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    體外模擬消化對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

    2021-07-28 07:13:08韓榮欣
    食品與機(jī)械 2021年7期
    關(guān)鍵詞:蛋白酶解酸棗仁清除率

    韓榮欣

    張紅印1

    周光鑫1

    王海東1

    肖鳳琴1

    李光哲1,2

    嚴(yán)銘銘1,2

    (1. 長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長春 130117;2. 吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心,吉林 長春 130117)

    酸棗仁作為國家頒布的首批藥食同源中藥材,近年來在食品及保健食品中的應(yīng)用日益增加。現(xiàn)代科學(xué)研究表明,酸棗仁中富含多種化學(xué)成分,如皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸以及蛋白質(zhì)等化學(xué)成分[1],具有多種藥理作用,如鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用,抗動脈粥樣硬化、抗心律失常等對心血管系統(tǒng)作用,以及抗氧化、抗腫瘤、抗炎、改善記憶能力等其他藥理作用[2]。研究[3]表明,酸棗仁中蛋白質(zhì)含量約占其干重的40%,含有17種人體所需氨基酸,其組成較為合理,具有較高的營養(yǎng)價值和研究前景。

    自由基是人體在進(jìn)行正常生命活動時產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物。目前已從多種植物(如黑豆[4]、綠豆[5]、核桃[6]等)中提取分離出蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物及肽類物質(zhì),并且表現(xiàn)出較好的自由基清除活性,這些蛋白酶解產(chǎn)物或抗氧化肽可作為食品添加劑有效地應(yīng)用于食品加工行業(yè)。

    課題組[7]前期研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁蛋白具有一定的抗氧化活性,且其功能特性較好,可作為一種潛在的新型功能性蛋白資源應(yīng)用于食品行業(yè)中。采用酶解法對酸棗仁蛋白進(jìn)行酶解處理得到的酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物,具有比酸棗仁蛋白更好的功能特性[8]以及體外抗氧化活性。研究擬通過體外模擬胃腸消化,對消化前后酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成以及體外抗氧化活性進(jìn)行比較,探究人體攝入后對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的活性變化,為酸棗仁蛋白及其酶解產(chǎn)物在食品和保健食品行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 試劑與儀器

    1.1 試驗(yàn)材料

    酸棗仁蛋白:課題組自制;

    堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶:上海源葉生物科技有限公司;

    人工胃液:北京百奧萊博科技有限公司;

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+):北京索萊寶科技有限公司;

    其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 試驗(yàn)儀器

    高速中藥粉碎機(jī):HX-400A型,浙江省永康市溪岸五金藥具廠;

    數(shù)顯恒溫水浴鍋:HH-6型,金壇市佳美儀器有限公司;

    集熱式磁力攪拌器:DF-101S型,金壇市醫(yī)療器械廠;

    冷凍干燥機(jī):SCIENTZ-50F型,寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;

    紫外分光光度計:UV-1700型,日本島津(中國)有限公司;

    高效液相色譜儀:2010A型,日本島津(中國)有限公司;

    臺式pH計:S220-K-CN型,梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;

    電子分析天平:AB265-S型,梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;

    高速離心機(jī):Centrifuge 5840 R型,德國Eppendorf公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物制備 根據(jù)Wang等[9]的方法并修改。取酸棗仁蛋白,加入蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的蛋白溶液,m酶∶m底物為1∶50,加入堿性蛋白酶,調(diào)節(jié)溶液pH為8.5,酶解時間3 h,90 ℃水浴滅酶10 min,冷卻后用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0,8 000 r/min離心10 min,取上清液,凍干得酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物(SZPHs)。

    1.3.2 體外模擬胃腸消化 根據(jù)Zhang等[10]的方法并修改。取酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物,加入蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液,與模擬人工胃液按V酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物∶V模擬人工胃液為1∶1混勻,用濃度為1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH至3.0,向混合溶液中加入胃蛋白酶,使其用量為2 000 U/mL,37 ℃、100 r/min振蕩2 h,冷卻后用1.0 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.5,將消化液與模擬腸液按V消化液∶V模擬腸液為1∶1混勻,加入胰蛋白酶,使其用量為100 U/mL,繼續(xù)消化2 h,100 ℃水浴滅酶10 min,冷卻后用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0,8 000 r/min離心10 min,取上清液凍干得酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物(SZPHs-GD)。

    1.3.3 氨基酸組成分析 根據(jù)Wang等[9]的方法并修改。取SZPHs、SZPHs-GD各30 mg,加入4 mL濃度為6 mol/L 的HCl溶液,110 ℃反應(yīng)24 h。由于測定方法為酸水解法,色氨酸在測定過程中大部分被破壞,導(dǎo)致其含量較低,故不作分析。

    1.3.4 分子量分布測定 參照Zhang等[10]的方法。色譜條件:色譜柱為Shodex OHpak SB-803 HQ GPC色譜柱;流動相為乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=20.0∶80.0∶0.2);流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;紫外檢測波長220 nm;進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)曲線計算各樣品分子量分布范圍:核糖核酸酶A(13.700 kDa)、人胰島素(5.808 kDa)、胸腺肽α1(3.108 kDa)、生長抑素(1.638 kDa)、甘氨酸—甘氨酸—甘氨酸(0.189 kDa)。

    1.3.5 體外抗氧化活性測定

    (1) DPPH自由基清除能力:根據(jù)Wen等[11]的方法并修改。取一定質(zhì)量的SZPHs及SZPHs-GD,加蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液;準(zhǔn)確稱取4.00 mg DPPH粉末,加95%乙醇超聲溶解定容至100 mL,制備0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別吸取1 mL樣品溶液與DPPH溶液混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,測定517 nm處吸光度;以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組,以0.5 mL蒸餾水+0.5 mL 95%乙醇混合溶液代替DPPH溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照組,并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

    (1)

    式中:

    S——DPPH自由基/超氧陰離子清除率,%;

    A0——空白對照組吸光值;

    A1——樣品組吸光值;

    A2——樣品對照組吸光值。

    (2) ABTS+自由基清除能力:根據(jù)Chang等[12]的方法并修改。將5 mL濃度為7.4 mmol/L的ABTS+儲備液與88 μL濃度為2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻,靜置12~16 h,配制成ABTS+儲備液。取ABTS+儲備液0.4 mL,用pH為7.4的PBS溶液稀釋,使734 nm處吸光度為0.7±0.2,制成ABTS+工作液。分別將200 μL ABTS+工作液與10 μL不同濃度的樣品溶液混勻,室溫避光反應(yīng)6 min,測定734 nm處吸光度值。用10 μL PBS溶液代替樣品溶液作為對照組,以維生素C為陽性對照組,按式(2)計算ABTS+自由基清除率。

    (2)

    式中:

    S——ABTS+自由基清除率,%;

    A0——空白對照組吸光值;

    A1——樣品組吸光值。

    (3) 超氧陰離子清除能力:采用鄰苯三酚自氧化法[13]。取pH為8.2的Tris-HC1溶液3 mL,加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.1 mL,(25.0±0.5) ℃水浴20 min,加入25 ℃預(yù)熱后的鄰苯三酚溶液(7 mmol/L)0.3 mL,混勻,25 ℃水浴4 min,迅速加入濃鹽酸1 mL,混勻,測定420 nm處吸光度值;以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對照組,以3 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照組,按式(1)計算超氧陰離子清除率。

    (4) 羥基自由基清除能力:采用鄰二氮菲法[14]。取鄰二氮菲溶液(0.75 mmol/L)1 mL于試管中,加入PBS溶液(0.2 mol/L,pH=7.4)2 mL,再加入樣品溶液1 mL,混勻,加入FeSO4溶液(0.75 mmol/L)1 mL,混勻,加入0.025% H2O2溶液1 mL,混勻,37 ℃水浴1 h,測定536 nm處吸光度值;以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對照組,以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照組,按式(3)計算羥基自由基清除率。

    (3)

    式中:

    S——羥基自由基清除率,%;

    A0——空白對照組吸光值;

    A1——樣品組吸光值;

    A2——樣品對照組吸光值。

    1.3.6 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)平行測定3次,結(jié)果取平均值,使用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 體外模擬消化前后的氨基酸組成變化

    由表1可知,酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物及其消化物中谷氨酸(分別為17.66%,19.07%)、天冬氨酸(分別為7.92%,8.62%)、精氨酸(分別為6.84%,6.87%)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,其中天冬氨酸、谷氨酸等帶負(fù)電氨基酸(NCAA)為主要氨基酸,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25.58%和27.69%,這是由于NCAA是種子類植物中主要的氨基酸[15]。研究[16]表明,NCAA可通過提供電子達(dá)到有效清除自由基的作用。SZPHs及SZPHs-GD中還具有一定的疏水性氨基酸(HAA,分別為16.13%,14.82%),HAA的存在與其脂溶性有關(guān),可通過與脂溶性自由基結(jié)合達(dá)到清除自由基的作用[17]。此外,SZPHs及SZPHs-GD中必需氨基酸(EAA)含量較高,且消化前后質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著變化,分別為17.34%和17.14%,各氨基酸含量均達(dá)到WHO/FAO對成人需求量的要求,表明SZPHs具有一定營養(yǎng)價值。體外模擬消化試驗(yàn)表明,SZPHs經(jīng)體外模擬胃腸消化后,HAA含量有所降低,而親水性氨基酸、芳香族氨基酸(AAA)及NCAA含量增加,這種含量變化現(xiàn)象可能會對其體外抗氧化活性造成一定影響。

    表1 SZPHs及SZPHs-GD的氨基酸組成?

    2.2 體外模擬消化前后分子量分布變化

    由表2可知,SZPHs及SZPHs-GD分子量主要在5 kDa以下,分別占其總比例的82.06%及86.79%。SZPHs經(jīng)體外模擬消化后,分子量>10 kDa的比例有所降低,分子量<5 kDa的比例有所增加,表明SZPHs經(jīng)體外模擬消化后,其肽鍵被進(jìn)一步破壞,產(chǎn)生了更多分子量較小的肽段。此外,分子量<1 kDa的肽因其較低的分子量而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[18]。SZPHs及SZPHs-GD所含<1 kDa的肽段分別占總比例的17.79%和19.67%,說明SZPHs及SZPHs-GD具有較好的抗氧化活性。

    2.3 體外模擬消化前后的抗氧化活性變化

    2.3.1 DPPH自由基清除活性 由圖1可知,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~2.5 mg/mL時,SZPHs及SZPHs-GD的DPPH自由基清除活性與樣品濃度呈劑量依賴關(guān)系,且在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時,二者均達(dá)到其最大清除率(93.99%和81.25%)。說明SZPHs經(jīng)模擬胃腸消化后,在1.0~2.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),DPPH自由基清除率可達(dá)到72.89%~81.25%,具有較高的DPPH自由基清除活性,優(yōu)于小麥蛋白酶解產(chǎn)物[19](55.29%)、苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物[18](71.91%)、蛋清多肽[20](69.20%)等。此外,經(jīng)體外模擬胃腸消化后,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時,DPPH自由基清除率由73.79%降至55.45%,可能是由于消化后HAA含量降低,其與脂溶性的DPPH結(jié)合能力降低,故DPPH自由基清除能力有所降低,與馬勇等[21]的結(jié)果類似。

    2.3.2 ABTS+自由基清除活性 由圖2可知,當(dāng)質(zhì)量濃

    表2 SZPHs及SZPHs-GD的分子量分布

    度為0.5~2.5 mg/mL時,SZPHs及SZPHs-GD對ABTS+自由基清除活性隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),且在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時,二者均達(dá)到最大清除活性(86.59%和90.40%)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0~2.5 mg/mL時,SZPHs-GD對ABTS+自由基的清除率可達(dá)到78.83%~90.40%,具有較好的ABTS+自由基清除活性,優(yōu)于其他蛋白酶解產(chǎn)物或多肽(大豆蛋白酶解物55.84%[22],芝麻抗氧化肽51.26%[23]等)。SZPHs經(jīng)體外模擬胃腸消化后,所得產(chǎn)物SZPHs-GD對ABTS+自由基的清除能力增強(qiáng),可能是由于SZPHs經(jīng)模擬胃腸消化后,親水性的肽和氨基酸含量增加,進(jìn)而增強(qiáng)了對ABTS+自由基的清除能力。綜上,SZPHs經(jīng)體外模擬消化后,可進(jìn)一步提升對ABTS+自由基的清除活性。

    2.3.3 超氧陰離子清除活性 由圖3可知,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~2.5 mg/mL時,SZPHs及SZPHs-GD對超氧陰離子的清除活性與樣品濃度呈正相關(guān),二者均在2.5 mg/mL時具有最高的清除活性(43.19%和47.51%)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~2.5 mg/mL時,SZPHs-GD對超氧陰離子的清除率可達(dá)到30.46%~47.51%,具有較好的超氧陰離子清除活性。此外,SZPHs-GD的超氧陰離子清除活性較SZPHs略有提高,其中最高可提高近10%,可能是由于模擬胃腸消化后,芳香族氨基酸含量增加,其提供質(zhì)子能力增強(qiáng),提高了對超氧陰離子的清除能力[13]。綜上,SZPHs經(jīng)體外模擬消化后,可進(jìn)一步提高其對超氧陰離子的清除活性。

    圖1 SZPHs及SZPHs-GD的DPPH自由基清除率

    圖2 SZPHs及SZPHs-GD的ABTS+自由基清除率

    圖3 SZPHs及SZPHs-GD的超氧陰離子清除率

    2.3.4 羥基自由基清除活性 由圖4可知,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~2.5 mg/mL時,SZPHs及SZPHs-GD對羥基自由基的清除活性隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng),且在2.5 mg/mL時達(dá)到最大值(50.23%和32.66%)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5~2.5 mg/mL時,SZPHs-GD對羥基自由基清除率可達(dá)9.92%~32.66%,具有一定的羥基自由基清除活性。經(jīng)過體外模擬消化后,SZPHs-GD對羥基自由基的清除活性略有降低,可能是由于消化后產(chǎn)生了對羥基自由基沒有清除作用的小肽或者氨基酸,與Barbara等[24]的結(jié)果類似。

    3 結(jié)論

    經(jīng)體外模擬胃腸消化后,酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物中疏水性氨基酸含量有所降低,而帶負(fù)電氨基酸和親水性氨基酸含量升高,必需氨基酸含量無明顯變化,可達(dá)到WHO/FAO所要求的成人需求量,說明模擬胃腸消化對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物營養(yǎng)價值影響較小。分子量分布研究表明,酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)體外模擬消化后,分子量>5 kDa的比例增加,表明模擬胃腸消化后,可進(jìn)一步降低其分子量。體外抗氧化試驗(yàn)表明,酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物對DPPH自由基清除率最高可達(dá)81.25%,對ABTS+自由基清除率最高可達(dá)90.40%,對超氧陰離子清除率最高可達(dá)47.51%,對羥基自由基清除率最高可達(dá)32.66%,具有較好的體外抗氧化活性。綜上,酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)模擬胃腸消化后,所得產(chǎn)物酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物仍具有較好的氨基酸組成及良好的抗氧化活性,可作為一種潛在的抗氧化劑應(yīng)用至食品行業(yè)中。后續(xù)將對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物及酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物在細(xì)胞試驗(yàn)中的抗氧化作用進(jìn)行研究,并通過凝膠色譜等技術(shù)對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物及酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物進(jìn)行分離純化,以期得到具有高抗氧化活性的肽段。

    圖4 SZPHs及SZPHs-GD的羥基自由基清除率

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