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    1例黏多糖Ⅵ型患者ARSB基因復(fù)合雜合突變位點(diǎn)分析

    2021-07-28 16:00:26周巧利
    關(guān)鍵詞:雜合致病性基因突變

    趙 雪,周巧利,顧 威

    南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇 南京 210008

    黏多糖Ⅵ型綜合征(mucopolysaccharidosis typeⅥ,MPS Ⅵ)又稱Maroteaux-Lamy 綜合征,是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾?。╝utosomal recessive,AR),常因芳基硫酸酯酶B(arylisulfatase B,ARSB)基因的致病性變異引起[1]。據(jù)估計(jì),全球發(fā)病率約為1/320 000~1/248 000[2],居住在德國(guó)的土耳其移民中患病率最高,為0.023‰(1/43 261),在瑞典為1/150萬(wàn),中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)患病率為1/83萬(wàn),中國(guó)大陸目前無(wú)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[3]。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(human gene mutation database,HGMD)可搜索到ARBS基因突變位點(diǎn)達(dá)200余種,大多為錯(cuò)義突變或無(wú)義突變,幾乎每種類型的突變都可引起ARSB 缺乏或缺失,導(dǎo)致部分分解的酸性黏多糖(glycosaminoglycan,GAG)、大分子物質(zhì)硫酸皮膚素(dermatan sulfate,DS)和硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)沉積積聚在組織內(nèi),出現(xiàn)一系列隨著年齡不斷惡化的臨床癥狀[3]。MPS Ⅵ主要特征包括多發(fā)性發(fā)育不良、多種營(yíng)養(yǎng)不良,包括心臟損害、肝脾腫大、聽力損害及眼部異常,骨骼表型以身材矮小和生長(zhǎng)衰竭為特征[4-5]。根據(jù)臨床特征可做出初步診斷,但基因診斷仍是最有效的確診手段。本研究對(duì)1例臨床診斷的MPS Ⅵ患者進(jìn)行二代測(cè)序及家系驗(yàn)證,為進(jìn)一步探討臨床表型與基因型相關(guān)性提供依據(jù)。

    1 病例資料

    患者,男,生后3 月齡時(shí)出現(xiàn)腰部后凸,佩戴矯形器治療,3.5 歲發(fā)現(xiàn)前眼球進(jìn)行性突出,家長(zhǎng)自述“聽力異?!保F(xiàn)4.5 歲因“腰部后凸”于南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科診治。G1P1,足月順產(chǎn),出生體重4.05 kg,7~8 個(gè)月能獨(dú)自坐穩(wěn),1 歲左右能獨(dú)自走穩(wěn),會(huì)喊“爸爸、媽媽”,現(xiàn)行走姿勢(shì)無(wú)明顯異常,無(wú)視力異常,無(wú)高代謝癥狀,口齒不清。母孕期無(wú)特殊,否認(rèn)相關(guān)疾病家族史。入院后查體:身高94.5 cm(<P3),體重15 kg(<P5),左膝伸側(cè)、背部,臀部見多塊青色胎記,特殊面容,眼球明顯突出,鼻梁低平,雞胸。臍疝,約1 元硬幣大小,恥骨聯(lián)合上4 cm 處見一2 cm 長(zhǎng)橫行手術(shù)瘢痕,愈合好,肝脾肋下2 cm,質(zhì)中,骨骺端肥大,關(guān)節(jié)僵硬,手掌大,X 型腿。余無(wú)特殊。

    輔助檢查:胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)35.4 ng/mL;胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor-binding protein-3,IGFBP-3)1.85 μg/mL;IGF-1/IGFBP-3 比值19.1 ng/μg。脊柱全長(zhǎng)正側(cè)位片:腰椎后凸,腰椎椎體前緣發(fā)育差,前下部呈魚嘴樣突出,雙側(cè)肋骨略寬,根部變細(xì),呈飄帶狀,所及骨盆坐骨大切跡深凹,髖臼淺平,右側(cè)股骨頭扁平,密度偏高,雙側(cè)股骨頸略外翻狀。左腕關(guān)節(jié)正位片、四肢及骨盆平片:雙側(cè)尺橈骨干骺端增寬,邊緣可見刺狀突起,所及雙手掌骨近端不規(guī)則,變尖,指骨呈“子彈頭”樣改變,骨齡發(fā)育約相當(dāng)于4 歲;雙側(cè)髖臼頂扁平,股骨頭骨骺發(fā)育小,股骨頸短,下肢長(zhǎng)骨較短,干骺端增寬,脛腓骨顯著,且邊緣可見刺狀突起。頭顱側(cè)位片:頭顱外形增大,蝶鞍拉長(zhǎng),諸骨皮質(zhì)光整。心臟彩超提示二尖瓣前葉輕度脫垂伴關(guān)閉不全(少量反流)、假性室隔膨出瘤(室間隔缺損自然閉合?)、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全(少量反流)。鼻咽側(cè)位片提示腺樣體肥大腭扁桃體增大。眼科視力檢查因患者無(wú)法配合失敗,眼壓正常。聽力測(cè)試中聲阻抗右耳0.67 mL,左耳0.92 mL;耳聲發(fā)射中雙側(cè)瞬態(tài)聲誘發(fā)耳聲發(fā)射均未引出。韋氏智力測(cè)定:語(yǔ)言配合困難,圖片詞匯測(cè)試配合尚可,得分17,IQ 64,輕度弱智。

    結(jié)合患者病史特征,臨床診斷考慮黏多糖貯積癥可能。建議完善基因檢測(cè)。獲得患者家長(zhǎng)知情同意后,抽取患者及其父母、弟弟、妹妹的靜脈血各2 mL(EDTA抗凝)。根據(jù)南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院相關(guān)流程規(guī)定,標(biāo)本統(tǒng)一送至北京邁基諾公司完成基因檢測(cè)。

    基因檢測(cè):二代測(cè)序可以同時(shí)兼顧敏感性和準(zhǔn)確性,被廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域,是目前常用的基因檢測(cè)方法[6]。研究使用標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(北京邁基諾自主研發(fā))進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建。采用目標(biāo)序列捕獲探針(GenCap)對(duì)812個(gè)已知的遺傳性骨骼疾病相關(guān)候選基因外顯子區(qū)域及其邊緣50 bp進(jìn)行捕獲,富集目標(biāo)區(qū)域DNA 片段。借助Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序儀對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序。GenCap 相較于全基因組測(cè)序,產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量更少,避免大量冗余數(shù)據(jù)的產(chǎn)生,便于分析,降低成本。將原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列,然后利用BWA 軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)將過(guò)濾后的序列比對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)人類基因組參考序列(hg19)[7]。利用GATK軟件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出單核苷酸變異(single nucleotide variation,SNV)和插入缺失突變(inserts and deletions,INDEL)的相關(guān)信息[8]。通過(guò)ANNOVAR軟 件(http://annovar.openbio -informatics.org/en/latest/)對(duì)所有的SNV和INDEL進(jìn)行注釋[9]。篩選出正常人數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率小于0.05的突變位點(diǎn),正常人數(shù)據(jù)庫(kù)包括千人基因組計(jì)劃和EXAC等。錯(cuò)義突變使用SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 和GERP++等軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)和保守性預(yù)測(cè)。結(jié)合疾病遺傳模式和患者臨床表征進(jìn)行綜合分析,篩選出可疑候選變異[10]。

    使用預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行致病性分析,根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的變異解讀指南發(fā)現(xiàn)3 個(gè)可能致病基因位點(diǎn):INPPL1、LRP5、ARSB(表1)。INPPL1 為常染色體隱性遺傳,其家系中未發(fā)現(xiàn)同一基因突變,且患者臨床特征與該基因突變表型不相符,故不考慮其致病可能。LRP5為常染色體顯性遺傳,與其相關(guān)的Van Buchem 病2型是一種硬化性骨發(fā)育不良疾病,臨床特征與患者部分重合,但家系驗(yàn)證中無(wú)同一突變。該患者ARSB 基因突變表型與患者臨床特征相符合,且家系驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)相關(guān)位點(diǎn),證實(shí)為常染色體隱性遺傳,考慮為該患者致病基因。利用Primer 3.0 在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)ARSB 基因PCR 引物(表2)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用3130XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序并在ABI 3130 Genetic Analyzer 上進(jìn)行分析。再對(duì)家系成員進(jìn)行共分離驗(yàn)證。使用貝克曼自動(dòng)化工作站預(yù)設(shè)程序,配制PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系,充分混勻、離心后置于已經(jīng)設(shè)置好的PCR 儀中:95 ℃預(yù)變性10 min,35 個(gè)循環(huán)(94 ℃30 s,58~64 ℃30 s,72 ℃45 s),72 ℃延伸5 min,4 ℃保存,每步對(duì)應(yīng)不同的退火溫度(表2)。由于大片段缺插入缺失序列結(jié)果讀取可能存在一定的局限性,實(shí)際操作中可采用一代PCR聯(lián)合Sanger 測(cè)序法進(jìn)行補(bǔ)充[11]。Sanger 驗(yàn)證可采用正向測(cè)序或反向測(cè)序,反向測(cè)序峰圖顯示的堿基有可能為被檢測(cè)堿基的反向互補(bǔ)序列。chr5-78251291突變導(dǎo)致部分序列移碼,正向測(cè)序得到的圖顯示左側(cè)亂峰,無(wú)法使用,故采用反向測(cè)序圖。

    表1 可疑致病基因

    表2 驗(yàn)證引物信息

    最終確定致病的2個(gè)突變位點(diǎn)(圖1):①第5位外顯子上c.979C>T,導(dǎo)致氨基酸改變p.R327X,為無(wú)義突變,變異來(lái)源于母親;②第4位外顯子上c.724_725insCCCTTCAGGTCC,導(dǎo)致氨基酸改變 p.H242delinsPLQVH,為整碼突變,變異來(lái)源于父親,同時(shí)患者妹妹和弟弟相同位點(diǎn)也發(fā)生了雜合變異。

    圖1 ARSB基因Sanger測(cè)序圖

    蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):將需要預(yù)測(cè)的蛋白序列導(dǎo)入在線軟件SWISS-model(https://swiss-model.expasy.org/interactive),選擇覆蓋突變位點(diǎn)range 范圍的蛋白質(zhì)同源性模型[12-14]。模型的一致性和相似度不低于30%,可視化分析軟件Swiss-PdbViewer(http://www.genebee.msu.su/spdbv/text/getpc.htm)[15]繪制蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖,分析預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響。既往研究證實(shí)與野生型相比,Mutant1(p.R327X)因提前終止轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生截短的蛋白,導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整[16];圖2 中Mutant2(p.H242delinsPLQVH)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可見小部分缺失,與野生型相比,插入4個(gè)新的堿基,氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化,原His242 與Tyr175 之間的氫鍵消失,His242 與Glu243 之間的氫鍵消失,取而代之的是Pro242 與Tyr175之間和Gln244與Glu247之間形成新的氫鍵,導(dǎo)致蛋白長(zhǎng)度發(fā)生改變(圖3)。

    圖2 Mutant1、Mutant2與野生型蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對(duì)比圖

    圖3 Mutant2與野生型氨基酸結(jié)構(gòu)對(duì)比圖

    2 討論

    MPS Ⅵ常因第5 染色體(5q13~q14)上的ARSB基因突變引起,該基因由8個(gè)71~885 bp的外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成,轉(zhuǎn)錄合成了2 228 bp 的mRNA,編碼533個(gè)氨基酸的前體蛋白[17]。當(dāng)其編碼的參與黏多糖降解的溶酶體酶發(fā)生儲(chǔ)存障礙時(shí),GAG、DS、CS不能降解,蓄積在溶酶體內(nèi),引起細(xì)胞損害,造成不可逆的多器官功能障礙,一般無(wú)智力異常及神經(jīng)退行性變[18-19]。本研究為了進(jìn)一步明確臨床MPS 診斷,指導(dǎo)臨床治療及判斷預(yù)后,完善MPS 相關(guān)基因測(cè)序和家系驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)了尚未報(bào)道的復(fù)合雜合突變:母源性無(wú)義突變p.R327X 及父源性整碼突變p.H242delinsPLQVH。

    2004 年p.R327X 首次作為新發(fā)位點(diǎn)出現(xiàn)在報(bào)道中,并被證實(shí)與嚴(yán)重的臨床表型存在相關(guān)性[16]。Suarez-Guerrero 等[20]在MPS Ⅵ的病理生理學(xué)、診斷和治療的相關(guān)研究中也指出p.R327X為病情快進(jìn)展突變,患者骨骼系統(tǒng)異常比較明顯,面部特征出現(xiàn)較早。本研究中患者生后3個(gè)月以脊柱發(fā)育異常為首發(fā)癥狀就診,癥狀出現(xiàn)在早期,骨骼系統(tǒng)異常明顯,與既往研究一致。患者同時(shí)存在語(yǔ)言發(fā)育障礙,智力測(cè)試提示輕度弱智,考慮因聽力受損及教育限制導(dǎo)致其語(yǔ)言及智力發(fā)育落后,盡管目前尚未發(fā)現(xiàn)ABSB 基因突變與智力發(fā)育之間的直接關(guān)系,但不能排除該患者另一突變位點(diǎn)的影響。通過(guò)SWISS-model 軟件建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn),與野生型相比,該無(wú)義突變導(dǎo)致ARSB多肽過(guò)早終止,產(chǎn)生無(wú)功能性截?cái)嗟鞍?,ARSB 基因編碼的溶酶體酶活性喪失,引起GAG 異常代謝,產(chǎn)生相關(guān)臨床表型[16]。結(jié)合ACMG 指南,c.979C>T(p.R327X)初步判定為致病性變異(PVS1+PS1+PM2)。

    His242 位于ARSB 蛋白具有α/β拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)并具有酶活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域內(nèi),其變異可能影響ARSB酶活性[21]。本研究中p.H242delinsPLQVH與野生型相比,插入了4個(gè)新的堿基,導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化,原His242 與Tyr175、Glu243 之間的氫鍵消失,Pro242與Tyr175、Gln244與Glu247之間形成新的氫鍵,引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。其可能的致病機(jī)制是氨基酸側(cè)鏈的變化引起非重復(fù)序列區(qū)域框內(nèi)小插入/缺失或終止密碼喪失引起蛋白長(zhǎng)度改變,導(dǎo)致溶酶體酶的缺陷,ARSB 酶活性較低,最終導(dǎo)致MPS Ⅵ。既往研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)伴隨同一染色體上的致病突變時(shí),p.V358M 多態(tài)性可導(dǎo)致ARSB 活性的降低[22]。而已閱文獻(xiàn)中尚無(wú)p.H242R純合突變或單純雜合突變的病例報(bào)道,故推測(cè)p.H242delinsPLQVH 是否也可能同p.V358M 一樣,作為多態(tài)性位點(diǎn)與p.R327X 并存時(shí)致病。致病性分析表明c.724_725insCCCTTCAGGTCC(p.H242delinsPLQVH)為疑似致病性變異(PM2+PM3+PM4)。

    本研究發(fā)現(xiàn)了1 例尚未報(bào)道過(guò)的復(fù)合雜合突變,其父源性突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn),結(jié)合家系驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)該復(fù)合雜合突變?yōu)槌H旧w隱性遺傳,初步判定為可疑致病,但臨床表型與基因型間的相關(guān)性仍無(wú)法明確。本研究與既往大多ARSB基因突變位點(diǎn)研究相同,均止步于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及相關(guān)軟件致病性預(yù)測(cè),缺少進(jìn)一步功能驗(yàn)證,對(duì)臨床表型與基因型的相關(guān)性未能進(jìn)行確認(rèn),基因突變的研究還需進(jìn)一步深入,探索基因治療的可能。但本研究新發(fā)現(xiàn)的復(fù)合雜合突變,擴(kuò)大了ARSB 的致病基因譜,指導(dǎo)患者臨床診治及預(yù)后判斷,基因診斷在罕見疾病診治中是不可或缺的手段。

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