活性多肽GRGDS 對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

張 城，馬劍平，沈育樺，朱文君，劉河龍，邱 彥 （上海健康醫(yī)學(xué)院附屬浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 201200）

腦卒中是人類疾病中最常見(jiàn)的腦血管疾病，已經(jīng)成為人類死亡的第二大原因[1]。腦卒中引起的一系列并發(fā)癥和后遺癥給患者家庭帶來(lái)了不可估量的負(fù)擔(dān)。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種，其中，缺血性腦卒中又稱腦中風(fēng)，是腦卒中主要的發(fā)病方式，約占腦卒中患者的83%以上[2]。目前，尚無(wú)有效的治療藥物用于腦卒中引起的損傷，尤其是對(duì)于神經(jīng)損傷的治療[3]?；钚远嚯腉RGDS 是由甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS）5 種氨基酸構(gòu)成，主要通過(guò)形成一個(gè)β 轉(zhuǎn)角的方式與其他細(xì)胞發(fā)生黏連[4]，因而，能夠阻斷細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面整合素的結(jié)合和黏附，可應(yīng)用于組織工程或者癌癥和腫瘤方面。本試驗(yàn)采用PC12 細(xì)胞體外模擬腦缺血模型，探討活性多肽GRGDS 對(duì)氧糖剝奪損傷后的PC12 細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

PC12 細(xì)胞購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液中，每12 h 觀察一次細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每24 h 更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%進(jìn)行傳代。

1.2 藥物與試劑

活性多肽GRGDS（上海淘普生物科技有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)液、DMEM 無(wú)糖培養(yǎng)液（Gibco 公司）；凋亡試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗體：β-肌動(dòng)蛋白（βactin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)、磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(P-SAPK/JNK)、Bax 蛋白（美國(guó)CST 公司）。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；細(xì)胞缺氧裝置（美國(guó)Billips-Rothenberg 公司）；流式細(xì)胞儀（BDBiosci-ences 公司）；Western blot 圖像掃描儀（美國(guó)Odyssey 公司）。

2 方法

2.1 PC12 細(xì)胞氧糖剝奪損傷模型的建立

氧糖剝奪模型參照文獻(xiàn)[5]體外模擬腦缺血模型，即OGD 模型，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的實(shí)際情況稍作改造。將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)板底面積80%以上，將對(duì)照組的培養(yǎng)液換成無(wú)血清高糖完全培養(yǎng)液，OGD 組換成無(wú)糖培養(yǎng)液，活性多肽GRGDS 給藥組換成加有GRGDS 藥物處理的無(wú)糖培養(yǎng)液。將含有3 組細(xì)胞的培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后將模型組和給藥組的細(xì)胞置于缺氧裝置中，通入混合氣體（95%N2，5%CO2），使裝置內(nèi)的氧氣完全排出，分別將細(xì)胞缺糖和缺氧2、4、6、8 h 后取出，采用MTT 法選出細(xì)胞損傷的最佳時(shí)間，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力

將PC12 細(xì)胞以2.0×105個(gè)/ml 的密度鋪于96 孔板中，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，在缺糖、缺氧之前，將給藥組細(xì)胞的培養(yǎng)液換成含有不同濃度的活性多肽GRGDS（10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μg/ml）的無(wú)糖培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中適應(yīng)1 h，OGD 組和給藥組一同置于缺氧裝置中缺氧4 h。缺氧過(guò)后取出培養(yǎng)板，在避光條件下將所有組的細(xì)胞加入每孔20 μl 提前配好的0.5%MTT 溶液（5 mg/ml），用錫箔紙包好將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育4 h 后棄掉上清液，再向每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)溶液，溫室振蕩5 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在492 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)孔中細(xì)胞的吸光值（A）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將PC12 細(xì)胞鋪于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后將OGD 組中的培養(yǎng)液換成無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)液，給藥組中的培養(yǎng)液換成加有活性多肽GRGDS 處理的無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)液，恒溫孵育1 h 后置于缺氧裝置中缺氧4 h，缺糖、缺氧后棄掉每孔中的細(xì)胞上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2 次，洗掉細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液，再用不含依地酸(EDTA)的胰蛋白酶消化液消化1～2 min。將各組細(xì)胞置于不同的離心管中，以1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，再加入PBS，將細(xì)胞進(jìn)行重懸后再離心。離心后棄掉上清液，每個(gè)離心管中加入500 μl 的1×緩沖液輕輕吹打混勻，避光條件下向各離心管中加入5 μl 的細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑(annexin V-FITC)，室溫放置5 min 后，再加入5 μl 的碘化丙啶(PI)染色液。充分混勻后室溫避光放置15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 ELISA 檢測(cè)OGD 后PC12 細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的變化

將PC12 細(xì)胞氧糖剝奪后取細(xì)胞上清液，4 ℃、300 r/min，離心15 min。離心后取上清液放入4 ℃冰箱冷藏保存，若不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)將上清液放在?20 ℃冷凍保存。按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)各組樣本吸光值，并計(jì)算其濃度。

2.5 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

將氧糖剝奪損傷后的各組細(xì)胞上清液棄掉，用預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮刀將各組細(xì)胞刮掉，置于預(yù)冷的RIPA 裂解液中裂解30 min，使細(xì)胞中的蛋白完全裂解，以12 000 r/min，離心10 min，取上清液。BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組蛋白中加入20 μl 5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。10%SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的Tris 緩沖液封閉1 h，孵育一抗4 ℃環(huán)境下過(guò)夜，回收一抗，洗膜3 次（5 min/次），室溫條件下加二抗，避光孵育2 h 后洗膜。使用Western blot 圖像掃描儀掃描并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 活性多肽GRGDS 對(duì)OGD 損傷的PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用

為了選擇合適的缺糖缺氧時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了2、4、6、8 h 的時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果顯示，細(xì)胞生存率隨著氧糖剝奪時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著降低，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01），且缺糖缺氧4 h 細(xì)胞明顯皺縮，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞的損傷率達(dá)到50%，此時(shí)的損傷率有利于藥物補(bǔ)救，更有助于細(xì)胞的恢復(fù)，因此，氧糖剝奪損傷時(shí)間為4 h 條件最佳（圖1A）?；钚远嚯腉RGDS 給藥濃度為0.01 μg/ml，可顯著提高缺糖缺氧4 h 后PC12 細(xì)胞的活力（P<0.01）。因此，選擇缺糖缺氧4 h，給藥濃度0.01 μg/ml 作為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行后續(xù)研究（圖1B）。

圖1 活性多肽GRGDS 對(duì)OGD 后PC12 細(xì)胞的影響（n=3）

3.2 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細(xì)胞的凋亡

將細(xì)胞以2.0×105個(gè)/ml 細(xì)胞密度鋪于6 孔板中，培養(yǎng)16 h 后，將OGD 組細(xì)胞的高糖培養(yǎng)液換成無(wú)糖的DMEM 培養(yǎng)液，給藥組細(xì)胞的高糖培養(yǎng)液換成給予活性多肽GRGDS 藥物處理的無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中平衡1 h，缺氧4 h，而正常對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)液換成新的高糖DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。缺糖缺氧結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。圖2 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，OGD 組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P<0.01），由正常對(duì)照組（2.26±0.61）%上升到（12.14±1.69）%。給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml劑量濃度處理后，細(xì)胞凋亡率明顯降低，凋亡率降至（6.94±1.45）%（P<0.01）。

圖2 活性多肽GRGDS 對(duì)OGD 后PC12 細(xì)胞凋亡率的影響（n=3）

3.3 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量

正常對(duì)照組細(xì)胞上清液中TNF-α 的含量為（27.16±2.69）pg/ml，兩者相比，OGD 組細(xì)胞中的TNF-α 含量明顯增加（P<0.01），為（54.51±2.89）pg/ml；與OGD 比較，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理的細(xì)胞上清液TNF-α 的含量顯著降低，為（38.32±18）pg/ml（P<0.01，圖3A）。正常對(duì)照組細(xì)胞上清液IL-1β 的含量為（15.4±0.11）pg/ml，OGD組細(xì)胞上清液中IL-1β 的含量為（35.99±2.25）pg/ml，兩者相比，OGD 中的IL-1β 含量顯著增加（P<0.01）。與OGD 比較，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理的細(xì)胞上清液中IL-1β 的含量顯著降低，為（21.84±1.18）pg/ml（P<0.01，圖3B）。

圖3 活性多肽GRGDS 對(duì)OGD 后PC12 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的影響（n=3）

3.4 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細(xì)胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MAPKs 信號(hào)通路中的JNK 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖4 所示，PC12 細(xì)胞經(jīng)過(guò)氧糖剝奪損傷后，細(xì)胞中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組細(xì)胞相比均顯著升高（P<0.01）；而給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后，可明顯降低氧糖剝奪損傷后細(xì)胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達(dá)（P<0.01）。

圖4 活性多肽GRGDS 對(duì)OGD 后PC12 細(xì)胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

3.5 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細(xì)胞中加入JNK 抑制劑p-JNK、Bax 蛋白的表達(dá)

將原始濃度為10 mmol/ml 的JNK 抑制劑（SP600125）稀釋成10 μmol/ml 的濃度加入到PC12細(xì)胞中，缺糖缺氧后提取細(xì)胞蛋白分別檢測(cè)p-JNK 及其下游Bax 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5所示，OGD 組細(xì)胞中p-JNK、Bax 的蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組細(xì)胞相比都顯著增加（P<0.01）；給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度以及JNK 抑制劑處理后，p-JNK、Bax 蛋白的表達(dá)水平與OGD 組相比均明顯降低（P<0.01）。

圖5 活性多肽GRGDS 對(duì)OGD 的PC12 細(xì)胞加入JNK 抑制劑后p-JNK、Bax 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

4 討論

缺血性腦卒中是由血管阻塞引起的腦血液循環(huán)障礙誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，致死、致殘率較高，且病理機(jī)制十分復(fù)雜，目前醫(yī)學(xué)上仍缺乏行之有效的治療方法。在急性缺血的早期階段，細(xì)胞凋亡可能是對(duì)氧糖剝奪的一種自我保護(hù)反應(yīng)，有助于維護(hù)重要細(xì)胞的生存。然而，在局部缺血的大部分期間，鈣超載、氧自由液和溶酶體酶的釋放均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壞死[6]。

最新研究表明，活性多肽GRGDS 可激活體內(nèi)干細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng)和分化[7]。但是，活性多肽GRGDS 對(duì)于PC12 細(xì)胞凋亡引起的一系列炎癥反應(yīng)的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了活性多肽GRGDS 對(duì)氧糖剝奪損傷的PC12 細(xì)胞凋亡和凋亡反應(yīng)的抑制作用，并初步探討其可能存在的藥理和藥效機(jī)制。首先，建立氧糖剝奪損傷的PC12 細(xì)胞模型，同時(shí)加入不同給藥劑量濃度的活性多肽GRGDS 進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性多肽GRGDS 的不同給藥劑量濃度可有效抑制氧糖剝奪PC12 細(xì)胞的損傷，并且當(dāng)活性多肽GRGDS 的劑量濃度為0.01 μg/ml 時(shí)藥物作用效果最佳。故確定0.01 μg/ml 濃度作為機(jī)制探討劑量。

TNF-α 是一種促炎性多效細(xì)胞因子，研究表明，TNF-α 可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的機(jī)制阻止神經(jīng)元的死亡或凋亡，從而誘導(dǎo)Mn-SOD 和Bcl-2 的表達(dá)[8]。TNF-α 在大腦發(fā)育過(guò)程中起著效應(yīng)分子的作用，經(jīng)常參與不同的信號(hào)通路，激活巨噬細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)毒素的產(chǎn)生，并啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或死亡過(guò)程[9]。IL-1β 作為一種炎癥和免疫源性細(xì)胞因子，可在多個(gè)環(huán)節(jié)參與腦缺血損傷機(jī)制。研究表明，大量炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α）參與腦缺血再灌注損傷后腦細(xì)胞的凋亡和壞死[10]。因此檢測(cè)了氧糖剝奪損傷的PC12 細(xì)胞上清液，結(jié)果顯示，氧糖剝奪損傷后PC12 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-1β 含量顯著增加，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后，上清液中的TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)氧糖剝奪損傷后，PC12 細(xì)胞的凋亡率明顯增加，而給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后PC12 細(xì)胞的凋亡率顯著下降，這提示了活性多肽GRGDS 可能通過(guò)抑制PC12 的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究活性多肽GRGDS 是否通過(guò)抗凋亡作用發(fā)揮對(duì)PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)試著對(duì)凋亡信號(hào)通路中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 等相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。據(jù)報(bào)道，caspase 3 是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵部分，是其信號(hào)傳導(dǎo)的效應(yīng)通路。caspase 3 可能通過(guò)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和死亡受體三種途徑激活體內(nèi)細(xì)胞中的死亡信號(hào)。缺血性腦卒中一般會(huì)引起體內(nèi)線粒體細(xì)胞色素c 的釋放導(dǎo)致caspase 3 的表達(dá)、激活和裂解，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞死亡引起的凋亡過(guò)程中，cleaved caspase 3 的表達(dá)會(huì)增加[11]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 可以參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路誘導(dǎo)或減輕細(xì)胞凋亡，活化的JNK 會(huì)引起腦缺血應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞凋亡，而JNK 抑制劑在腦缺血再灌注損傷后提供神經(jīng)保護(hù)作用。Bcl-2 蛋白家族中的抗凋亡Bcl-2（Bcl-xL）和促凋亡Bax 蛋白之間的動(dòng)態(tài)平衡在決定腦缺血期間的細(xì)胞命運(yùn)中起關(guān)鍵作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Bcl-2（Bcl-xL）/Bax 比率的增加抑制Bax 易位至線粒體并保護(hù)神經(jīng)元免受細(xì)胞凋亡的損傷，而平衡向Bax 過(guò)量的轉(zhuǎn)變會(huì)引起缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，氧糖剝奪損傷后PC12細(xì)胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，綜合流式細(xì)胞儀檢測(cè)氧糖剝奪損傷后PC12 細(xì)胞凋亡的結(jié)果，表明活性多肽GRGDS可能通過(guò)抑制凋亡信號(hào)通路中的JNK/Bax 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制氧糖剝奪損傷的PC12 細(xì)胞凋亡反應(yīng)，最終發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml劑量濃度可以明顯抑制氧糖剝奪損傷的PC12 細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量，并通過(guò)調(diào)控JNK/Bax 信號(hào)通路蛋白的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。活性多肽GRGDS 可能在腦缺血中對(duì)PC12 細(xì)胞引起的損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究還需在動(dòng)物模型上進(jìn)行更深一層的體內(nèi)藥效試驗(yàn)解釋活性多肽GRGDS 對(duì)缺血性腦卒中的影響及其作用機(jī)制，為活性多肽GRGDS在臨床上用于缺血性腦卒中的藥物治療提供良好的藥理學(xué)基礎(chǔ)。