氣相色譜-負化學源電離-質譜法測定蔬菜中氟蟲腈及其代謝物殘留

高 霞，陳 輝，譚 敏，李玉秀，何泓霖

（1.湖南新程檢測有限公司，湖南 株洲 412000；2.工業(yè)和信息化部電子第五研究所，廣東 廣州 510000）

氟蟲腈商品名為銳勁特，是法國拜耳作物科學公司（原羅納-普朗克公司）于1987年開發(fā)的苯基吡唑類光譜殺蟲劑[1-3]，由于氟蟲腈具有殺蟲譜廣、殺蟲效果好、時效長、不影響作物生長等優(yōu)勢曾于20世紀90年代后期在我國大范圍推廣和應用[4-5]。動物實驗研究表明，大量攝入含一定濃度氟蟲腈的食品會損傷消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、肝臟、腎臟、甲狀腺等[6-7]。氟蟲腈在環(huán)境中穩(wěn)定性較差，能代謝出成毒性更強的氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜3 種代謝物[8]，世界衛(wèi)生組織將氟蟲腈列為對人類有中等毒性化學品[9]。我國農業(yè)部、工業(yè)和信息化部、環(huán)境保護部于2009年聯(lián)合發(fā)布的1157號公告中明確規(guī)定自2009年10月1日起，除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外，在我國境內停止銷售和使用含氟蟲腈成分的農藥制劑[10]。我國于2020年2月15日實施的GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》中規(guī)定了氟蟲腈在蔬菜中的最大殘留限量為0.02 mg/kg，此最大殘留限量為氟蟲腈及其3 種代謝物之和，以氟蟲腈表示[11]。國外方面，歐盟委員會于2020年5月18日實施的2019/1792號條例修訂了氟蟲腈在多種產品中的最大殘留限量，修訂后氟蟲腈在蔬菜中的最大殘留限量為0.005 mg/kg，此最大殘留限量也為氟蟲腈及其3 種代謝物之和。

目前測定食品中氟蟲腈檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質譜法[12-21]、氣相色譜-電子電離源-質譜法[21-25]、氣相色譜-負化學源電離-質譜法[21,26-27]和氣相色譜-串聯(lián)質譜法[21,28-30]。而目前的檢測標準和報道文獻方法中大多集中在氟蟲腈原藥檢測上，也有部分對氟蟲腈代謝物檢測進行研究，但多集中在對動物源食品，且多采用液相色譜-串聯(lián)質譜法、氣相色譜-電子電離源-質譜法和氣相色譜-串聯(lián)質譜法，鮮有采用氣相色譜-負化學源電離-質譜法檢測蔬菜中氟蟲腈及其代謝物的報道。GB 2763—2019規(guī)定蔬菜中氟蟲腈采用SN/T 1982—2007《進出口食品中氟蟲腈殘留量檢測方法 氣相色譜-質譜法》檢測，該方法采用的是氣相色譜-負化學源電離-質譜法，但只檢測氟蟲腈原藥，不涉及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜。氟蟲腈及其3 種代謝物分子結構中含有6 個氟原子、2 個氯原子和1 個氰基基團，具有較強的電負性?；瘜W源電離是軟電離方式，對基質和色譜柱流失沒有響應，采用化學源檢測負離子，相對電子電離源譜圖更簡單，選擇性更好、辨識度更高，也能獲得更高的檢測靈敏度。

綜上所述，建立蔬菜中氟蟲腈及其代謝物殘留量的氣相色譜-負化學源電離-質譜檢測方法迫在眉睫。本實驗基于QuEChERS前處理方法，經過進一步優(yōu)化，結合氣相色譜-負化學源電離-質譜法對蔬菜中氟蟲腈及其3 種代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的檢測進行研究。結果表明，本方法簡便、靈敏、準確，可以滿足蔬菜中氟蟲腈及其3 種代謝物的快速檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜、辣椒、豇豆、甘藍、黃瓜 市購；氟蟲腈、氟蟲腈砜標準品（純度≥96%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；氟甲腈、氟蟲腈亞砜標準儲備溶液（100 μg/mL，溶劑為丙酮） 農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，40～63 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40～63 μm）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB，120～400 目）、尼龍過濾膜（0.22 μm） 上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、丙酮（均為色譜級） 美國TEDIA公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ7000氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（配有Chromeleon 7分析軟件） 美國Thermo Fisher公司；TG18均質器德國IKA公司；VORTEX-6渦旋混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；H2050R冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DC系列24位防腐型水浴氮吹儀上海安譜實驗科技股份有限公司；Transferpette?移液器德國Brand公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

取代表性樣品約1 000 g，切碎后用均質器充分攪碎均勻，放入聚乙烯瓶中，于－20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取10 g均質后樣品于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻1 min，再振蕩提取3 min，加入5 g MgSO4和2 g NaCl，劇烈振蕩1 min，5 000 r/min離心1 min，取2 mL上清液于預先加入50 mg PSA、25 mg C18、25 mg GCB和100 mg MgSO4的離心管中，劇烈振蕩1 min，10 000 r/min離心1 min，取上清液1 mL于40 ℃水浴中氮氣吹干，加入1 mL丙酮，渦旋溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾，待氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定。

1.3.3 標準溶液配制

標準儲備溶液的配制：分別準確稱取氟蟲腈和氟蟲腈砜適量，以丙酮為溶劑，配制質量濃度為100 μg/mL的氟蟲腈和氟蟲腈砜標準儲備溶液，于－20 ℃低溫保存。

混合標準中間液：分別準確吸取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標準儲備溶液各1 mL，用丙酮稀釋至100 mL，配制成質量濃度為1 μg/mL的混合標準中間液，于－20 ℃低溫保存。

空白基質提取液：樣品在1.3.2節(jié)進行前處理后進行儀器分析，當氟蟲腈及其3 種代謝物的定性和定量離子信噪比均小于3時，可確定樣品為空白基質，空白基質按照1.3.2節(jié)前處理，獲得空白基質提取液。

基質混合標準溶液的配制：準確吸取適量混合標準中間液，用空白基質提取液稀釋成質量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/L和10.0 μg/L的基質混合標準溶液，供氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定。

1.3.4 氣相色譜-質譜條件

1.3.4.1 氣相色譜條件

TR-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；進樣模式：不分流進樣；進樣體積1 μL；載氣為高純氦氣；載氣流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度100 ℃，保持1 min，以80 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.3.4.2 質譜條件

傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度150 ℃；四極桿溫度150 ℃；負化學源電離；選擇離子監(jiān)測；溶劑延遲3 min；反應氣：甲烷（純度≥99.999%）；反應氣流速1.25 mL/min。氟蟲腈及其代謝物的檢測參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的檢測參數(shù)Table 1 Chromatographic and MS parameters for fipronil and its metabolites

1.4 數(shù)據處理

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀配備的定量分析軟件Chromeleon 7和Microsoft Excel對檢測結果進行分析和統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 氟蟲腈及其代謝物的檢測參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

嘗試相同規(guī)格（30 m×0.25 mm，0.25 μm）不同固定相的石英毛細管色譜柱，包括TG-1MS色譜柱（100%二甲基聚硅氧烷）、TG-5MS色譜柱（5%苯基/95%二甲基聚硅氧烷）和TR-5MS色譜柱（5%苯基聚硅氧烷），結果發(fā)現(xiàn)氟蟲腈及其3 種代謝物在3 種色譜柱上均有保留，但在TR-5MS上峰形較好（圖1），因此選擇TR-5MS作為本實驗分析用色譜柱。

圖1 氟蟲腈及其代謝物總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of fipronil and its metabolites

2.1.2 質譜參數(shù)的確定

以負化學源電離為質譜源，采用全掃描離子模式掃描氟蟲腈及其3 種代謝物的特征離子，質量掃描范圍設置為m/z100～500，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的全掃描質譜圖見圖2。根據各化合物的氣相色譜-質譜圖確定特征碎片離子（表1）并建立選擇離子監(jiān)測方法進行后續(xù)分析。

圖2 氟蟲腈及其代謝物全掃描質譜圖Fig.2 Full-scan mass spectra of fipronil and its metabolites

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

農殘檢測中，常用提取溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等，本實驗以添加量為5.0 μg/kg的黃瓜為研究對象，對比乙腈、酸化乙腈（1%乙酸）、丙酮、乙酸乙酯和正己烷作為提取溶劑對氟蟲腈及其3 種代謝物的提取效果，結果見圖3。乙腈和酸化乙腈對4 種化合物的提取回收率高于丙酮、乙酸乙酯和正己烷，乙腈和酸化乙腈對氟蟲腈、氟甲腈和氟蟲腈亞砜的提取回收率接近，均為100%左右，但乙腈對氟蟲腈砜的提取回收率優(yōu)于酸化乙腈，故本研究選用乙腈為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on recoveries of fipronil and its metabolites

2.2.2 提取溶劑用量的確定

以黃瓜為研究對象，準確稱量10.0 g樣品，添加量為5.0 μg/kg時，分別考察乙腈用量為10、15、20、25、30 mL時對農藥殘留的提取效果，結果見圖4。采用20 mL乙腈能達到充分提取目標分析物的目的，繼續(xù)增加乙腈用量，提取效果未見明顯改善。

圖4 提取溶劑用量對回收率的影響Fig.4 Effect of extraction solvent volume on recoveries of fipronil and its metabolites

2.2.3 凈化方法的優(yōu)化

蔬菜樣品經乙腈提取后，會有有機酸、色素、蠟質、維生素等雜質進入提取液中，本研究采用農藥殘留檢測常用的QuEChERS凈化方法對提取液進行凈化，QuEChERS常用吸附劑有PSA、C18和GCB等，PSA通過陰離子交換吸附脂肪酸、有機酸、極性色素以及糖類等干擾物，C18可除去非極性的干擾物如脂類、花青素、蠟質等，GCB作為弱極性或非極性吸附劑，能有效去除疏水性化合物，如葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等色素和甾醇等。為探討PSA、C18和GCB的用量對氟蟲腈及其代謝物回收率影響及無水MgSO4對凈化液的除水效果，以2 mL添加量為5.0 μg/kg黃瓜基質的提取離心后的上清液為研究對象，PSA選取25、50、100 mg三水平，C18選取12.5、25、50 mg三水平，GCB選取12.5、25、50 mg三水平，無水MgSO4選取100、150、200 mg三水平做正交試驗，結果見表2、3。

表2 L9（34）正交試驗設計及結果（n=3）Table 2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of sorbent combinations (n= 3)

由表3可以看出，PSA、C18、GCB和MgSO4的平均極差值分別為8.3%、7.3%、10.1%和4.1%，4 個因素對加標回收率的主次影響順序為GCB、PSA、C18和MgSO4，從表3四種吸附劑各水平下整體平均回收率可以看出各因素的最好水平分別為PSA水平2，GCB水平2、C18水平2、MgSO4水平1，即4 種吸附劑的最佳組合為PSA 50 mg、GCB 25 mg、C1825 mg、MgSO4100 mg，此組合并未出現(xiàn)在正交試驗表中，通過驗證實驗，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的加標回收率分別為93.4%、94.6%、98.1%和99.3%，整體優(yōu)于表2中數(shù)據。

表3 正交試驗結果分析Table 3 Result analysis of orthogonal array design%

2.3 基質效應

基質效應為基質匹配標準曲線的斜率與溶劑標準標準曲線的斜率兩者比值，比值越接近1，則基質效應越小。本研究考察氟蟲腈及其3 種代謝物在菠菜、辣椒、豇豆、甘藍和黃瓜中的基質效應，結果見表4。氟蟲腈及其3 種代謝物在5 種蔬菜中存在不同程度的基質效應，氟蟲腈及其3 種代謝物中氟蟲腈的基質效應最大、氟甲腈的基質效應最小，5 種蔬菜中菠菜的基質效應最大、黃瓜的基質效應最小。為克服基質效應，本研究采用基質匹配標準曲線法定量。

表4 氟蟲腈及代謝物的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、LOD和LOQTable 4 Calibration equations, coefficients of determination, liner ranges, LODs and LOQs for fipronil and its metabolites

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍、LOD和LOQ結果

在優(yōu)化的分析條件下，配制氟蟲腈及其代謝物質量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/L的基質混合標準溶液，經氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定后，以農藥定量離子峰面積為縱坐標，農藥基質標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。以添加回收樣品峰響應值為3 倍信噪比為方法檢出限（limit of detection，LOD），以10 倍信噪比為方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。如表4所示，氟蟲腈及其代謝物在0.2～10.0 μg/L線性范圍內，線性關系良好，線性相關系數(shù)均大于0.999，LOD為0.2～0.3 μg/kg，LOQ為1.0 μg/kg，低于GB 2763—2019標準和歐盟委員會（EU）2019/1792號條例規(guī)定的氟蟲腈在蔬菜中的最大殘留限量。

2.4.2 加標回收率和精密度結果

在菠菜、辣椒、豇豆、甘藍和黃瓜5 種空白樣品中添加適量氟蟲腈及其代謝物標準溶液，使添加水平分別為LOQ、5 倍LOQ和10 倍LOQ。每個添加水平進行6 次平行實驗。采用基質匹配標準曲線進行定量分析，結果見表5。4 種化合物的平均加標回收率在88.9%～105.8%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2.2%～7.6%之間，方法具有較好的回收率和重復性。證明前處理方法及氣相色譜-負化學源電離-質譜法靈敏、準確、高效，適用于各種類別蔬菜中4 種農藥殘留的同時測定。

表5 5 種蔬菜基質中4 種農藥的平均回收率和精密度（n=6）Table 5 Average spiked recoveries and precision for fipronil and its metabolites in five vegetables (n= 6)

2.5 實際樣品檢測

應用本方法測定了市售菠菜、辣椒、豇豆、甘藍和黃瓜5 種蔬菜中的氟蟲腈及其代謝物殘留，在一批豇豆樣品中檢出了氟蟲腈和氟蟲腈亞砜，含量分別為64.2 μg/kg和3.1 μg/kg，二者之和以氟蟲腈表示為66.7 μg/kg，超過GB 2763—2019規(guī)定的氟蟲腈在蔬菜中0.02 mg/kg的最大殘留限量，為不合格樣品。圖5為檢出氟蟲腈和氟蟲腈亞砜殘留的陽性豇豆樣品的總離子流色譜圖。

圖5 陽性豇豆樣品中氟蟲腈及其代謝物總離子流色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of fipronil and its metabolites in positive cowpea samples

3 結 論

本研究建立了氣相色譜-負化學源電離-質譜法測定蔬菜中氟蟲腈及其3 種代謝物殘留的檢測方法。與標準方法及已有報道相比，本方法涵蓋了GB 2763—2019及歐盟委員會限量規(guī)定中的氟蟲腈的全部殘留標志物檢測，本方法樣品前處理簡便快速、回收率高，LOQ及精密度均能滿足痕量分析要求，可用以蔬菜中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定。