提高黑米花色苷顏色穩(wěn)定性輔色劑的篩選及其作用機制

趙 磊，潘 飛，周 娜，張雅莉，郝 帥，王成濤,

（1.北京工商大學(xué)，食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.譜尼測試集團(tuán)股份有限公司，北京 100095）

黑米花色苷，一類由花青素與糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的天然多酚類色素，存在于黑米種皮[1]，具有多種生理功效，如改善腸炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、改善視力[5]等。然而，花色苷穩(wěn)定性較差，易受光、熱、氧氣等環(huán)境因素影響而發(fā)生降解和褪色[6-7]，這使開展提高天然色素顏色穩(wěn)定性的研究成為當(dāng)前熱點。近年有關(guān)提高花色苷穩(wěn)定性的研究可分為3 類：1）采用化學(xué)修飾提高花色苷對環(huán)境的耐受性，如酰基化、甲基化、糖基化等[8-9]；2）添加小分子酚類化合物作為輔色劑提高花色苷的顏色穩(wěn)定性，如咖啡酸、單寧、香豆酸等[10]；3）采用蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等生物大分子對花色苷進(jìn)行微膠囊化，如海藻酸鈉、乳清蛋白、殼聚糖[11-13]。然而，采用生物大分子進(jìn)行微膠囊化，雖能夠有效提高花色苷的穩(wěn)定性，卻在一定程度上降低了花色苷在溶液中原有的色彩和明度，而化學(xué)修飾則會引起消費者對健康的擔(dān)憂。相比之下，作為輔色劑的小分子酚類化合物不僅能夠?qū)ㄉ站哂休o色作用，而且常在食品中作為的天然抗氧化劑，對人們健康具有多種益處[14-15]。因此，通過添加酚類輔色劑提高黑米花色苷的顏色穩(wěn)定性具有十分重要意義。

研究表明，小分子酚類化合物可以通過非共價相互作用與花色苷形成復(fù)合物，保護(hù)花色苷不受水的親核攻擊，從而減少無色的半縮酮和查爾酮的形成，以此增強花色苷的顏色穩(wěn)定性[16-18]。Zhang Lingli等[19]在加速條件下研究沒食子酸對藍(lán)莓汁中花色苷穩(wěn)定性和色澤的影響，結(jié)果表明沒食子酸的加入可提高藍(lán)莓花色苷的顏色飽和度和穩(wěn)定性，當(dāng)藍(lán)莓花色苷與沒食子酸的物質(zhì)的量比為1∶5時，輔色效果最佳。Babaloo等[10]考察不同pH值及4 種有機酸（單寧、咖啡酸、苯甲酸、香豆酸）對山茱萸花花色苷顏色的影響，結(jié)果表明在pH 2時，所選有機酸中對山茱萸花花色苷的輔色效果最為明顯，其中，咖啡酸對山茱萸花花色苷穩(wěn)定性的保護(hù)作用最佳。此外，Klisurova等[20]探究了10 種酚類化合物對黑山楂花色苷的輔色作用，其中迷迭香酸、丁香酸、兒茶素和表兒茶素具有較好的輔色效果。然而，現(xiàn)有研究有關(guān)輔色劑對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性影響的研究較少。此外，這種穩(wěn)定性的保護(hù)作用機制也值得進(jìn)一步探究，相關(guān)研究成果有助于黑米花色苷的開發(fā)及利用。

本研究選用7 種酚類化合物和有機酸，評價其在pH 3.0和pH 5.0條件下對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性的影響，以輔色效果和熱穩(wěn)定性為指標(biāo)篩選輔色劑，并在pH 3.0時探究最佳輔色劑的添加質(zhì)量濃度。隨后，采用紅外光譜、分子對接及分子動力學(xué)模擬進(jìn)一步研究這種穩(wěn)定性的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米 市購；XAD-7吸附樹脂 北京康林科技有限責(zé)任公司；表兒茶素、咖啡酸、迷迭香酸、綠原酸、草酸、蘋果酸、丁香酸 成都曼斯特生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850臺式離心機 北京天林恒泰科技有限公司；HHSY21-Ni4恒溫水浴鍋 北京市精科華瑞儀器有限公司；真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；JYL-C051粉碎機九陽股份有限公司；超聲波清洗儀 北京中晟銘科技有限公司；RV10控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；NK200-1B可視孔氮吹儀 杭州米歐儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；Avater 370紅外光譜儀 美國尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米花色苷分離純化

參考Zhao Lei等[2]的方法進(jìn)行略作修改，將黑米粉碎，取粉碎后的黑米30.0 g，加入85%酸性乙醇（HCl，pH 2.0），料液比為1∶10，避光超聲提取2 次，超聲時間30 min，過濾去除不溶性雜質(zhì)，合并2 次提取液，旋蒸去除乙醇，用乙酸乙酯萃取除去黃酮。裝填XAD-7樹脂柱，上樣，待吸附完全后，用6 倍柱體積酸性純水（HCl，pH 3.0）洗去蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)，流速為1 mL/min；用1 倍柱體積酸性乙醇（HCl，pH 3.0）將花色苷洗脫下來，于40 ℃旋蒸濃縮至3 mL左右，氮吹至干，得到黑米花色苷粉末，置于離心管中－20 ℃條件下保存，待用。經(jīng)測定，其花色苷主要組成為矢車菊-3,5-O-二葡萄糖苷（（6.4±0.1）mg/g）、矢車菊-3-O-葡萄糖（（406.7±2.2）mg/g）和芍藥素-3-O-葡萄糖苷（（49.4±0.4）mg/g）。

1.3.2 花色苷總含量測定

采用pH示差法[21]測定黑米花色苷的總含量，取一定量的待測樣，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液將樣品稀釋數(shù)倍，平衡10 min后，以純水為空白，分別測定樣液在波長515 nm和700 nm處吸光度，按下式計算花色苷總含量：

式中：M為花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；mw為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol）；DF為稀釋倍數(shù)；L為光程長（1 cm）；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)（26 900 L/（mol·cm））。

1.3.3 花色苷-輔色劑混合溶液的配制

使用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 3.0和pH 5.0）分別配制0.1 mg/mL的黑米花色苷溶液和4.0 mg/mL的輔色劑溶液（表兒茶素、咖啡酸、迷迭香酸、綠原酸、草酸、蘋果酸、丁香酸），取等體積黑米花色苷溶液和輔色劑溶液混合均勻后，在室溫條件下避光放置1 h，以添加等體積檸檬酸緩沖液的黑米花色苷溶液做為對照組。

1.3.4 輔色劑的篩選及輔色劑質(zhì)量濃度的確定

采用輔色效果結(jié)合熱穩(wěn)定性共同評價輔色劑對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性的影響，以篩選最佳輔色劑進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.4.1 輔色劑種類對黑米花色苷輔色效果的影響

采用紫外分光光度計在波長400～700 nm范圍測定上述樣品在最大吸收波長處的吸光度，并計算出各個輔色劑的增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)的值。增色效應(yīng)即花色苷溶液紫外最大吸收波長下的吸光度變化百分比（ΔAλmax），紅移效應(yīng)即花色苷溶液紫外最大吸收波長增加量（Δλmax）。當(dāng)花色苷溶液發(fā)生紅移現(xiàn)象時，其紫外最大吸收波長變大，花色苷溶液紅色加深；與之相對的，當(dāng)發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象時，其紫外最大吸收波長減小，花色苷溶液紅色變淺或有變藍(lán)的趨勢。增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)的值越大，說明輔色劑對黑米花色苷的輔色性越好。

1.3.4.2 輔色劑種類對黑米花色苷熱穩(wěn)定性的影響

將1.3.3節(jié)配制的花色苷-輔色劑溶液避光置于90 ℃水浴中，于0、5、10、20、40、80、120 min和160 min分別測定其最大吸收波長處的吸光度，從而監(jiān)測各組樣品在90 ℃水浴時的吸光度變化，即其熱穩(wěn)定性。

1.3.4.3 輔色劑質(zhì)量濃度的確定

在上述研究的基礎(chǔ)上，選擇輔色效果最好的輔色劑，分別配制pH 3.0質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的輔色劑溶液，取等體積輔色劑溶液與質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的黑米花色苷溶液（pH 3.0）混和，必要時調(diào)節(jié)pH值至3.0。隨后采用1.3.4.1節(jié)方法確定輔色劑的最佳濃度。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

分別配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的黑米花色苷溶液和4.0 mg/mL迷迭香酸溶液，取相同體積并混合均勻。使用真空冷凍干燥機干燥成粉末，分別稱取約10 mg黑米花色苷、迷迭香酸及黑米花色苷+迷迭香酸復(fù)合物，以KBr壓片，波段范圍為400～1 000 cm－1，分辨率為8 cm－1，掃描次數(shù)為32 次，用傅里葉紅外光譜儀測定。

1.3.6 計算機模擬

參考Li Caixia等[22]的研究方法并進(jìn)行略微修改，采用分子對接獲得最佳結(jié)合構(gòu)象，并進(jìn)行分子動力學(xué)模擬分析最佳輔色劑與花色苷之間的相互作用。矢車菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的3D結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫下載（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），編號分別為197081和5281792。矢車菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由GlycoBioChem PRODRG2 Server（http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg）創(chuàng)建[23]，其幾何結(jié)構(gòu)和電荷性質(zhì)根據(jù)Lemkul等[24]提出的方法進(jìn)行修正。

1.3.6.1 分子對接

采用AutoDock Tools 1.5.6軟件（http://autodock.scripps.edu）處理矢車菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸，合并非極性氫原子，并保存為pdbqt格式。矢車菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的結(jié)合采用AutoDock Vina軟件進(jìn)行盲對接獲得最佳結(jié)合構(gòu)象[25]。相比較AutoDock 4，Vina具有高精度，速度快且可提高結(jié)合模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，所對接計算的網(wǎng)格大小為16 ?×12 ?×16 ?，網(wǎng)格空間為1 ?，Exhaustiveness設(shè)置為200 次，產(chǎn)生20 個結(jié)合構(gòu)象，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。最后，以結(jié)合能和最佳均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）選擇矢車菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的最佳對接構(gòu)象。

1.3.6.2 分子動力學(xué)模擬

分子對接得到最佳結(jié)合幾何構(gòu)象作為分子動力學(xué)模擬的初始幾何，對有無添加輔色劑的花色苷體系進(jìn)行10 ns動力學(xué)模擬。模擬體系在矩形的盒子進(jìn)行，加入外顯溶劑（spc水模型），所有原子之間保持10 ?的距離，并加入超過800 個水分子，添加反離子用于中和體系電荷，以保證體系中正確的滲透壓和電中性。采用最陡下降法優(yōu)化分子體系的幾何結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化（最大設(shè)置為1 000.0 kJ/（mol/nm））。能量最小化后，體系經(jīng)過正則系綜（0.2 ns）和等溫等壓系綜（1 ns）兩步驟達(dá)到平衡。本研究中分子動力學(xué)模擬均使用GROMACS（Version.2019.5）軟件包進(jìn)行（http://www.gromacs.org），力場采用GROMOS96 43a1[26]，所有含氫原子的鍵使用默認(rèn)線性（LINCS）算法進(jìn)行約束[27]。恒溫（300 K）使用V-rescale方法，恒壓（1 bar）使用Parrinello-Rahman方法，并分別進(jìn)行0.1 ns和2 ns。采用粒子網(wǎng)格方法處理遠(yuǎn)距離靜電力，以14 ?截斷量計算范德華力，時間步長1 fs，每0.1 ps收集一次快照。模擬結(jié)束后，使用GROMACS（Version.2019.5）軟件包分析軌跡。所有圖片經(jīng)過PyMOL軟件處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 輔色劑種類對黑米花色苷輔色效果的影響

選用7 種酚類化合物和有機酸作為輔色劑，并研究其種類對黑米花色苷輔色效果的影響，結(jié)果如表1所示。7 種輔色劑均能提高黑米花色苷的增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)，在pH 3.0時，添加迷迭香酸的花色苷溶液增色和紅移效應(yīng)最好（P＜0.05），分別增加29.16%和9 nm，而添加草酸的花色苷溶液增色效應(yīng)增加16.00%，但其出現(xiàn)藍(lán)移。此外，表兒茶酸和咖啡酸的增色效果較差。在pH 5.0時，7 種輔色劑對黑米花色苷的增色效果從大到小依次為迷迭香酸（23.78%）、綠原酸（21.66%）、草酸（17.05%）、表兒茶素（16.29%）、咖啡酸（12.84%）、丁香酸（11.31%）和蘋果酸（7.37%）。在類似的研究中，添加綠原酸、迷迭香酸也被證實可提高花色苷的顏色穩(wěn)定性[20,30]，在本研究中迷迭香酸對黑米花色苷的輔色效果顯著優(yōu)于綠原酸（P＜0.05）。此外，溶液pH值不同導(dǎo)致輔色劑對黑米花色苷的增色和紅移效應(yīng)出現(xiàn)差異，這可能是因為在pH 5.0時，花色苷分子內(nèi)電荷容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并水解黃烊陽離子C環(huán)雙鍵，導(dǎo)致黑米花色苷穩(wěn)定性降低[28]。

表1 輔色劑對黑米花色苷的增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)Table 1 Hyperchromic effect (ΔAλmax) and bathochromic shift effect(Δλmax) of co-pigments on black rice anthocyanins

2.2 輔色劑種類對黑米花色苷熱穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，在pH 3.0時，隨著加熱時間的延長，所有組溶液的吸光度均出現(xiàn)降低，這表明色素配合物變得不穩(wěn)定，溶劑化對黃烊陽離子的影響占主導(dǎo)作用，從而使花色苷發(fā)生水化導(dǎo)致無色甲醇假堿和查爾酮的形成[29]。添加表兒茶素、咖啡酸、迷迭香酸、綠原酸、草酸、蘋果酸和丁香酸的吸光度在加熱160 min后與初始時相比分別降低了29.5%、30.2%、29.3%、32.4%、30.2%、34.2%和26.5%，不添加輔色劑的對照組吸光度在加熱160 min后降低35.6% （圖1A），這表明所選7 種酚類化合物均可提高黑米花色苷的熱穩(wěn)定性，其中綠原酸對黑米花色苷的影響與Gras等[30]的研究一致。與pH 3.0相比，pH 5.0體系中所有組的吸光度初始值均出現(xiàn)下降，這是因為在pH 3.0條件下，花色苷的結(jié)構(gòu)呈黃烊陽離子有利于花色苷顏色穩(wěn)定，當(dāng)pH值升高至5.0時，其結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)化為無色的查爾酮導(dǎo)致吸光度降低[28]。與對照組（pH 5.0）相比，添加表兒茶素、咖啡酸、迷迭香酸、綠原酸、草酸和丁香酸的吸光度在加熱80 min后與初始時相比分別降低了13.6%、22.7%、13.2%、17.0%、26.0%和19.1%，而添加蘋果酸的吸光度與空白組無明顯差異（圖1B）。這些結(jié)果表明添加表兒茶素、迷迭香酸、綠原酸和丁香酸均能有效提高黑米花色苷的熱穩(wěn)定性，其中添加表兒茶素和迷迭香酸后花色苷的熱穩(wěn)定性最好。因此，根據(jù)輔色效果和熱穩(wěn)定性選擇迷迭香酸和pH 3.0用于后續(xù)實驗探究。

圖1 輔色劑種類對黑米花色苷在90 ℃熱穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of co-pigments on thermostability of black rice anthocyanins in water bath at 90 ℃

2.3 迷迭香酸質(zhì)量濃度對黑米花色苷輔色效果的影響

選用迷迭香酸進(jìn)一步探究其質(zhì)量濃度對黑米花色苷輔色效果的影響，以確定迷迭香酸的最佳質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。當(dāng)迷迭香酸質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL升高至4.0 mg/mL時，黑米花色苷溶液的增色效應(yīng)從1.50%增加至47.38%，紅移效應(yīng)則從0 nm增加至12 nm。這表明輔色效果與迷迭香酸的質(zhì)量濃度有關(guān)，隨著迷迭香酸質(zhì)量濃度的增加，輔色效應(yīng)逐漸增強。一些研究表明多酚分子間發(fā)生締合所形成的重疊排列，有利于輔色效果的提高[31]。在類似的研究中，沒食子酸、單寧酸、香豆酸、咖啡酸均被觀察到其濃度增加導(dǎo)致花色苷輔色效果增強[10,19]。

表2 迷迭香酸對黑米花色苷的增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)Table 2 Hyperchromic effect (ΔAλmax) and bathochromic shift effect(Δλmax) of rosmarinic acid on black rice anthocyanins

2.4 迷迭香酸質(zhì)量濃度對黑米花色苷熱穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，在90 ℃水浴加熱，所有組的吸光度均隨加熱時間的延長下降，其中，添加迷迭香酸組（質(zhì)量濃度由高到低）在加熱160 min后與初始時相比分別降低33.5%、24.9%、20.2%、20.1%、24.5%、28.7%，而對照組的吸光度降低25.9%。然而，高質(zhì)量濃度迷迭香酸對黑米花色苷雖具有較好的輔色效果，但在加熱160 min后其吸光度下降速度高于其他組，且與添加質(zhì)量濃度為2 mg/mL迷迭香酸組的吸光度相當(dāng)，這表明其對黑米花色苷的熱穩(wěn)定性低于2 mg/mL迷迭香酸組。因此，結(jié)合輔色效果來看，迷迭香酸添加質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，其對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性最好。

圖2 迷迭香酸對黑米花色苷在90 ℃時熱穩(wěn)定性的影響（pH 3.0）Fig.2 Effect of rosmarinic acid on thermal stability of black rice anthocyanins in water bath at 90 ℃ (pH 3.0)

2.5 傅里葉紅外光譜分析

采用紅外光譜檢測，并根據(jù)振動譜帶的強度、寬度和峰的位置分析兩者分子間相互作用，進(jìn)一步研究迷迭香酸對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性的保護(hù)作用，結(jié)果如圖3所示。在圖3A中，3 353 cm－1和2 925 cm－1左右的譜帶分別表示O—H伸縮振動和C—H伸縮振動，在1 690 cm－1處與C＝O拉伸振動有關(guān)，而1 626 cm－1處的譜帶屬于芳烴骨架的C＝C伸縮振動。在1 170 cm－1處的強譜帶表示吡喃環(huán)OH取代基的C—O伸縮振動，1 107 cm－1和1 059 cm－1處的弱譜帶則歸因于芳香環(huán)的C—O—C伸縮振動，這些均屬于黃酮類化合物的典型特征[32]。在圖3B中，在3 230（O—H拉伸）、1 722（C＝O拉伸）、1 626 cm－1和1 549 cm－1（C＝C拉伸）處，迷迭香酸的紅外光譜顯示出特征性的條帶，在1 187、1 142 cm－1和1 003 cm－1處的譜帶均歸因于酚類基團(tuán)的C—O伸縮振動[33]。與黑米花色苷和迷迭香酸的紅外光譜圖相比，黑米花色苷+迷迭香酸復(fù)合物的紅外光譜有所不同，其O—H基團(tuán)拉伸振動峰從3 353 cm－1和3 230 cm－1移動到3 294 cm－1，這表明黑米花色苷和迷迭香酸之間形成了分子間氫鍵（圖3C）。此外，與迷迭香酸的紅外光譜圖相比，黑米花色苷+迷迭香酸復(fù)合物的紅外光譜圖位于1 187～1 004 cm－1處的譜帶整體向高波長方向移動。相對于黑米花色苷的紅外光譜圖而言，其位于1 551～1 375 cm－1范圍內(nèi)的譜帶強度出現(xiàn)降低，表明多酚類物質(zhì)（黑米花色苷和迷迭香酸）之間可能存在π-π堆積或其他相互作用[5]?？傊?，傅里葉紅外光譜表明，氫鍵是黑米花色苷和迷迭香酸結(jié)合的主要驅(qū)動力之一。

圖3 黑米花色苷（A）、迷迭香酸（B）和黑米花色苷與迷迭香酸復(fù)合物（C）的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of black rice anthocyanins (A), rosmarinic acid (B) and their mixture (C)

2.6 分子對接分析

采用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接可以探索2 個分子最佳穩(wěn)定構(gòu)型及結(jié)合能，所得結(jié)合體的構(gòu)象自動聚類分析并打分，可有效排除人為因素的干擾[21]。矢車菊-3-O-葡萄糖苷與迷迭香酸對接結(jié)果如表3所示，根據(jù)結(jié)合能最低和RMSD值優(yōu)選模型1作為分子動力學(xué)模擬的啟動配制。

表3 矢車菊-3-O-葡萄糖苷與迷迭香酸分子對接結(jié)果Table 3Results of molecular docking between cyanidin-3-O-glucoside and rosmarinic acid

2.7 分子動力學(xué)模擬分析

采用分子動力學(xué)可模擬真實體系下分子間的結(jié)合及相互作用，并進(jìn)行可視化分析，使實驗數(shù)據(jù)得到較好補充和驗證[26,34-35]。為了準(zhǔn)確分析矢車菊-3-O-葡萄糖與迷迭香酸的相互作用，本研究進(jìn)行了10 ns分子動力學(xué)模擬，結(jié)果如圖4所示。矢車菊-3-O-葡萄糖與迷迭香酸之間形成2 條強氫鍵，其鍵長分別為1.6 ?和1.9 ?，主要發(fā)生在矢車菊-3-O-葡萄糖中葡萄糖苷上羥基的H和迷迭香酸中B環(huán)酚羥基的O原子之間，氫鍵作為是分子間最重要的相互作用之一，其穩(wěn)定了矢車菊-3-O-葡萄糖與迷迭香酸結(jié)合構(gòu)象（圖4A），進(jìn)而提高二元復(fù)合物的穩(wěn)定性，這與先前研究的結(jié)果一致[26,34]。此外，矢車菊-3-O-葡萄糖中A和C環(huán)與迷迭香酸中苯環(huán)可形成多個π-π堆積，這對維持多酚類之間的穩(wěn)定性尤為重要。許多研究表明，在花色苷-輔色劑之間可通過分子間相互作用影響溶液的顏色。其中，氫鍵和非共價作用力被認(rèn)為是分子間輔色形成的主要因素，能夠穩(wěn)定花色苷陽離子發(fā)色團(tuán)并阻止它與水分子的相互作用，從而保持溶液顏色不發(fā)生損失[36-38]。當(dāng)花色苷與酚酸處于層狀堆積結(jié)構(gòu)時，酚酸可向花色苷提供豐富的p電子，從而產(chǎn)生增色效應(yīng)[39-40]。Fan Linlin等[35]發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)可通過氫鍵和非共價相互作用對黑莓酒渣花色苷產(chǎn)生增色效應(yīng)，并提高其穩(wěn)定性，這與本實驗結(jié)果一致。此外，迷迭香酸的多苯環(huán)結(jié)構(gòu)會引發(fā)聚偶疊作用，可能是其在所選7 種輔色劑中具有最大增色和紅移效應(yīng)（表1）的原因[41-42]。

圖4 矢車菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸二元絡(luò)合物體系及矢車菊-3-O-葡萄糖體系的分子動力學(xué)模擬Fig.4 Molecular dynamic simulation obtained for cyanidin-3-O-glucoside-rosmarinic acid binary composite system

從體系穩(wěn)定性看，RMSD值可以反映系統(tǒng)中任意時刻構(gòu)象與初始構(gòu)象的相對變化。從圖4B可知，矢車菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸體系的平均RMSD值在0.20 nm左右變化，經(jīng)過10 ns分子動力學(xué)模擬后達(dá)到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，表明體系的總體穩(wěn)定和平衡，而矢車菊-3-O-葡萄糖體系雖然也達(dá)到平衡，但其浮動范圍大于矢車菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸體系，這也表明二元復(fù)合物體系更加有利于矢車菊-3-O-葡萄糖穩(wěn)定。

此外，通過計算溶劑可及表面積可以確定矢車菊-3-O-葡萄糖的殘基溶劑可及性的變化，其作為分子表面與溶劑分子相互作用比例的參數(shù)，可用于預(yù)測結(jié)合過程中發(fā)生構(gòu)象變化的程度。圖4C顯示為2 種體系中矢車菊-3-O-葡萄糖的溶劑可及表面積變化值，與矢車菊-3-O-葡萄糖體系不同的是，矢車菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸體系在1 ns左右出現(xiàn)下降隨后趨于穩(wěn)定，類似研究表明疏水相互作用可能有利于矢車菊-3-O-葡萄糖與迷迭香酸的結(jié)合[26,35]。綜上所述，分子動力學(xué)模擬表明迷迭香酸主要通過氫鍵和π-π堆積作用力與花色苷結(jié)合，從而對花色苷的穩(wěn)定性起到保護(hù)作用，這些結(jié)果與實驗研究的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究選用7 種酚類化合物和有機酸（表兒茶素、咖啡酸、迷迭香酸、綠原酸、草酸、蘋果酸、丁香酸），結(jié)合輔色效果和熱穩(wěn)定性評價其在pH 3.0和pH 5.0條件下對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，除蘋果酸外，其余6 種輔色劑均對黑米花色苷在pH 3.0和pH 5.0條件下具有較好的輔色效果并能提高其熱穩(wěn)定性，其中在pH 3.0條件下添加迷迭香酸的效果最佳。在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.1～4.0 mg/mL），迷迭香酸質(zhì)量濃度越高對黑米花色苷的輔色效果越好，添加質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的迷迭香酸對黑米花色苷顏色穩(wěn)定性的保護(hù)作用最好。紅外光譜、分子對接及分子動力學(xué)模擬表明迷迭香酸可通過氫鍵和π-π堆積相互作用力與花色苷結(jié)合，從而提高黑米花色苷的穩(wěn)定性。因此，為了提高黑米花色苷的顏色穩(wěn)定性，擴大其在功能和營養(yǎng)食品中的應(yīng)用，可考慮添加迷迭香酸作為輔色劑。