三氯生通過ERK/NF-κB/MMP-2/-9途徑促進卵巢癌細胞遷移和侵襲

張瑛瑜 徐宏仙 楊林峰 陳芳

(1三亞市中醫(yī)院婦產科，海南 三亞 572000；2中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院婦產科)

卵巢腫瘤是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，該病常在晚期被診斷，并有腹腔內轉移〔1〕，死亡率高達60%～65%〔2〕。當病變局限于卵巢時，5年生存率高于90%，但當病變在腹腔內播散時，生存率低于20%〔3〕。因此，明確該病發(fā)病機制，將為該病的診斷與治療提供極大幫助。內分泌干擾物(EDCs)是環(huán)境中天然或人工合成的制劑，可干擾體內激素正常功能，從而對內分泌系統(tǒng)產生干擾作用〔4〕。而人體內正常激素的循環(huán)水平可能與幾種生殖系統(tǒng)癌癥的風險密切相關。如雌激素水平異常與卵巢、乳腺及宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關〔5～7〕，這些腫瘤是高雌激素受體陽性或雌激素反應性腫瘤。因此，具有雌激素或雌激素活性的EDCs可能是發(fā)生雌激素反應性癌癥的重要危險因素。三氯生(TCS)是一種合成的氯化苯醚雙酚，用作廣譜抗菌劑〔8〕。TCS是肥皂、除臭劑、牙膏等衛(wèi)生產品的常見成分，使用濃度高達0.3%〔9〕。盡管TCS尚未被歸類為EDCs，但已被認為是一種潛在EDC〔10〕。既往有研究發(fā)現(xiàn)，TCS可通過雌激素受體依賴途徑調節(jié)卵巢癌細胞周期和凋亡相關基因的表達，從而刺激細胞生長〔11〕，然而TCS對卵巢癌細胞其他惡性生物學功能的影響尚未被闡明。本研究旨在分析TCS對卵巢癌細胞遷移和侵襲功能的作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 細胞培養(yǎng)卵巢癌細胞系A2780購自美國ATCC，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2CCK-8 檢測細胞活性以1×104個/孔的密度將A2780細胞接種于96孔板中，以不同濃度TCS(Sigma Aldrich，美國)(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)暴露細胞24 h，隨后向每孔加入10 μl CCK-8試劑(Dojindo，日本)，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后置于分光光度計中測定450 nm波長處的吸光度(OD)。細胞相對活性=(處理組OD450-背景組OD450)/(對照組OD450-背景組OD450)。每組設置4個復孔。

1.3細胞劃痕實驗 檢測細胞遷移能力以5×105/孔的密度將A2780細胞接種于6孔板中，待細胞融合至90%時，用20 μl移液管尖刮除細胞，用無血清DMEM沖洗細胞2次。分別將細胞暴露于含0、10-8、10-6mol/L TCS的無血清DMEM中再培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結束后對劃痕區(qū)域進行顯微鏡觀察和成像，使用Image J計算劃痕面積(Area)。細胞相對遷移活性(%)=(處理組Area 24 h-處理組Area 0 h)/(對照組Area 24 h-對照組Area 0 h)×100%。

1.4細胞侵襲實驗(Transwell) 測定細胞侵襲能力在Transwell(Corning，美國)小室上層涂抹40 μl的基質膠(Corning，美國)，制備2×105/孔的密度、不含血清的A2780細胞懸液，分別給予0、10-8、10-6mol/L TCS刺激，取200 μl滴加于Transwell上室中，下室加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定Transwell下層細胞，用0.1%結晶紫染色，后在顯微鏡下觀察計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。

1.5ERK信號通路驗證實驗 在對A2780細胞進行TCS暴露前，用50 μmol/L的ERK抑制劑PD98059預處理細胞24 h。

1.6Western印跡測定蛋白表達水平用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天，中國)中冰裂30 min，然后4℃ 15 000 r/min離心收集上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)進行蛋白定量，隨后取40 μg總蛋白100℃加熱10 min變性，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，后轉移到聚偏氟甲酸(PVDF)膜(Millipore，美國)上。用封閉液(碧云天，中國)室溫封閉PVDF膜2 h。然后在4℃將膜與以下主要抗體孵育過夜：p-ERK、ERK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及GAPDH(以上抗體均購自Cell signaling technology，美國)。以GAPDH作為內參蛋白。孵育后用TBST清洗膜3次，后在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)結合的二抗孵育PVDF膜1 h。使用增強化學發(fā)光檢測試劑盒(碧云天，中國)對蛋白熒光信號進行顯像。

1.7統(tǒng)計學分析 使用Graphpad Prism軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1TCS對卵巢癌細胞活性的影響 不同濃度TCS(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)暴露24 h對A2780細胞活性(1.00±0.04、1.07±0.05、1.02±0.04、1.04±0.08、1.03±0.10、1.01±0.06)無明顯影響(P>0.05)。從中選擇了10-8和10-6mol/L TCS暴露濃度進行后續(xù)實驗。

2.2TCS對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響 與(TCS 0 mol/L)相比，TCS暴露顯著促進A2780細胞發(fā)生遷移(均P<0.05)，且TCS 10-8mol/L的促進作用較10-6mol/L更為明顯(P<0.05)。侵襲實驗的結果與劃痕實驗一致(均P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1 TCS對卵巢癌細胞遷移的影響(×40)

圖2 TCS對卵巢癌細胞侵襲的影響(結晶紫染色，×100)

2.3TCS誘導卵巢癌細胞表達MMP-2/-9增加 TCS處理可顯著提高MMP-2和MMP-9的蛋白水平(均P<0.05)，且10-8mol/L處理組的促進效果更為明顯(均P<0.05)。見圖3。

圖3 TCS誘導卵巢癌細胞表達MMP-2及 MMP-9增加

2.4TCS通過誘導ERK磷酸化而促進NF-κB活化 TCS處理可顯著促進ERK和NF-κB蛋白發(fā)生磷酸化(均P<0.05)。為進一步驗證TCS對ERK/NF-κB信號通路的激活作用，使用ERK/NF-κB抑制劑PD98059預處理A2780細胞，而后暴露于TCS，前者特異性地阻斷ERK/NF-κB磷酸化。見圖4。

圖4 TCS通過誘導ERK磷酸化而促進NF-κB活化

3 討 論

近幾十年來，EDCs及其對腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響越來越受到重視〔12〕。盡管已有研究表明TCS可促進乳腺癌細胞〔13〕和肺癌細胞〔14〕的遷移和侵襲。在卵巢癌中，僅有報道證實TCS可促進卵巢癌細胞增殖，但尚無關于TCS暴露與卵巢癌細胞遷移和信息能力的研究。本研究發(fā)現(xiàn)TCS幾乎不影響卵巢癌細胞活性，但顯著增強卵巢癌細胞A2780的遷移和侵襲，這與之前在其他癌細胞系的研究一致。因此，本研究結果提示TCS可能也是一種促進卵巢癌進展的致癌物質。

關于TCS誘導卵巢癌細胞遷移和侵襲的潛在機制研究，首先發(fā)現(xiàn)了TCS可促進MMP-2/-9的表達增加。MMP-2/-9是MMPs家族的重要成員，鑒于其具有降解細胞外基質的作用，MMP-2/-9的高表達被證明與卵巢癌的高轉移潛能有關〔15〕。MMP-2/-9在TCS暴露后的表達在其他癌細胞中也有上調，例如乳腺癌細胞〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)TCS誘導卵巢癌細胞MMP-2/-9表達增加可能有助于癌細胞遷移和侵襲。

已有研究證實在多種癌細胞中ERK/NF-κB信號通路的激活對于調節(jié)MMP-2/-9的活性非常重要〔16〕。本研究結果表明MMP-2/-9的激活趨勢與ERK/NF-κB途徑的激活趨勢一致。既往有研究發(fā)現(xiàn)TCS可通過ERK/NF-κB信號途徑發(fā)揮作用。如Cheng等〔17〕發(fā)現(xiàn)TCS可特異性活化ERK干擾小鼠胚胎干細胞成骨分化；Kim等〔18〕證實TCS可通過活化ERK途徑乳腺癌細胞增殖。本研究結果提示TCS確實通過ERK/NF-κB通路發(fā)揮作用。

綜上，TCS暴露可能通過激活ERK/NF-κB信號通路而促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲，提示TCS作為潛在的EDC，有可能加速卵巢癌的進展，并對人類健康構成威脅，有必要加以重視。