TGF-β1在二尖瓣腱索斷裂患者血清與組織中的表達(dá)

李 躒，周景昕，趙 萌，唐義虎，戴亞偉，吳延虎

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科，江蘇 南京 210029

二尖瓣腱索斷裂（mitral chordae tendineae rupture，MCTR）是臨床引起單純性二尖瓣關(guān)閉不全的主要原因，其發(fā)生可導(dǎo)致嚴(yán)重的血流動力學(xué)改變。目前腱索斷裂考慮與細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、黏液瘤、結(jié)締組織病、冠心病、肥厚性心肌病、胸外傷以及遺傳等因素有關(guān)［1］，但關(guān)于腱索斷裂的分子機(jī)制研究較少，并且有研究顯示腱索斷裂可能是由于炎癥反應(yīng)以及血管生成介質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)、膠原合成異常引起［2-3］。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）是一種人體多功能因子，在機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化上具有重要作用，其中TGFβ1 是其亞型，活性程度最高，它既是重要的炎性介質(zhì)，又是重要的促纖維化因子，能夠使炎癥部位或者受損的組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度表達(dá)，纖維結(jié)締組織過度增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，產(chǎn)生膠原［4］。二尖瓣腱索由豐富的膠原纖維組成，成纖維細(xì)胞散布在膠原纖維束間［2］。研究顯示在炎癥反應(yīng)下，TGF-β1升高會出現(xiàn)膠原過度沉積、合成排列異常，導(dǎo)致組織順應(yīng)性下降［4］。目前已有報道TGF-β1 與二尖瓣關(guān)閉不全存在一定關(guān)系［5-7］，但關(guān)于TGF-β1與二尖瓣腱索斷裂相關(guān)研究較少，本研究旨在探究TGF-β1 在二尖瓣腱索斷裂患者血清和組織中的表達(dá)，報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象

將2020 年6—12 月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的由腱索斷裂引起單純性二尖瓣關(guān)閉不全的患者20 例作為實驗組，心功能Ⅱ級13 例，Ⅲ級7 例，男12 例，女8 例，年齡（64.7±7.7）歲；另隨機(jī)選取同期健康體檢者20 例為對照組，男12 例，女8 例，年齡（62.4±6.0）歲；同期心臟移植受者8 例，男7 例，女1 例，年齡（53.6±5.1）歲。實驗組的納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合二尖瓣腱索斷裂診斷［8］，且合并有中度以上二尖瓣反流者；②入院資料完善，且患者依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有近期感冒、肺部感染或其他感染史；②合并有急性心衰、肝腎功能不全；③合并有高血壓、高血脂、冠心病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病；④血清抗“O”陽性；⑤合并其他遺傳或代謝類結(jié)締組織類疾??；⑥合并心肌病、黏液瘤、腫瘤、胸部外傷、器官畸形等。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批件號：2019-SR-313.A1，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

收集所有研究對象的一般資料、實驗室檢查和心臟超聲檢查結(jié)果，包括年齡、性別、體重、吸煙史、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、入院血壓、血糖、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、左房內(nèi)徑（left atrial diameter，LAD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）、室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）。

1.2.2 血清TGF-β1的測定

待研究對象空腹12 h后采集外周靜脈血2～3 mL，將采集血放置于分離膠-促凝管（黃管）中，4 ℃保存并靜置2 h 后經(jīng)離心（3 000 r/min 20 min）取上層血清于-80 ℃冰箱保存待檢，最后統(tǒng)一采用TGF-β1 ELISA試劑盒（泉州睿信生物科技公司）檢測所有血清樣品中TGF-β1 的水平，具體實驗操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒相關(guān)儀器使用說明書進(jìn)行。

1.2.3 免疫組化染色

收取外科手術(shù)中實驗組15 例患者斷裂的二尖瓣腱索組織以及本院同期8例心臟移植受者正常二尖瓣腱索組織，標(biāo)本取材后立即固定24 h后石蠟包埋切片，經(jīng)過抗原修復(fù)，溫室封閉后滴加1∶500 TGF-β1 與α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的一抗（武漢Servicebio公司），4 ℃孵育過夜后進(jìn)行脫色搖床洗滌3次。切片稍甩干后滴加與一抗相應(yīng)的二抗（武漢Servicebio公司）覆蓋組織，室溫孵育50 min。經(jīng)過顯色沖洗脫水晾干等處理后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，最后行圖像采集分析。

1.2.4 掃描電鏡檢查

收取實驗組15例患者斷裂的二尖瓣腱索、尚未斷裂腱索組織以及同期8例心臟移植受者正常二尖瓣腱索組織，取材后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫避光固定2 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃保存，最后統(tǒng)一經(jīng)掃描電鏡觀察二尖瓣腱索組織的顯微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件分析所得數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布、方差齊的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)（百分率）［n（%）］表示，組間比較用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

本研究對象共40例，實驗組20例，對照組20例，比較實驗組與對照組的年齡、性別構(gòu)成、體重、BMI、吸煙史、入院血壓及血糖，結(jié)果顯示兩組資料無顯著差異（P＞0.05，表1），具有可比性。

表1 兩組一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data between the two groups

2.2 兩組血液檢測結(jié)果比較

ELISA 檢測結(jié)果顯示實驗組血清TGF-β1 水平顯著高于對照組水平（P＜0.05，表2），而比較兩組血清TG、TC、LDL-C、CRP、PCT 水平，實驗組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 兩組血液檢測指標(biāo)比較Table 2 Comparison of blood test indexes between the two groups

2.3 兩組心功能指標(biāo)比較

實驗組LAD、LVEDd 水平顯著高于對照組（P＜0.01，表3），而比較LVPWT、IVST、LVEF 水平，實驗組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 兩組心功能指標(biāo)比較Table 3 Comparison of cardiac function indexes between the two groups（）

表3 兩組心功能指標(biāo)比較Table 3 Comparison of cardiac function indexes between the two groups（）

2.4 免疫組化分析

收取外科手術(shù)中實驗組患者斷裂的二尖瓣腱索組織以及心臟移植受者正常二尖瓣腱索組織進(jìn)行免疫組化分析。通過對不同腱索陽性信號區(qū)域比較，斷裂的二尖瓣腱索組織TGF-β1 及α-SMA 蛋白的表達(dá)水平高于心臟移植受體的正常二尖瓣腱

*：秩和檢驗的Z值。索組織（P＜0.05，圖1），表達(dá)位置主要集中于腱索的疏松層。此外在斷裂的二尖瓣腱索中，可明顯觀察到疏松層的細(xì)胞核數(shù)較正常腱索明顯增多。

圖1 免疫組化檢測腱索組織TGF-β1以及α-SMA的表達(dá)（×400）Figure 1 Immunohistochemical detection of TGF-β1 and α-SMA expression in chordae tendineae（×400）

2.5 掃描電鏡觀察

收取外科手術(shù)中實驗組患者斷裂及尚未斷裂的二尖瓣腱索組織以及心臟移植受者正常二尖瓣腱索組織進(jìn)行掃描電鏡下分析，顯示心臟移植受體的正常二尖瓣腱索（圖2A）的疏松層與致密層結(jié)合緊密，疏松層未見明顯分層，膠原纖維束排列整齊規(guī)則；而二尖瓣腱索斷裂患者的斷裂（圖2B）以及尚未斷裂的腱索（圖2C）較正常腱索膠原纖維束排列紊亂，疏松層（外層）明顯增厚且有分層、斷端，同時致密層（內(nèi)層）也可見明顯裂隙。

圖2 掃描電鏡下腱索組織顯微結(jié)構(gòu)（×400）Figure 2 Microstructure of chordae tendineae under scanning electron microscopy（×400）

3 討論

隨著人們生活質(zhì)量的提高以及醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，臨床上風(fēng)濕病引起的二尖瓣關(guān)閉不全逐漸減少，二尖瓣腱索斷裂逐漸成為引起二尖瓣關(guān)閉不全的重要原因。二尖瓣腱索由豐富的膠原纖維組成，大量成纖維細(xì)胞散布在膠原纖維束間，沿纖維走向排列，維持著腱索正常的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞群在一定因素（氧化應(yīng)激、炎癥因子）誘導(dǎo)下可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，同時膠原生成沉積，促使組織順應(yīng)性降低，產(chǎn)生僵硬改變，在腱索斷裂、瓣膜關(guān)閉不全過程中發(fā)揮著重要作用［9］。Aydemir等［10］通過研究二尖瓣腱索斷裂患者血液中微量元素水平的改變，證實了二尖瓣腱索斷裂過程存在炎癥和相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而且是密切相關(guān)的。

TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的因子，它存在于機(jī)體細(xì)胞表面或者細(xì)胞基質(zhì)，屬于TGF-β家族中最重要的一個亞型，與TGF-β2、TGF-β3其他亞型相比，其生物學(xué)作用更加廣泛［11］。TGF-β1通過細(xì)胞內(nèi)Smad信號通路，在纖維細(xì)胞增殖、多種細(xì)胞的分化、炎性反應(yīng)、膠原分泌、蛋白酶抑制物生成、ECM 沉積和腫瘤侵襲中發(fā)揮著重要作用［12-14］。通過結(jié)合成纖維細(xì)胞膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型TGF受體，TGF-β1促使Smad2和Smad3磷酸化，其中Smad3是TGF-β1下游在纖維化過程中主要效應(yīng)分子，磷酸化的Smad2和Smad3又能與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體完成纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。同時，TGF-β1還可刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)ɑ-SMA，作為經(jīng)典肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，ɑ-SMA表達(dá)升高是向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志［15-17］。研究顯示TGF-β1水平升高與肌成纖維細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，能夠促進(jìn)心肌及其他組織纖維化發(fā)展［18-19］，從而加速組織膠原沉積，出現(xiàn)組織僵硬、順應(yīng)性下降。本研究結(jié)果顯示，通過免疫組化分析可發(fā)現(xiàn)實驗組斷裂腱索組織的TGF-β1 與ɑ-SMA 含量顯著高于正常腱索組織，成纖維細(xì)胞在TGF-β1的刺激下可表達(dá)ɑ-SMA，并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。組織中ɑ-SMA 水平升高側(cè)面表明了二尖瓣腱索斷裂是與纖維化密切相關(guān)的；實驗組血清TGF-β1 水平顯著高于對照組，這與上述研究結(jié)果一致，提示TGF-β1 可能與二尖瓣腱索斷裂發(fā)生發(fā)展相關(guān)。實驗組與對照組血清CRP、PCT 水平無明顯差異，它們可能是在腱索斷裂炎癥的相對晚期階段消耗后被測量的，或者這些炎癥介質(zhì)不足以在血清中產(chǎn)生明顯改變。

由于炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)激活以及長期機(jī)械疲勞等一系列因素作用于二尖瓣腱索組織，引起細(xì)胞外間質(zhì)增多，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，膠原過度沉積導(dǎo)致組織順應(yīng)性下降，最終出現(xiàn)二尖瓣腱索斷裂的發(fā)生發(fā)展，并出現(xiàn)二尖瓣關(guān)閉不全的表現(xiàn)。本研究中掃描電鏡觀察顯示腱索斷裂患者病變腱索鏡下結(jié)構(gòu)與正常腱索相比，膠原纖維束排列紊亂，疏松層（外層）明顯增厚且有分層、斷端，同時，致密層（內(nèi)層）也可見明顯裂隙。心臟超聲中LAD、LVPW、IVS、LVEDd、LVEF 是評價心功能的重要指標(biāo)，通過分析，實驗組與對照組LVPW、IVS、LVEDd、LVEF 水平無顯著差異，但實驗組LAD、LVEDd 水平顯著高于對照組，提示在二尖瓣腱索斷裂發(fā)生發(fā)展過程中可能由于血流動力學(xué)影響產(chǎn)生心臟結(jié)構(gòu)改變，伴隨著二尖瓣關(guān)閉不全發(fā)展，臨床上可有心功能不全、心臟房室重構(gòu)、心律失常等表現(xiàn)［20］。

綜上所述，通過對二尖瓣腱索的免疫組化、掃描電鏡觀察以及患者血清TGF-β1 分析，我們發(fā)現(xiàn)二尖瓣腱索斷裂患者血清和腱索組織中的TGF-β1呈高表達(dá)，提示TGF-β1 與二尖瓣腱索斷裂的發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系。腱索斷裂可能是一種炎性、氧化應(yīng)激反應(yīng)過程引起一系列肌成纖維細(xì)胞增多、膠原分泌排列異常的過程，同時，隨著腱索斷裂進(jìn)展可出現(xiàn)瓣膜關(guān)閉異常、心功能不全，嚴(yán)重者導(dǎo)致心力衰竭等各種并發(fā)癥。此外，TGF-β1在腱索斷裂患者血清的高表達(dá)也提示其有望成為反映二尖瓣腱索病情變化的有效指標(biāo)。但本研究樣本納入較少，關(guān)于TGF-β1與二尖瓣腱索斷裂具體發(fā)病機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。