糙米結(jié)合酚的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及體外抗氧化活性

馮芝英，張名位，張瑞芬，劉磊，池建偉，董麗紅，賈栩超

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510610）

全谷物是指完整、碾成粉狀、碎塊狀或壓成片狀的谷物穎果，其胚乳、胚芽和糠麩的比例與在完整穎果中的比例基本相同[1]。流行病學(xué)研究表明，攝入全谷物食品具有預(yù)防多種慢性疾病的生理功效，如降低心血管疾病、肥胖癥、2型糖尿病和結(jié)腸癌等風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。

糙米是稻谷僅經(jīng)脫殼處理，保留米糠層和胚芽的大米，是一種典型的全谷物食品[4]。糙米中除含有豐富的膳食纖維外，還含有生育酚、生育三烯酚、植物甾醇、γ-谷維素和酚類物質(zhì)等活性成分，其中酚類物質(zhì)是糙米發(fā)揮健康效應(yīng)的重要活性物質(zhì)[5,6]。糙米中的酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)、可溶酯化態(tài)和不溶結(jié)合態(tài)三種形式存在[7]。蔬菜水果中只有24%的酚酸物質(zhì)以結(jié)合態(tài)形式存在，而在糙米中這一比例高達(dá)88%[8,9]。結(jié)合態(tài)酚由于其與膳食纖維共價(jià)結(jié)合，較難直接被釋放出來，絕大多數(shù)關(guān)于酚酸的研究都集中在游離形式上，不溶性酚類物質(zhì)常被忽視。相關(guān)研究已表明結(jié)合態(tài)酚具有很強(qiáng)的生物活性，包括抗氧化、益生菌、抗癌、抗炎、減肥、降糖等，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有一定的治療作用[10,11]。課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)膳食干預(yù)可激活骨骼肌中IRS1/AKT/GLUT4胰島素信號(hào)通路并改變腸道微生物群，從而導(dǎo)致糖尿病db/db小鼠的血糖水平降低[12]。然而關(guān)于糙米結(jié)合態(tài)酚化學(xué)組成的研究，目前主要采用高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜分析等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，已鑒定出的化合物包括阿魏酸、對(duì)香豆酸、香草酸、丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸等單體酚酸和8-8'阿魏酸脫氫二聚體（8-8' diferulic acid，DFA）、5-5' DFA、8-O-4' DFA、8-5' DFA、8-8'芥子酸二聚體以及索馬榆脂二酸等[13-15]。也有研究對(duì)米糠結(jié)合酚進(jìn)行分離純化并鑒定了10個(gè)化合物，化合物的結(jié)構(gòu)類型主要包括酚酸和甾醇類[16]。糙米中結(jié)合酚類物質(zhì)的化學(xué)組成仍有待進(jìn)一步研究探索。

本研究通過堿水解法提取全谷物糙米結(jié)合酚，采用多種柱層析色譜分離手段對(duì)糙米結(jié)合酚提取物進(jìn)行分離純化，并借助高分辨質(zhì)譜、核磁共振等波譜手段對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；以分離得到的單體化合物為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過高效液相色譜對(duì)米糠結(jié)合酚提取物中的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)和含量測(cè)定；并采用DPPH自由基清除法，F(xiàn)RAP和ORAC三種體外抗氧化方法來評(píng)價(jià)分離得到單體化合物的的抗氧化活性，研究結(jié)果將有助于明確糙米結(jié)合酚化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成，為糙米功效物質(zhì)闡明和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)的糙米購自黑龍江金都米業(yè)有限公司，新鮮的糙米經(jīng)粉碎、過80目篩，制得糙米粉，用塑料自封袋密封保存4 ℃冷庫儲(chǔ)藏備用。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)中所用試劑二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉等為天津江天化工有限公司生產(chǎn)，均為分析純；HPLC級(jí)甲醇、乙酸和乙腈購自上海安譜公司；氘代甲醇、二甲基亞砜為美國劍橋公司生產(chǎn)；沒食子酸為上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；Trolox試劑、熒光素，DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼），2,2'-偶氮（2-甲基丙脒）鹽酸鹽（AAPH）購自于美國Sigma公司。FRAP試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。柱層析硅膠（100～200目）為青島海洋化工廠生產(chǎn)；反相硅膠Develosil ODS（粒徑75 μm）為日本富士化學(xué)公司產(chǎn)品；凝膠Sephadex LH-20為瑞典Amersham Biosciences公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Waters515中壓純化系統(tǒng)（MPLC），美國沃特斯公司；DPE-1250旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化公司；Tecan GENios酶標(biāo)儀，瑞士Tecan有限公司；P3000半制備系統(tǒng)，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；LC2030 PLUS液相色譜儀，日本島津公司；Cosmosil 5-C18 MS-II（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，賽默飛世爾科技有限公司；YMC-Pack ODS-A（20×250 mm，5 μm）色譜柱，日本YMC股份有限公司；MDS SCIEX APCI 2000 LC-MS-MS，美國Applied Biosystem/MDS Sciex公司；BSZ-100自動(dòng)部份收集器，上海滬西分析儀器公司；BrukerAVANCE HD 500型超導(dǎo)核磁共振儀，德國布魯克公司；Bruker Bio TOF IIIQ MS，德國布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 全谷物糙米結(jié)合態(tài)酚粗提物提取

將110 kg糙米粉用95%乙醇浸泡（3次，每次48 h）去除游離酚，再通過堿解提取結(jié)合酚，即在去除游離態(tài)酚類物質(zhì)后的沉淀物中加入2 mol/L NaOH溶液（料液比1:40），充滿氮?dú)饷芊?，水浴振蕩提? h，所得提取液用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1，然后用乙酸乙酯（1:2）萃取5次，收集合并乙酸乙酯萃取相，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃條件下減壓濃縮，最終得結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)提取物52.1717 g。

1.2.2 全谷物糙米結(jié)合態(tài)酚粗提物的分離純化

52.1717 g粗提物經(jīng)正相硅膠柱層析分離，二氯甲烷/甲醇（10:0～6:4）梯度洗脫，收集流份，薄層色譜檢查，合并后得到組分F2～16。F2（16.1699 g）經(jīng)MPLC分離，流速10 mL/min，甲醇/水（4:6～10:0）梯度洗脫，流份經(jīng)薄層色譜檢查，合并為F2-1～14。F2-2（0.7811 g）經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析分離，甲醇洗脫，流份經(jīng)薄層色譜檢查，合并為F2-2-1～5，F(xiàn)2-2-4（25.9 mg）經(jīng)HPLC純化，甲醇/水（11:89）為流動(dòng)相，流速6 mL/min，得到化合物1（tR75 min，3.7 mg）和化合物4（tR92 min，4.2 mg）。F5-5（0.5892 g）經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離，甲醇洗脫，流份經(jīng)薄層色譜檢查，合并得F5-5-1～3，F(xiàn)5-5-3（85 mg）經(jīng)HPLC純化，甲醇/水（23:77）為流動(dòng)相，流速6 mL/min，得到化合物2（tR102 min，5.3 mg）。F6（7.8679 g）經(jīng)MPLC分離，流速10 mL/min，甲醇/水（2:8→10:0）梯度洗脫，流份經(jīng)薄層色譜檢查，合并為F6-1～8。F6-3（0.3925 g）經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離，甲醇洗脫，流份經(jīng)薄層色譜檢查，合并為F6-3-1～2，F(xiàn)6-3-2（14.8 mg）經(jīng)HPLC純化，甲醇/水（28:72）為流動(dòng)相，流速6 mL/min，得到化合物3（tR25 min，7.2 mg）。

1.2.3 高效液相色譜條件

Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)（配備DAD檢測(cè)器）和Zorbox SB-C18柱（250×4.6 mm內(nèi)徑，5 μm，USA）；柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，其進(jìn)樣體積為10 μL，流動(dòng)相包括溶劑A（0.1%乙酸，V/V）和溶劑B（甲醇），洗脫梯度為：溶劑B：0～20 min，10%～50%；檢測(cè)波長為280 nm。將每個(gè)單體化合物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別配置成6個(gè)不同濃度（100～3.125 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液（濃度為0.5 mg/mL）分別進(jìn)樣,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制4個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)峰面積外標(biāo)法定量。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考P?O-LEóN等[17]的方法并稍作修改，稱取4.00 mg DPPH溶解于100 mL 95%乙醇中，即為0.1 mmol/L的DPPH工作液。將4個(gè)單體化合物進(jìn)行梯度稀釋，得到不同濃度的樣品溶液。取50 μL不同濃度的樣品溶液與150 μL DPPH工作液充分混合，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長下測(cè)定吸光度A1，同時(shí)測(cè)定50 μL不同濃度的樣品溶液與150 μL 95%乙醇的吸光度A2和50 μL 95%乙醇與150 μL DPPH工作液的吸光度A0，以維生素C做陽性對(duì)照，每個(gè)樣品每個(gè)濃度重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率，同時(shí)求得清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度，即IC50值：

其中：A0為150 μL DPPH工作液+50 μL 95%乙醇的吸光度；A1為150 μL DPPH工作液+50 μL不同濃度的樣品溶液；A2為150 μL 95%乙醇+50 μL不同濃度的樣品溶液。

1.2.4.2 FRAP總抗氧化能力測(cè)定

參照董麗紅等[18]的方法，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入5 μL待測(cè)樣品溶液，空白孔加入5 μL蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔加入5 μL不同濃度的FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液，再向所有檢測(cè)孔中加入現(xiàn)配的FRAP工作液180 μL；混勻，37 ℃孵育5 min后，于593 nm波長下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的FRAP值。以Trolox為陽性對(duì)照，F(xiàn)RAP結(jié)果以每mol化合物中所含的FeSO4-7H2O當(dāng)量表示，即mmol FeSO4-7H2O/mol。

1.2.4.3 ORAC抗氧化能力測(cè)定

參考張名位等[19]的方法，先分別向空白孔加入20 μL 75 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液，其余孔分別加入20 μL樣品溶液、不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液（6.25～50 μmol/L）以及17.5 μmol/L的陽性對(duì)照沒食子酸溶液；孵育10 min后，向所有孔加入200 μL 0.96 μmol/L熒光素鈉工作液；繼續(xù)孵育20 min后，除對(duì)照孔外，每個(gè)孔加入20 μL 119 mmol/L AAPH溶液。最后將96孔板放入酶標(biāo)儀中，在激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm下測(cè)定各個(gè)孔的熒光值，每4.5 min一次，共循環(huán)35次。根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的ORAC值，ORAC值以每μmol樣品中所含的μmol Trolox當(dāng)量表示，即μmol TE/μmol。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 24進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)差異顯著性（p＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物結(jié)構(gòu)解析

運(yùn)用NMR、MS波譜學(xué)方法并結(jié)合文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)對(duì)照，鑒定出化合物1～4為生物堿類化合物，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1～4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1~4

化合物1：根據(jù)HR-ESI-MSm/z222.0757 [M+H]+（計(jì)算值222.0761）準(zhǔn)分子離子峰確定分子量為221，分子式為C11H11NO4，不飽和度為7。核磁共振氫譜（表1）顯示有1個(gè)芳環(huán)的ABX耦合信號(hào)δ6.76（1H，d，J=2.6 Hz, H-5）、6.73（1H，d，J=8.5 Hz，H-8）、6.67（1H，dd，J=8.5，2.6 Hz，H-7）；1個(gè)次甲基信號(hào)δ3.92（1H，dd，J=6.6，3.5 Hz，H-4），1個(gè)亞甲基信號(hào)δ2.80（1H，dd，J=16.4，3.5 Hz，H2-3a）和2.73（1H，dd，J=16.4，6.6 Hz，H2-3b），以及1個(gè)甲氧基信號(hào)δ3.68（3H，s，OCH3）。核磁共振碳譜顯示（表1）有6個(gè)芳環(huán)信號(hào)（δ154.6～116.5），1個(gè)亞甲基碳信號(hào)δ33.6（C-3），1個(gè)次甲基碳信號(hào)δ43.5（C-4），2個(gè)羰基碳信號(hào)δ173.8（C-11）、171.6（C-2）和1個(gè)甲氧基信號(hào)δ52.9，結(jié)合分子式中存在一個(gè)氮原子，推斷結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)2-喹諾酮母核[20]。根據(jù)氫氫相關(guān)譜（1H-1H COSY）和異核單量子相關(guān)譜（HSQC）譜將碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行歸屬（圖2）。在異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）譜中（圖1），H2-3與δ43.5（C-4）、122.9（C-10）、171.6（C-2）和173.8（C-11）相關(guān)，H2-4與δ33.6（C-3）、116.8（C-5）、122.9（C-10）、131.0（C-10）、171.6（C-2）和173.8（C-11）相關(guān)，OCH3與173.8（C-11）相關(guān)，基于上述信息，鑒定化合物1為6-羥基-2-氧代-1,2,3,4-四氫喹啉-4-羧酸甲酯，結(jié)構(gòu)如圖1所示，該化合物為1個(gè)新天然產(chǎn)物。

表1 化合物1～4的1H（500 MHz）和13C（125 MHz）NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H (500 MHz) and 13C (125 MHz) NMR data of compounds 1~4

圖2 化合物1的1H-1H COSY(粗線)、HMBC(箭頭)相關(guān)信號(hào)Fig.2 1H-1H COSY (bold lines) and HMBC correlations (arrows)correlations of compounds 1

化合物2：根據(jù)HR-ESI-MSm/z218.0463 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰確定分子量為219，分子式為C11H9NO4，不飽和度為8。分子式與化合物1相比，結(jié)構(gòu)中少了兩個(gè)氫原子。核磁共振氫譜和碳譜顯示化合物2中有1個(gè)1,3,4-三取代的苯環(huán)、1個(gè)雙鍵、兩個(gè)羰基和1個(gè)甲氧基，表現(xiàn)出了與化合物1類似的核磁共振信號(hào)，進(jìn)一步仔細(xì)比對(duì)兩個(gè)化合物的核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)（表1），化合物2中氮雜環(huán)的2,3位脫氫形成了雙鍵，化合物的分子式進(jìn)一步佐證這一推斷。與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，最終確定化合物2為4-羧甲氧基-6-羥基-2-喹諾酮，結(jié)構(gòu)如圖1所示。該化合物之前從黑米中分離報(bào)道，這是首次從糙米中分離報(bào)道該化合物。

化合物3：根據(jù)HR-ESI-MSm/z204.0303 [M-H]-和m/z205.0594 [M+H]+準(zhǔn)分子離子峰確定分子量為205，分子式為C10H7NO4，不飽和度為8。分子式與化合物2相比，結(jié)構(gòu)中少了一個(gè)CH2。核磁共振氫譜和碳譜顯示化合物3中同樣有1個(gè)1,3,4-三取代的苯環(huán)、1個(gè)雙鍵、兩個(gè)羰基，表現(xiàn)出了與化合物1類似的核磁共振信號(hào)（表1），不同之處是化合物3中少了一個(gè)甲氧基的信號(hào)，推測(cè)該化合物中11位是一個(gè)羧酸基團(tuán)，沒有發(fā)生甲酯化取代。通過異核單量子相關(guān)譜（HSQC）和異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）對(duì)化合物的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬。與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，最終確定化合物3為4-羧基-6-羥基-2-喹諾酮，結(jié)構(gòu)如圖1所示，這是首次報(bào)道該化合物在氘代二甲基亞砜中的核磁數(shù)據(jù)。

化合物4：根據(jù)HR-ESI-MSm/z220.0589 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰確定分子量為221，結(jié)合核磁共振氫譜和碳譜推斷該化合物的分子式為C11H11NO4，不飽和度為7。分子式與化合物1相同。核磁共振氫譜、碳譜結(jié)合異核單量子相關(guān)譜（HSQC）顯示化合物4中有1個(gè)1,3,4-三取代的苯環(huán)、1亞甲基、1個(gè)次甲基、2個(gè)羰基和1個(gè)甲氧基，表現(xiàn)出了與化合物1類似的核磁共振信號(hào)（表1），與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物4為2-(5-羥基-2-氧代吲哚-3-基)乙酸甲酯，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.1.2 化合物的波譜數(shù)據(jù)

生物堿類是自然界中廣泛存在的一大類活性天然產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)類型豐富多樣。本研究從全谷物糙米中分離得到的主要包括喹諾酮類（1-3）和吲哚類（4）?；衔?為新天然產(chǎn)物，未有相關(guān)研究報(bào)道其化學(xué)結(jié)構(gòu)和核磁數(shù)據(jù)。Chung等[20]從黑米的糊粉層提取物中分離得到了化合物3，這是首次從糙米中報(bào)告該化合物。前人從米糠提取物中分離報(bào)道過化合物2和4，并推斷這兩個(gè)化合物是植物內(nèi)源生長素3-吲哚乙酸的代謝產(chǎn)物[21]。4個(gè)化合物的波譜數(shù)據(jù)如表1所示。

2.2 單體化合物的定性定量分析

以分離得到的單體化合物1～4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過HPLC對(duì)糙米結(jié)合酚提取物中的主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)果如圖3所示，化合物1～4的保留時(shí)間分別為13.02，18.6，8.6，14.5 min。通過外標(biāo)法對(duì)4個(gè)化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明化合物1～4的含量分別為0.19，0.14，0.17，0.13 mg/g DW，其中新天然產(chǎn)物化合物1含量最高。

圖3 全谷物糙米結(jié)合態(tài)酚提取物的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatography of bound phenolics extract from whole grain brown rice

2.3 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH可從抗氧化物中吸取質(zhì)子失去發(fā)色基團(tuán)，其在517 nm波長處有較強(qiáng)的吸收，通過吸光度的變化反映樣品對(duì)自由基的清除能力，從而推測(cè)其抗氧化性[22]。IC50值是對(duì)自由基清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品有效劑量，IC50值越小，則自由基清除能力越強(qiáng)，抗氧化性越好。如表2所示，化合物4的IC50值最小，表明其DPPH自由基清除能力顯著高于其他3個(gè)化合物，但比陽性對(duì)照Vc弱；本研究中化合物2也表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性,這與Chung等報(bào)道的結(jié)果一致[20]。然而化合物1和3未表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性，IC50均大于1 mM。

表2 各單體化合物的DPPH自由基清除率IC50值Table 2 The IC50 value of DPPH free radical scavenging rate of compounds 1~4

2.3.2 FRAP總抗氧化能力

表3 各單體化合物的鐵離子還原能力Table 3 FRAP of compounds 1~4

采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）對(duì)分離得到的4個(gè)單體化合物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，結(jié)果表明化合物1～4具有一定的抗氧化活性，其中，化合物2的還原能力最強(qiáng)，還原能力高達(dá)249.60 mmol FeE/mol，與陽性對(duì)照Trolox相當(dāng)；其它3個(gè)化合物活性均弱于陽性對(duì)照（p＜0.05），4個(gè)單體的還原能力由大到小為：化合物2＞3＞4＞1。FRAP法重現(xiàn)性好，操作簡單且快速，測(cè)定的是樣品對(duì)高價(jià)態(tài)離子的還原能力，測(cè)定過程中不包含活性氧，因此，并不能完全反映打破自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或抗氧化劑阻斷的抗氧化能力[23]。

2.3.3 ORAC抗氧化能力

ORAC抗氧化屬于經(jīng)典的氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）機(jī)制，是目前國際上常用的一種評(píng)價(jià)食品抗氧化能力的方法，較一般的自由基清除法更準(zhǔn)確靈敏[24]。如表4所示，ORAC氧自由基吸收能力測(cè)定結(jié)果表明化合物2,3,4有較強(qiáng)的抗氧化能力，其活性均比陽性對(duì)照沒食子酸強(qiáng)（p＜0.05）。而化合物1 ORAC抗氧化能力最差（0.18±0.02 μmol TE/μmol），此結(jié)果與DPPH及FRAP結(jié)果一致，表明化合物1是4個(gè)化合物中抗氧化活性最差的。

表4 各單體化合物的ORAC值Table 4 ORAC value of compounds 1~4

對(duì)比3種體外抗氧化活性結(jié)果，DPPH自由基清除能力最好的是化合物4，其IC50值為72.19±3.45 μM；FRAP抗氧化能力最強(qiáng)的是化合物2，F(xiàn)RAP值為249.60±3.19 mmol FeE/mol；ORAC測(cè)定結(jié)果表明化合物3和4抗氧化能力最強(qiáng)。三種抗氧化方法的測(cè)定結(jié)果存在差異，其可能的原因是不同抗氧化方法所采用的自由基種類及測(cè)定原理不同。DPPH和FRAP法是基于電子轉(zhuǎn)移，涉及還原有色氧化劑，顏色變化的程度與樣品的抗氧化劑濃度相關(guān)；ORAC法基于氫原子轉(zhuǎn)移，涉及到抗氧化劑和底物競爭熱產(chǎn)生的過氧自由基。FRAP測(cè)定法與其他兩種方法不同，因?yàn)槠洳簧婕白杂苫?，而是將三價(jià)鐵（Fe3+）還原為二價(jià)鐵（Fe2+）的過程；ORAC方法中的自由基來源為AAPH, 可產(chǎn)生出的過氧化自由基是人體內(nèi)普遍存在的一種自由基，是目前國際上常用的一種評(píng)價(jià)食品抗氧化能力的方法[24,25]。因此，為了科學(xué)評(píng)價(jià)化合物的抗氧化活性，應(yīng)該至少采用兩種以上的抗氧化方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3 結(jié)論

通過多種柱層析手段結(jié)合波譜學(xué)方法共分離鑒定了4個(gè)化合物，分別為6-羥基-2-氧代-1,2,3,4-四氫喹啉-4-羧酸甲酯（1），4-羧甲氧基-6-羥基-2-喹諾酮（2），4-羧基-6-羥基-2-喹諾酮（3）和2-(5-羥基-2-氧代吲哚-3-基)乙酸甲酯（4），其中化合物1為新天然產(chǎn)物，化合物2為首次從糙米中分離報(bào)道。4個(gè)單體化合物中化合物1含量最高，為0.19 mg/g DW。分離得到的4個(gè)單體化合物均表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性。糙米結(jié)合酚提取物中除了已報(bào)道的酚酸類、黃酮類和甾醇類之外，還含有生物堿類活性物質(zhì)。