柯薩奇病毒A16型3C蛋白對(duì)人橫紋肌肉瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制

史穎穎,陳仕同,胡 波,沈 鐸,朱 曠,葉思瑋,馮金梅

（1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，湖北 武漢430056；2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430056；3.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，湖北 武漢430056）

柯薩奇病毒A 16型（Coxsackievirus A 16，CA 16）是嬰幼兒手足口病的主要病原體之一［1］。通常情況下CA 16感染引發(fā)的臨床癥狀較輕，但越來(lái)越多的研究［2-3］結(jié)果顯示：CA 16感染也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前針對(duì)CA 16感染尚無(wú)有效的藥物或疫苗，CA 16的致病機(jī)制仍未明確。CA 16屬于單股正鏈（+）RNA病毒，核酸由約7 410個(gè)核苷酸組成，CA 16的非結(jié)構(gòu)蛋白3C是一種蛋白酶，在病毒復(fù)制過(guò)程中其首先自身從病毒前體蛋白上被切割下來(lái)，3C蛋白酶可以進(jìn)一步催化病毒前體蛋白裂解形成成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白［1］。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，也是宿主限制病毒傳播的重要防御機(jī)制［4］。病毒作為一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，在感染早期病毒還未裝配成熟，過(guò)早的細(xì)胞凋亡會(huì)使釋放的病毒被機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)及時(shí)清除［5］。然而在病毒感染的晚期，凋亡的誘導(dǎo)有利于細(xì)胞釋放出子代病毒，進(jìn)而達(dá)到持續(xù)性感染的目的［5］。因此病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本課題組前期研究［6］證實(shí)：CA 16感染宿主細(xì)胞后可通過(guò)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是病毒3C蛋白參與細(xì)胞凋亡的研究尚未見報(bào)道。本研究利用3C蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，通過(guò)多種方法對(duì)3C蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行探究，以期進(jìn)一步明確病毒的致病機(jī)制，為抗病毒研究和疫苗開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存?？蛰d體質(zhì)粒p CMV-HA和3C蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-3C由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，構(gòu)建過(guò)程見參考文獻(xiàn)［7］。細(xì)胞活性檢測(cè)試劑和細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，β-actin一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）、裂解聚ADP核糖聚合酶［cleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase，cleaved-PARP］、聚ADP核糖聚合酶［Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］和裂解含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved

cysteinyl aspartate specific proteinase， cleavedcaspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。Bcl-2相關(guān)的細(xì)胞死亡激動(dòng)劑（Bcl-2 associated agonist of cell death，Bad）、Bcl-2同源拮抗劑/殺傷劑（Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak）和p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）抗體購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay生物技術(shù)公司，SC79（AKT激活劑）、BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，OPTI-MEM培基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，蛋白酶抑制劑Cocktail購(gòu)自瑞士Roche公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自日本TaKaRa公司，預(yù)染蛋白Marker/Ladder購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Western blotting試劑盒購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司。PVDF膜（美國(guó)Millipore公司），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美國(guó)BIO-RAD公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將RD細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞匯合度為90%～95%。將pCMVHA、p CMV-HA-3C和Lipofectamine2000分別加至OPTI-MEM培基中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。然后將DNA（0.2μg/孔為準(zhǔn)，其他轉(zhuǎn)染規(guī)格參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書成比例增加）懸液和Lipofectamine 2000懸液輕輕混合，室溫靜置20 min。將DNA和Lipofectamine 2000混合液加至6孔板的孔內(nèi)，前后左右晃動(dòng)孔板混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染18～48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RD細(xì)胞接種于96孔板，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，轉(zhuǎn)染p CMV-HA或p CMV-HA-3C質(zhì)粒。細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染0.4μg p CMV-HA）、0.1μg p CMVHA-3C組（轉(zhuǎn)染0.1μg p CMV-HA-3C和0.3μg pCMV-HA）、0.2μg p CMV-HA-3C組（轉(zhuǎn) 染0.2μg p CMV-HA-3C和0.2μg p CMV-HA）和0.4μg p CMV-HA-3C組（轉(zhuǎn)染0.4μg p CMV-HA-3C）。倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。繼續(xù)培養(yǎng)16～48 h，向每孔中加入MTT溶液（5 g·L－1）10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去各孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜（100μL/孔），置于搖床上慢速搖動(dòng)10 min（使甲瓚顆粒充分溶解）。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)570 nm處吸光度（A）值，通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率＝［實(shí)驗(yàn)組A（570）值－空白孔A（570）值］/［對(duì)照組A（570）值－空白孔A（570）值］×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RD細(xì)胞，轉(zhuǎn)染p CMV-HA或p CMV-HA-3C質(zhì)粒，細(xì)胞分組同“1.3”。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS緩沖液離心洗滌，收集1×105～1×106個(gè)細(xì)胞，用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后加入AnnexinⅤ-FITC（5μL）和PI（10μL），輕輕混勻后室溫避光孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式分析。細(xì)胞凋亡率=（早期細(xì)胞凋亡數(shù)+晚期細(xì)胞凋亡數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RD細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-HA或pCMV-HA-3C質(zhì)粒。細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染0.4μg pCMV-HA）和0.2μg pCMV-HA-3C組（轉(zhuǎn)染0.2μg pCMV-HA-3C和0.2μg pCMV-HA）。用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，經(jīng)過(guò)氯仿、異丙醇和75%乙醇分離純化RNA后，用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)NCBI Genebank各基因序列信息，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照SYBR Premix ExTaq說(shuō)明書進(jìn)行。各組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平以2－ΔΔCt法計(jì)算。

表1 PCR引物序列Tab.1Primer sequences of PCR

1.6 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Bak、Bad、PUMA、PARP、cleaved-PARP、cleaved-caspase-3、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平取對(duì)數(shù)期RD細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-HA或pCMV-HA-3C質(zhì)粒。設(shè)置對(duì)照組（轉(zhuǎn)染0.4μg p CMV-HA）和0.2μg p CMVHA-3C組（轉(zhuǎn)染0.2μg pCMV-HA-3C和0.2μg p CMV-HA），檢測(cè)各組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA蛋白表達(dá)水平；設(shè)置對(duì)照組（轉(zhuǎn)染0.4μg pCMVHA）、0.1μg p CMV-HA-3C組（轉(zhuǎn) 染0.1μg pCMV-HA-3C和0.3μg pCMV-HA）、0.2μg p CMV-HA-3C組（轉(zhuǎn)染0.2μg pCMV-HA-3C和0.2μg pCMV-HA）和0.4μg pCMV-HA-3C組（轉(zhuǎn)染0.4μg p CMV-HA-3C），檢測(cè)各組細(xì)胞中PARP、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平；AKT激活劑SC79處理實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置對(duì)照組（轉(zhuǎn)染0.4μg pCMV-HA）、0.2μg pCMV-HA-3C組（轉(zhuǎn) 染0.2μg p CMV-HA-3C和0.2μg pCMV-HA）和SC79處理組（先用4 mg·L－1SC79處理細(xì)胞4 h，然后轉(zhuǎn)染0.2μg p CMV-HA-3C和0.2μg pCMV-HA），檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved-PARP、cleaved-caspase-3、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平。

用RIPA裂解液（加入蛋白酶抑制劑）提取各樣品蛋白并進(jìn)行濃度測(cè)定（BCA蛋白定量試劑盒），每孔上樣20μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉2 h。加入濃度合適的一抗（Bak、Bad、PUMA、PARP、cleaved-PARP、cleaved-caspase-3、AKT、p-AKT和β-actin），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗（抗體稀釋比為1∶5 000～1∶10 000），繼續(xù)孵育2 h，TBST洗膜，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光法及凝膠成像儀進(jìn)行曝光，蛋白灰度值分析采用Image J軟件，目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率，各組細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞中Bak、Bad、PUMA mRNA表達(dá)水平及Bak、Bad、PUMA、PARP、cleaved-PARP、cleaved-caspase-3、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組RD細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞分布均勻，呈紡錘形。不同劑量pCMV-HA-3C組部分細(xì)胞出現(xiàn)圓縮和折光增強(qiáng)的現(xiàn)象，且隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量的增加，圓縮脫落的細(xì)胞數(shù)量也逐漸增加。見圖1。

圖1 各組RD細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(×100)Fig.1Morphology of RD cells in various groups(×100)

2.2 各組細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，不同劑量pCMV-HA-3C組細(xì)胞存活率均降低，0.4μg p CMV-HA-3C組細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性。見表2。

表2 各組RD細(xì)胞存活率Tab.2Survival rates of RD cells in various groups（n=3,±,η/%）

表2 各組RD細(xì)胞存活率Tab.2Survival rates of RD cells in various groups（n=3,±,η/%）

*P＜0.01 compared with control group.

Group Control p CMV-HA-3C 0.1μg 0.2μg 0.4μg Survival rate 90.00±5.98 85.83±5.71 82.68±6.02 65.09±3.78*

2.3 各組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組（1.10%±0.21%）比較，0.1、0.2和0.4μg p CMV-HA-3C組細(xì)胞凋亡率（3.80%±0.36%、15.77%±1.41%和19.67%±0.88%）均明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組RD細(xì)胞凋亡率Fig.2Apoptotic rates of RD cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，0.2μg p CMV-HA-3C組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3和表3。

圖3 各組RD細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3Electrophoregram of expressions of Bak，Bad and PUMA proteins in RD cells in various groups

2.5 各組細(xì)胞中PARP、cleaved-PARP和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，0.4μg pCMV-HA-3C組細(xì)胞中PARP蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），不同劑量p CMV-HA-3C組細(xì)胞中cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4和表4。

2.6 AKT激活劑SC79處理實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，0.2μg pCMV-HA-3組細(xì)胞中cleaved-PARP、cleavedcaspase 3和AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與0.2μg pCMV-HA-3C組比較，SC79處理組細(xì)胞中cleaved-PARP、cleaved-caspase-3和AKT蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖5和表5。

表3 各組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.3Expression levels of Bak,Bad and PUMA mRNA and proteins in RD cells in various groups（n=3，±s）

表3 各組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.3Expression levels of Bak,Bad and PUMA mRNA and proteins in RD cells in various groups（n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control 0.2μg p CMV-HA-3C Bak mRNA 1.02±0.14 1.54±0.11*Protein 0.69±0.01 0.78±0.01**Bad mRNA 1.02±0.12 1.72±0.05**Protein 0.77±0.01 0.83±0.01*PUMA mRNA 1.01±0.10 1.73±0.19*Protein 0.80±0.01 0.85±0.01*

圖4 各組RD細(xì)胞中PARP、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4Electrophoregram of expressions of PARP,cleaved-PARP and cleaved-caspase-3 proteins in RD cells in various groups

表4 各組細(xì)胞中PARP、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平Tab.4Expression levels of PARP，cleaved-PARPand cleaved-caspase-3 proteins in RD cells in various groups（n=3，±s）

表4 各組細(xì)胞中PARP、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平Tab.4Expression levels of PARP，cleaved-PARPand cleaved-caspase-3 proteins in RD cells in various groups（n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control p CMV-HA-3C 0.1μg 0.2μg 0.4μg PARP 0.88±0.01 0.86±0.01 0.82±0.07 0.70±0.02**Cleaved-PARP 0.71±0.01 0.75±0.01*0.77±0.01*0.99±0.03**Cleavedcaspase-3 0.55±0.01 0.60±0.01*0.68±0.01*0.88±0.03**

圖5 AKT激活劑SC79處理實(shí)驗(yàn)中各組RD細(xì)胞中AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5Electrophoregramof expressions of AKT signalingpathwayproteinsinRDcellsinAKT activator SC79 treatment experiment in various groups

3 討 論

CA 16是手足口病的主要病原體之一，目前針對(duì)該病毒感染引發(fā)的疾病尚無(wú)有效的治療方法，主要以對(duì)癥治療為主，進(jìn)一步了解CA 16的致病機(jī)制對(duì)與其相關(guān)疾病的預(yù)防和控制非常重要［1-2］。3C蛋白是CA 16功能最廣泛的蛋白之一，具有蛋白水解活性和RNA結(jié)合活性，使得該蛋白能夠在病毒復(fù)制和病原體-宿主相互作用的系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用，是理想的藥物靶點(diǎn)［8-9］。RUI等［10］發(fā)現(xiàn)：CA 16 3C蛋白與黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA 5）結(jié)合，抑制其與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）的相互作用，阻斷MDA 5觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生；同時(shí)3C蛋白可通過(guò)裂解轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子活化激酶1（transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1），抑制核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）反應(yīng)。另有研究［11-13］結(jié)果表明：病毒蛋白可以通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腸道病毒71型的3C蛋白一方面可以通過(guò)裂解端粒結(jié)合蛋白PinX1促進(jìn)細(xì)胞凋亡，另一方面可以通過(guò)切割異質(zhì)核糖核酸蛋白A 1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A 1，hnRNP A 1）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）編碼的輔助蛋白ORF3a可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。Saffold病毒的2B和3C蛋白被證實(shí)可以誘導(dǎo)人喉表皮樣癌細(xì)胞（HEp-2細(xì)胞）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）凋亡［13］。但是CA 16的病毒蛋白是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，3C蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-3C轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后，細(xì)胞活性明顯下降，圓縮脫落的細(xì)胞數(shù)量增多。

多種蛋白參與細(xì)胞凋亡發(fā)生，尤其是Bcl-2家族蛋白質(zhì)，該家族包含大量的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，兩類不同的蛋白質(zhì)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性作用來(lái)綜合調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［14］。Bad是Bcl-2家族中一種重要的促凋亡基因，Bak是該家族中另外一種位于線粒體外膜上的多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白［15］。PUMA屬于BH 3-only家族重要成員之一，具有強(qiáng)大的促凋亡能力［16］。PARP是凋亡通路中一種重要的死亡底物，可被活化的caspase-3進(jìn)一步切割［17］。caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的終末剪切酶之一，其主要的底物是PARP［18］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，pCMV-HA-3C組細(xì)胞中Bak、Bad和PUMA mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，同時(shí)活化的caspase-3進(jìn)一步切割PARP，使cleaved-PARP表達(dá)水平明顯升高，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。

表5 AKT激活劑SC79處理實(shí)驗(yàn)各組RD細(xì)胞中AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平Tab.5Expression levels of AKT signaling pathway proteins in RD cells in various groups in AKT activator SC79 treatment experimentn=3，±s）

表5 AKT激活劑SC79處理實(shí)驗(yàn)各組RD細(xì)胞中AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平Tab.5Expression levels of AKT signaling pathway proteins in RD cells in various groups in AKT activator SC79 treatment experimentn=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 compared with 0.2μg pCMV-HA-3C group.

Group Control 0.2μg p CMV-HA-3C SC79 treatment Cleaved-PARP 0.82±0.01 1.07±0.01*0.84±0.01ΔΔ Cleaved-caspase-3 0.81±0.01 1.16±0.02*0.97±0.04Δ AKT 1.02±0.02 1.10±0.01*0.94±0.01ΔΔ p-AKT 0.98±0.01 0.82±0.01**1.10±0.01ΔΔ

AKT可通過(guò)下游多種途徑對(duì)靶蛋白進(jìn)行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用［19］。磷酯酰肌醇3-激酶（phospoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路可通過(guò)抑制促凋亡因子和激活抗凋亡因子促進(jìn)細(xì)胞存活，mTOR是PI3K/AKT下游關(guān)鍵的激酶［20］。研究［21］顯示：黃連素和大黃素通過(guò)失活鹽誘導(dǎo)激酶3誘導(dǎo)的mTOR和AKT信號(hào)通路抑制乳腺癌生長(zhǎng)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。另有研究［22］證實(shí)：黃芩苷可通過(guò)mTOR/AKT通路減輕帕金森病大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示：3C蛋白轉(zhuǎn)染后RD細(xì)胞中p-AKT表達(dá)水平明顯降低，促細(xì)胞存活A(yù)KT信號(hào)通路被明顯抑制。為了進(jìn)一步探究3C蛋白是否通過(guò)AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，本課題組采用AKT信號(hào)通路的激活劑SC79對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果與預(yù)期的一致，SC79處理后可明顯降低3C蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示3C蛋白可能通過(guò)AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3C蛋白是否也通過(guò)其蛋白水解活性或調(diào)節(jié)固有免疫信號(hào)通路參與凋亡誘導(dǎo)尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，病毒蛋白3C可上調(diào)促凋亡蛋白Bak、Bad和PUMA的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示該蛋白可能在病原體-宿主相互作用中發(fā)揮重要作用，是潛在的藥物靶點(diǎn)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明病毒的致病機(jī)制和臨床的病毒治療提供理論依據(jù)。