轉移傾向等特點，其侵襲和轉移是OSCC死亡率居高不下的主要原因，5年生存率不超過50%［2-4］。OSCC的侵襲和轉移與上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）有 密 切 關 聯［5-6］，但其侵襲和轉移的具體機制尚未完全闡明。熱休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）屬于熱休克蛋白家族小分子家族成員之一，在頭頸部鱗癌［7］、舌 鱗 癌［8］、肺 癌［9］、乳 腺 癌［10］和 前 列 腺癌［11］等組織中異常表達，在增強腫瘤細胞抗凋亡、EMT的發(fā)生及放化療抗性［12-14］等方面發(fā)揮重要作用。ZHANG等［8］通過二維凝膠電泳和質譜分析蛋白質結果表明：無血清饑餓OSCC細胞24 h后，HSP27表達水平明顯升高，說明HSP27有助于OSCC抵抗不良刺激。目前HSP27在OSCC侵襲和轉移中的作用及對EMT的調控機制尚未見報道。本研究通過轉染HSP27小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制OSCC CAL 27細胞中HSP27的表達，觀察其對CAL 27細胞遷移和侵襲能力及EMT的影響，初步探討HSP27在OSCC侵襲和轉移中的作用以及對EMT的調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人OSCC CAL 27細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），由吉林大學口腔實驗教學中心進行傳代培養(yǎng)。DMEM-高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清和青鏈霉素雙抗（以色列BI公司），HSP27-siRNA和陰性對照siRNA（NC-siRNA）（上海吉瑪制藥技術有限公司），HSP27、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和β-actin引物（上海生工生物工程股份有限公司），總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司），RIPA細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗HSP27單克隆抗體、兔抗N-cadherin單克隆抗體和HRP-linked抗體（美國CST公司）。傷口愈合2孔插件和Transwell小室（美國Corning公司），RT-qPCR儀（美國安捷倫公司），Biotex多功能酶標儀（美國伯騰公司），垂直電泳裝置和轉膜儀（美國Bio-rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)CAL 27細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基置于5%CO2、溫度為37℃的濕潤孵箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染處于對數生長期的CAL 27細胞以每孔1×105個接種于6孔板中，待細胞長至60%左右，更換為無血清無雙抗培養(yǎng)基饑餓細胞30 min，每孔用250μL無血清無雙抗培養(yǎng)基分別稀釋5μL轉染試劑和10μL HSP27-siRNA或NC-siRNA，稀釋后室溫孵育5 min后，將二者混合均勻，室溫孵育20 min，最后將混合液按照前、后、左、右和中的順序加入孔板內，將孔板置于孵箱內轉染8 h后更換為含10%胎血清和1%雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。實驗分為2組：轉染NC-siRNA的CAL27細胞為對照組，轉染HSP27-siRNA的CAL27細胞為實驗組。HSP27-siRNA序列：sense 5'-CAAGUUUCCUCCUCCCUGUTT-3'，anti-sense 5'-ACAGGGAGGAGGAAACUUGTT-3'； NCsiRNA序列：sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，anti-sense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.4 RT-qPCR法檢測CAL 27細胞中HSP27和N-cadherin m RNA表達水平按照上述步驟對2組CAL 27細胞進行轉染后，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。利用總RNA提取試劑盒提取總RNA，并將樣品逆轉錄為cDNA，反應條件為37℃、15 min，85℃、5 s，4℃；最后按照TAKARRT-qPCR試劑盒說明進行PCR實驗，以β-actin為內參，反應條件：預變性95℃（30 s），以95℃（5 s）、60℃（20 s）進行40個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計算CAL 27細胞中HSP27和N-cadherin mRNA表達水平。引物序列如下：HSP27，上游引物5'-GCTGCTGCCGCCTAACCAC-3'，下游引物5'-TACCCGCATAGCCGCCTCTTC-3'；N-cadherin，上 游 引 物5'-AAGGTGGATGAAGACGGCATGGTG-3'，下游引物 5'-TGCTGACTCCTTCACTGACTCCTC-3'；β-actin，上游引物5'-CCTGGCACCCAGCACAT-3'，下 游 引 物5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。

1.5 Western blotting法檢測CAL 27細胞中HSP27和N-cadherin蛋白表達水平收集轉染48 h的CAL 27細胞，用含蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調整為同一濃度后100℃、5 min使蛋白變性，－20℃保存。加入蛋白樣品進行電泳后，轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入HSP27和N-cadherin一抗（1∶1 000）4℃冰箱過夜孵育；TBST清洗PVDF膜后加入二抗（1∶2 000）和β-actin抗體（1∶4 000）室 溫 孵育2 h，TBST洗膜后，加入ECL進行顯影，全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行曝光。以β-actin為內參，采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力傷口愈合插件置于6孔板中，胰酶消化轉染36 h的CAL 27細胞，用含5%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，計數，調整細胞密度為1×105mL－1，插件每孔加入100μL，24 h后取走插件，PBS洗去未貼壁細胞后，加入含1%胎牛血清和1%雙抗的DMEM后置于孵箱內培養(yǎng)，分別于0和24 h用倒置顯微鏡拍照觀察細胞遷移情況，應用Image J軟件統(tǒng)計0和24 h劃痕面積，計算細胞劃痕愈合率，代表細胞遷移能力。細胞劃痕愈合率=（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.7 Transwell小室實驗檢測CAL 27細胞中遷移和侵襲細胞數細胞遷移實驗：胰酶消化轉染36 h的CAL 27細胞，用含5%FBS和1%雙抗的DMEM重懸細胞，計數，密度為7.5×104mL－1，上室加入200μL細胞懸液，下室加入600μL含10%FBS的DMEM，置于孵箱內24 h后，吸走小室內液體，PBS緩沖液洗滌2次，多聚甲醛固定30 min，用棉簽擦掉未穿過小室的內層細胞，直至棉簽上無色，PBS緩沖液洗滌2次，結晶紫染色15 min，PBS緩沖液洗滌，于顯微鏡下觀察并計算2組小室外貼附的遷移細胞數。侵襲實驗：將Transwell小室放入24孔板內，然后將基質膠與無血清無雙抗DMEM按1∶9比例稀釋后，每孔50μL鋪于小室內，放入孵箱內直至凝固，其余步驟同遷移實驗，顯微鏡下觀察并計算2組小室外貼附的侵襲細胞數。

1.8 統(tǒng)計學分析采用Graph pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2組CAL 27細胞中HSP27和N-cadherin mRNA及蛋白表達水平，2組CAL 27細胞劃痕愈合率、遷移細胞數和侵襲細胞數，均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2組CAL 27細胞中HSP27 mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，實驗組CAL 27細胞中HSP27 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），證實siRNA明顯敲低HSP27的表達。因此，選用此siRNA進行后續(xù)的實驗。見表1和圖1。

表1 2組CAL27細胞中HSP27 mRNA和蛋白表達水平Tab.1Expression levels of HSP27 mRNA and protein in CAL 27 cells in two groups (n=3，±s）

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圖1 2組CAL 27細胞中HSP27蛋白表達電泳圖Fig.1Electrophoregram of expressions of HSP27 protein in CAL 27 cells in two groups

2.2 2組CAL 27細胞劃痕愈合率與對照組（33.880%±1.367%）比較，實驗組CAL27細胞劃痕愈合率（18.580%±2.982%）明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 作用不同時間后2組CAL 27細胞的遷移距離（Bar=200μm）Fig.2Migration distances of CAL 27 cells in two groups after treated for different time（Bar=200μm）

2.3 2組CAL 27細胞中遷移和侵襲細胞數Transwell小室實驗結果顯示：與對照組比較，實驗組CAL 27細胞中遷移和侵襲細胞數明顯減少（P＜0.01）。見圖3、圖4和表2。

圖3 Transwell小室實驗檢測24 h時2組CAL 27細胞遷移能力(結晶紫，Bar=200μm)Fig.3Migration abilities of CAL 27 cells in two groups at 24 h detected by Transwell chamber experiment(Crystal violet,Bar=200μm)

圖4 Transwell小室實驗檢測36 h時2組CAL 27細胞侵襲能力(結晶紫，Bar=200μm)Fig.4Invasion abilities of CAL 27 cells in two groups at 36 h detected by Transwell chamber experiment(Crystal violet,Bar=200μm)

表2 2組CAL 27細胞中遷移和侵襲細胞數Tab.2Number of migration and invasion CAL 27 cells in two groups (n=3，±s）

表2 2組CAL 27細胞中遷移和侵襲細胞數Tab.2Number of migration and invasion CAL 27 cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.01 vs control group.

Group Control Experiment Number of migration CAL 27 cells 2 017.00±39.37 427.70±167.20*Number of invasion CAL 27 cells 85.67±2.85 39.00±3.00*

2.4 2組CAL 27細胞中N-cadherin mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，實驗組CAL 27細胞中N-cadherin mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖5和表3。

圖5 2組CAL 27細胞中N-cadherin蛋白表達電泳圖Fig.5Electrophoregram of expressions of N-cadherin in CAL27 cells in two groups

表3 2組CAL 27細胞中N-cadherin mRNA和蛋白表達水平Tab.3Expression levels of N-cadherin mRNA and protein in CAL 27 cells in two groups (n=3，±s）

表3 2組CAL 27細胞中N-cadherin mRNA和蛋白表達水平Tab.3Expression levels of N-cadherin mRNA and protein in CAL 27 cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.05 vs control group.

Group Control Experiment N-cadherin mRNA 1.006±0.038 0.818±0.057*N-cadherin protein 0.680±0.047 0.460±0.040*

3 討 論

本研究選取人OSCC細胞系CAL 27，采用HSP27-siRNA進行干預，RT-qPCR、Western blotting法檢測HSP27和N-cadherin mRNA和蛋白表達水平，細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗檢測CAL27細胞的遷移及侵襲能力，結果表明：HSP27-siRNA可明顯下調CAL27細胞HSP27和N-cadherin mRNA和蛋白水平，并降低CAL 27細胞的遷移和侵襲能力。

HSP27在腫瘤轉移過程中發(fā)揮多種功能［15-18］，HSP27或磷酸化HSP27（p-HSP27）表達水平升高可調控細胞骨架重排，從而促進腫瘤細胞的遷移［19］。黑色素瘤體外實驗［20］表明：朊病毒蛋白通過促進HSP27磷酸化水平升高，導致F-肌動蛋白（F-actin）聚合減少，從而促進黑色素瘤細胞的遷移能力。體內實驗［21］也表明：沉默HSP27的表達抑制了結直腸癌（colorectal cancer，CRC）肺部轉移。本研究結果顯示：干擾HSP27在CAL 27細胞中的表達后CAL 27細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，進一步證實HSP27可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，在OSCC發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

EMT是包括OSCC在內的惡性腫瘤侵襲轉移的重要機制之一［22-24］，而HSP27通過不同機制調控腫瘤細胞發(fā)生EMT［25-27］。過表達的HSP27可降低膀胱癌組織中E-cadherin表達水平和升高Vimentin表達水平，進而促進膀胱癌細胞的侵襲，沉默膀胱癌腫瘤細胞內高遷移率族核小體結合結構域 5 （high-mobility group nucleosome-binding domain 5，HMGN5）減弱IL-6誘導的EMT過程可被異常表達的HSP27逆轉，重新啟動EMT［28］。SRIVATS等［29］和HUANG等［30］研究發(fā)現：Ca2+內流信號影響CRC的遷移和進展，基質相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM 1）為內質網的Ca2+傳感器，HSP27通過上調CRC腫瘤細胞內質網中STIM 1蛋白表達，并與STIM 1相互作用以維持其穩(wěn)定，一方面激活Ca2+內流信號通路以促進CRC細胞遷移，另一方面通過上調纖連蛋白（Fibronectin）、N-cadherin和波形蛋白（Vimentin）的表達及下調E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達促進EMT，共同調控了CRC的侵襲轉移。此外，HSP27在胰腺導管腺癌中通過激活腫瘤細胞β-連環(huán)蛋白（β-catenin）/基質金屬蛋白酶3（matrix metallopeptidase 3，MMP3）信號通路促進EMT［31］，而在前列腺癌中HSP27則通過調控β-catenin磷酸化和泛素化來促進表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）誘導的EMT［32］。本研究結果表明：下調HSP27 mRNA和蛋白表達水平能夠降低CAL 27細胞中N-cadherin mRNA和蛋白表達水平，進而抑制OSCC的EMT過程，提示HSP27可調控OSCC的EMT過程。雖然本研究證實HSP27促進CAL 27細胞的EMT，但HSP27調控OSCC發(fā)生EMT的分子機制并未闡明。因此，進一步探討HSP27調控OSCC腫瘤細胞EMT的具體機制是下一步的研究方向。

綜上所述，本研究結果證實靶向性siRNA沉默HSP27能有效抑制CAL27細胞的遷移和侵襲能力，HSP27可能通過EMT途徑促進CAL 27細胞的遷移和侵襲。本研究結果為OSCC的發(fā)病機制和治療提供了理論依據，對提高OSCC患者的生存率和改善其預后具有重要意義。