濕熱處理下富含γ-氨基丁酸蕓豆品種的選擇及篩選方法的建立

王中磊 馬玉玲 王麗麗 劉麗婭 周素梅 佟立濤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種四碳非蛋白氨基酸，作為信號傳遞物質(zhì)廣泛的存在于動植物體中[1]。GABA在人體中不僅作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)存在，而且具有抗抑郁、降血壓、降血糖、改善睡眠等作用[2-4]。GABA支路和多胺降解途徑是植物中GABA合成的兩條途徑，前者通過GAD催化游離谷氨酸(glutamate，Glu)脫羧合成GABA，后者通過二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)分別催化二胺(putrescine，Put)，亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)后再經(jīng)脫氫生成GABA[5，6]。

隨著人體年齡增長，自身合成GABA的能力下降，且植物組織中GABA含量僅為0.03～2.00 μmol/g (DW)，無法通過正常的飲食滿足機(jī)體需求[7]。近年來，有研究利用糙米、大豆、鷹嘴豆、蠶豆等谷物通過發(fā)芽、發(fā)酵等方式進(jìn)行GABA富集[8-11]，但該途徑耗時長、成本高、破壞了籽粒完整性，不利于多種形式產(chǎn)品的開發(fā)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，濕熱處理可高效提升食用豆中GABA含量，且所需設(shè)備簡單、成本低廉、能較好保持籽粒的完整性。

蕓豆，學(xué)名菜豆(Phaseolusvulgaris)，營養(yǎng)豐富，具有提高免疫力、降血糖、抗氧化等多種功能作用[12]。我國蕓豆種植面積廣闊，資源豐厚，但加工精度較淺，利用程度較低，常以原糧形式流入市場。韓晶[13]分析了3個不同品種蕓豆的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)谷氨酸含量最高，約占蕓豆干質(zhì)量的2.81%～4.58%；梁珊等[14]也發(fā)現(xiàn)5個不同品種蕓豆中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的9.5%～11.39%。而谷氨酸是合成GABA的重要前體物質(zhì)，因此蕓豆具有較高的GABA富集潛力。目前，蕓豆GABA富集的研究相對較少，且主要利用發(fā)芽、發(fā)酵等方式[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)番茄[18]、蠶豆[9]等植物品種不同，GABA富集能力也有所不同，但關(guān)于蕓豆品種對GABA富集能力影響的研究鮮見報道。

本研究以蕓豆為供試材料，經(jīng)濕熱處理篩選出富含GABA的蕓豆品種。通過GABA、底物、酶之間的相關(guān)性分析及線性回歸揭示蕓豆GABA富集能力與品種間差異性的關(guān)系，從而建立高GABA富集能力蕓豆品種的篩選方法，為開發(fā)新型蕓豆健康食品、提高蕓豆附加值提供參考。

圖1 蕓豆圖片

1 材料與方法

1.1 材料

18種蕓豆信息如圖1、表1。Y1～Y15由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用豆體系提供，其余為市售，保存于4 ℃?zhèn)溆?。分別采用旋風(fēng)磨和冷凍研磨儀制備全粉，保存于-20 ℃。

表1 蕓豆品種名稱與特性

1.2 儀器與設(shè)備

GABA、腐胺、亞精胺、精胺為色譜純試劑；丹磺酰氯；4-氨基安替比林；N-N二甲基苯胺；辣根過氧化物酶；碳酸氫鈉、鹽酸為常規(guī)分析用試劑。

Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent 1260 VWD檢測器)，SP-Max 2300A光吸收型全波長酶標(biāo)儀；TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī)，Kieltec Analysister全自動凱式定氮儀，MM400冷凍混合型研磨儀。

1.3 方法

1.3.1 濕熱處理條件

參照GB 5009.3—2016測定蕓豆原籽粒含水量，定量著水調(diào)節(jié)蕓豆含水量為30%，密封后置于室溫下并混勻以保證均勻吸水。待蕓豆吸水完全后，將該密封容器置于60 ℃烘箱中熱處理5 h。處理結(jié)束后迅速置于液氮冷凍終止反應(yīng)，凍干磨粉后測定GABA含量。

1.3.2 指標(biāo)測定方法1.3.2.1 GABA含量的測定

采用HPLC測定GABA含量。按1∶10向樣品中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，室溫振蕩提取1 h后10 000 g冷凍離心10 min，取上清。重復(fù)操作3次，收集上清液并定容。避光條件下，反應(yīng)體系含上清液1 mL，0.04 g/mL NaHCO3溶液0.2 mL、2 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液0.4 mL，振蕩混勻后置于70 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，過0.22 mL濾膜供試。色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，等度洗脫，流動相組成及比例為A(30 mmol/L乙酸鈉)∶B(乙腈)=73∶27，流速1 mL/min，柱溫箱溫度30 ℃，檢測波長436 nm。GABA質(zhì)量濃度C(μg/mL)與峰面積A之間線性回歸方程為y=69.618x-36.977(R2=0.999 4)。

1.3.2.2 粗蛋白、可溶性蛋白含量的測定

粗蛋白含量測定參照GB/T 5009.5—2003；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.3.2.3 GAD活性測定

GAD提取與活性測定參考Bai等[19]并做修改。GAD粗酶提?。合蚶鋬鲅心サ氖|豆粉中按1∶5加入預(yù)冷磷酸鉀緩沖溶液(pH 5.8、0.1 mol/L，含2 mmol/L β-巰基乙醇，2 mmol/L EDTA、0.2 mmol/L PLP)，渦旋振蕩后置于冰水浴中提取1.5 h。10 000 g冷凍離心20 min，上清液即為GAD粗酶溶液。GAD酶測定：反應(yīng)體系含0.5 mL GAD粗酶液，0.2 mL底物溶液(含10 g/L Glu)?；旌弦褐糜?0 ℃水浴2 h，90 ℃熱水終止反應(yīng)。按方法1.3.2.1測定GABA含量。以每克蕓豆在40 ℃下每小時生成1 mg GABA(由添加的Glu生成)定義為1個酶活力單位。

1.3.2.4 生物胺含量測定

采用HPLC測定游離生物胺含量，測定方法參考Flores等[20]。Put、Spd、Spm質(zhì)量濃度C(μg/mL)與峰面積A之間線性回歸方程分別為y=77.483x-6.235 3(R2=0.998 7)、y=54.441x-10.662(R2=0.999 3)、y=41.144x-12.598(R2=0.999 2)。

1.3.2.5 DAO、PAO活性測定

DAO、PAO提取與測定方法分別參考穆文靜[21]、汪天等[22]，并修改。粗酶提?。喊?∶10向冷凍研磨蕓豆粉中添加預(yù)冷磷酸鈉緩沖液(70 mmol/L、pH 6.5)，混勻后冰水浴提取1.5 h，10 000 g冷凍離心20 min，上清液即為DAO、PAO粗酶混合液?；钚詼y定：反應(yīng)體系含酶粗提液200 μL、辣根過氧化物酶10 μL、顯色液(每100 mL磷酸鈉緩沖液中含有10 mg 4-氨基安替比林，25 μL N-N二甲基苯胺)20 μL。混合液置于30 ℃水浴鍋中5 min，加入10 μL 反應(yīng)啟動液(DAO活性測定啟動液為50 mmol/L put，PAO活性測定啟動液為20 mmol/L Spd、Spm混合液)，用酶標(biāo)儀立即于555 nm下測定吸光度，30 ℃水浴30 min后二次測定吸光度。以每克蕓豆每分鐘吸光值變化0.01計為1個酶活力單位(U)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%。實驗數(shù)據(jù)整理及顯著性分析(P<0.05為顯著性差異)分別采用Excel 2010、SPSS 25.0，作圖采用Origin 2018、R 3.6.3。

2 結(jié)果與討論

2.1 濕熱處理下富含GABA的蕓豆品種選擇

植物中GAD含有CaM結(jié)合區(qū)，Ca2+濃度影響GAD活性。植物受到外界熱刺激時，細(xì)胞液中Ca2+濃度升高，從而激活GAD活性，促進(jìn)植物組織中GABA的合成[23]。濕熱處理前后蕓豆中GABA含量見圖2，處理前蕓豆中GABA含量很低，在2.83～8.16 mg/100 g之間。經(jīng)過濕熱處理后，蕓豆中GABA含量均顯著上升，在68.64～131.55 mg/100 g之間，其中Y18、Y7、Y11 GABA含量均大于120 mg/100 g，可作為富含GABA的蕓豆品種。Kim等[24]發(fā)現(xiàn)米糠含水量30%時，于40 ℃下儲藏12 h后GABA含量最高，含水量與本實驗一致，可能是30%的含水量有利于激活GAD，促進(jìn)Glu向GABA的轉(zhuǎn)化。

Li等[11]對10個不同品種蠶豆發(fā)芽處理，發(fā)現(xiàn)蠶豆品種不同，發(fā)芽后GABA積累量最大相差25倍。由圖2知蕓豆品種不同，經(jīng)濕熱處理后GABA積累量差異顯著，其變異系數(shù)為19.1%。其中Y18 GABA積累量最高，為128.13 mg/100 g，是GABA積累量最低者Y5的2.01倍。說明蕓豆品種不同，其GABA富集能力存在差異性，這可能與參與GABA合成的底物、酶的不同有關(guān)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 濕熱處理前、后蕓豆中GABA含量

2.2 與GABA合成相關(guān)底物含量、酶活性

研究發(fā)現(xiàn)，糙米、大豆發(fā)芽時，GABA的積累量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)，可能是在蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)被分解成了游離氨基酸，進(jìn)而提高了GABA的含量[25，26]。由表2可知，蕓豆中蛋白質(zhì)含量豐富，粗蛋白含量在20.32～28.02 g/100 g之間，品種間差異不大，變異系數(shù)為7.8%。蕓豆中可溶性蛋白含量在29.48～55.42 mg/g之間，與王何柱等[27]的報道結(jié)果一致。

GAD是GABA支路的關(guān)鍵性限速酶[28]。蕓豆品種不同，GAD活性具有顯著差異性，變異系數(shù)達(dá)41.3%。其中Y10的GAD活性最高，是活性最低者Y4的4.86倍。

表2 GABA支路相關(guān)底物含量、酶活性測定結(jié)果

植物中通常含有尸胺(Cadaverine，Cad)、Put、Spd、Spm四種生物胺[29]。其中Put、Spd、Spm三類生物胺可在受試蕓豆中檢測到，在多胺代謝途徑中作為底物參與GABA的合成。由表3可知，蕓豆中生物胺含量很低，PAs含量最高為86.51 μg/g。18種蕓豆生物胺含量整體呈現(xiàn)以下趨勢：Put

表3 多胺降解途徑相關(guān)底物含量、酶活性測定結(jié)果

DAO是多胺降解途徑中的關(guān)鍵性限速酶。由表3可知，蕓豆品種不同，蕓豆中DAO、PAO活性差異很大，變異系數(shù)分別為99.5%、77.6%。其中Y10 DAO、PAO活性均為最高，分別為10.42、8.27 U，而Y6中未檢測到DAO活性。

2.3 主成分分析法篩選高GABA富集能力的蕓豆品種

作物育種時常采用主成分分析對相關(guān)特征性狀綜合評價，通過主成分得分和綜合得分篩選符合育種要求的優(yōu)質(zhì)品種。對蕓豆中與GABA合成相關(guān)的底物、酶及處理前蕓豆中GABA含量作主成分分析，預(yù)測蕓豆GABA富集能力。首先，通過KMO與Bartlett檢驗判斷數(shù)據(jù)是否滿足主成分分析的前提條件。結(jié)果顯示，KMO值為0.582>0.5，且Bartlett顯著性為0.000<0.05，說明各因子之間存在線性相關(guān)，適合做主成分分析[30]。根據(jù)主成分提取的一般原則及碎石圖(文中未列出)，發(fā)現(xiàn)成分?jǐn)?shù)目為4時，可解釋總變異的86.895%(表4)，此時幾乎對所有的特征指標(biāo)進(jìn)行了囊括。

表4 主成分方差解釋表

表5為主成分載荷值，結(jié)合主成分特征值，可得主成分系數(shù)，即主成分表達(dá)式。其中，各主成分表達(dá)式分別為：Z1=0.41×X1+0.37×X2+0.08×X3+0.19×X4-0.46×X5-0.44×X6+0.25×X7-0.03×X8+0.43×X9；Z2=0.25×X1+0.30×X2+0.41×X3+0.47×X4+0.24×X5+0.28×X6-0.25×X7-0.49×X8-0.12×X9；Z3=0.32×X1-0.26×X2+0.53×X3-0.08×X4+0.07×X5+0.10×X6+0.62×X7+0.22×X8-0.30×X9；Z4=0.07×X1+0.21×X2-0.27×X3+0.37×X4+0.39×X5+0.39×X6+0.23×X7+0.50×X8+0.36×X9。對原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理并帶入主成分表達(dá)式中，得各品種主成分得分。綜合得分表達(dá)式為：Z=(3.285×Z1+2.666×Z2+1.1×Z3+0.769×Z4)/(3.285+2.666+1.1+0.769)。經(jīng)計算，Y14、Y11、Y7三個品種的綜合表現(xiàn)最好，這與濕熱處理后蕓豆中GABA含量的測試結(jié)果基本一致，說明主成分分析法可作為預(yù)測蕓豆GABA富集能力的參考方法。

表5 主成分載荷值表

2.4 GABA合成相關(guān)底物、酶與濕熱處理下蕓豆GABA積累量之間的相關(guān)性分析

由圖3a、圖3b及圖4可知，蕓豆中粗蛋白含量、可溶性蛋白質(zhì)含量與GABA積累量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.31、0.36，但均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。由圖3c與圖4可知，濕熱處理后蕓豆中GABA積累量隨蕓豆GAD活性的增大而增加，蕓豆GAD活性與GABA積累量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.8。由此表明，濕熱處理下GABA支路相關(guān)底物與酶對蕓豆中GABA的合成具有促進(jìn)作用。

由圖3d～圖3i及圖4可知蕓豆?jié)駸崽幚硐翯ABA積累量與Put含量、PAs含量、PAO活性、DAO活性均無相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)小于0.3，但與Spm含量、Spd含量分別呈現(xiàn)正相關(guān)、負(fù)相關(guān)，且與Spd含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)-0.47。這表明，濕熱處理下多胺降解途徑相關(guān)底物與酶未促進(jìn)蕓豆中GABA的合成。

植物GABA富集過程中，GABA支路作為主要貢獻(xiàn)途徑參與GABA合成與代謝[31，32]。通過分析可知，GABA支路是蕓豆?jié)駸崽幚硐潞铣蒅ABA的最主要途徑，且GAD作為GABA支路的關(guān)鍵性限速酶對于GABA的合成起著至關(guān)重要的作用。因此，可將蕓豆GAD活性作為濕熱處理下高GABA富集能力蕓豆品種的篩選指標(biāo)。然而，濕熱處理下蕓豆GABA富集的機(jī)制尚未完全明確，需要對濕熱處理前、后及過程中參與反應(yīng)的各組分的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，這可作為未來研究的重點(diǎn)。

圖3 GABA合成相關(guān)底物、酶與GABA積累量的散點(diǎn)圖

注：圖中紅色圓圈表示相關(guān)系數(shù)為正，藍(lán)色圓圈表示相關(guān)系數(shù)為負(fù)，圈中數(shù)字為相關(guān)系數(shù)。GABA-1為濕熱處理前GABA含量；GABA-2為濕熱處理后GABA含量；GABA為濕熱處理下GABA積累量；Soluble Pro為可溶性蛋白質(zhì)含量；Pro為粗蛋白含量。圖4 GABA合成相關(guān)底物、酶與濕熱處理下GABA積累量的相關(guān)性分析熱圖

2.5 濕熱處理后蕓豆中GABA含量的線性回歸模型

線性回歸是確定2種或2種以上變量之間依賴關(guān)系的數(shù)理統(tǒng)計方法。將濕熱處理后蕓豆GABA含量作為因變量(Y)，與GABA合成相關(guān)的底物與酶作為自變量(X)，對其擬合線性回歸模型。首先進(jìn)行D-W檢驗和方差分析，結(jié)果顯示D-W值為2.046，P=0.014<0.05，說明數(shù)據(jù)間相互獨(dú)立、符合線性回歸獨(dú)立性的條件，由此構(gòu)建的回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義[30]。

多元線性回歸方程為Y=1.18×X1-4.638×X2+0.829×X3+18.789×X4+3.684×X5-5.448×X6-3.1×X7-5.325×X8-3.751×X9+4.359×X10+135.403(式中X1～X9分別為處理前蕓豆中GABA含量、粗蛋白含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、GAD活性、DAO活性、PAO活性、Put含量、Spd含量、Spm含量、PAs總量)。模型構(gòu)建時，X4的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)值最大且P<0.05，說明GAD活性對濕熱處理后蕓豆中GABA含量影響最大，這與相關(guān)性分析所得結(jié)果一致。該模型R2=0.74<0.8，未能達(dá)到預(yù)測型模型要求，但可作為解釋型模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋[30]。同時，說明可能存在其他因變量未被納入分析，如游離氨基酸的含量、谷氨酸的含量等。

培育優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源是獲得高效目標(biāo)產(chǎn)物的重要手段。目前，已通過重組菌株、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方式使GAD過量表達(dá)，從而提高發(fā)酵液或植物中GABA的含量[33，34]。研究發(fā)現(xiàn)，蕓豆中GAD活性是影響濕熱處理下GABA積累量的重要因素，該結(jié)論可提供新的育種思路，即定向改變蕓豆中有關(guān)GAD表達(dá)的基因，提高蕓豆中GAD表達(dá)能力，培育出高GABA富集能力的蕓豆品種。

3 結(jié)論

通過熱刺激的方式，濕熱處理可在短時間內(nèi)促進(jìn)GABA的大量合成，提升了蕓豆的營養(yǎng)品質(zhì)，為開發(fā)富含GABA的食品提供了良好的原料來源。濕熱處理下，蕓豆中GABA積累量與原籽粒中GABA支路相關(guān)底物含量與酶活呈正相關(guān)，而與多胺降解途徑相關(guān)底物含量與酶活無關(guān)或呈負(fù)相關(guān)，說明GABA支路作為主要代謝途徑參與了GABA的積累。其中GAD活性與GABA積累量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，通過線性回歸模型的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)GAD是合成GABA的關(guān)鍵性限速酶，因此可通過測定蕓豆中GAD活性篩選高GABA富集能力的蕓豆品種。