人胎盤間充質(zhì)干細胞對急性肺損傷患者炎癥反應(yīng)的影響

高秋珍 朱鳳蓮 張建新

(1許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 許昌 461000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)院)

急性肺損傷(ALI)是一種臨床常見且病死率高的危重病癥，是由直接或間接原因造成肺上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，肺毛細血管通透性增強，導(dǎo)致急性缺氧性呼吸衰竭，肺內(nèi)抗炎與促炎因子比例失調(diào)〔1〕。其臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、痰中帶血，部分患者伴有呼吸困難或胸痛，ALI發(fā)展至嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征。該疾病臨床治療困難，尚無標準化的治療方法，現(xiàn)有的臨床治療方案尚不能取得令人滿意的效果。ALI發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在ALI發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要作用〔2〕。因此，探尋新的有效可行的治療手段成為科研工作者和臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的前體細胞，具有自我更新和免疫調(diào)節(jié)作用〔3〕。該細胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，后來在臍帶血、胚胎、脂肪、肝臟、牙周等細胞中均有發(fā)現(xiàn)，幾乎涵蓋了人體的所有器官與組織，具有取材方便、容易分離培養(yǎng)增殖的特點，因而在創(chuàng)傷修復(fù)、免疫治療及組織功能重建等領(lǐng)域應(yīng)用前景極為廣闊〔4〕。既往研究〔5〕實驗結(jié)果表明MSCs對眾多免疫細胞具有調(diào)節(jié)作用，它通過分泌趨化因子和細胞因子發(fā)揮作用。有研究表明，MSCs對炎癥性疾病的治療起著重要作用〔6〕，可減輕ALI患者肺部炎癥并增強肺泡液體清除能力，對肺部疾病有治療作用，MSCs已成為ALI的一種有前景的治療方法。但目前關(guān)于應(yīng)用人胎盤間充質(zhì)干細胞(hPMSCs)治療ALI的研究較少，因此，本實驗通過研究hPMSCs對ALI患者的免疫調(diào)節(jié)作用，為hPMSCs應(yīng)用于治療ALI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人胎盤組織取自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)院產(chǎn)科臨床足月剖宮產(chǎn)胎盤，產(chǎn)婦及家屬均知情同意并簽署知情同意書。本項研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS，鄭州九龍生物制品有限公司)；HBSS、DEEM和磷酸鹽緩沖液(PBS,Gibco公司)；無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(PBS-CMF)；DNA酶Ⅰ(Roche公司)；A型膠原酶(北京盛科博源生物科技有限公司)；CD14-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD73-PE、CD105-PE鼠抗人單克隆抗體 IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD8-PE、CD4-FITC及儀器流式細胞儀(BD公司產(chǎn)品)，白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司)，胰蛋白酶和絲裂霉素C〔今品化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司〕，倒置顯微鏡(Olympus公司)，電子天平(PB303-E型，梅德勒公司)，全自動高壓鍋，CO2培養(yǎng)箱，移液槍，大中小槍頭，10 cm細胞培養(yǎng)皿，96孔板細胞培養(yǎng)皿，24孔板細胞培養(yǎng)皿。

1.3實驗方法

1.3.1hPMSCs的分離與培養(yǎng) 將獲取的胎盤無菌轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)實驗室內(nèi)，用PBS漂洗3～4次后，將組織剪成0.5 cm厚的組織，然后用眼科剪將組織塊剪成1 mm3的碎塊，用PBS緩沖液洗滌3～4次，加入1 μg/ml DNA酶Ⅰ、0.1%A型膠原酶，在37℃恒溫水浴鍋中消化2 h。收集上清液，用100目細胞篩網(wǎng)篩除殘留的大塊組織，540 r/min離心5 s，收集上清液。加入100 ml/L的培養(yǎng)基懸重沉淀，接種于細胞培養(yǎng)皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。48 h換液，換液時用PBS多洗幾次，并于第2天開始密切關(guān)注細胞生長，待細胞生長密度為85%～90%時進行傳代培養(yǎng)，取3代hPMSCs細胞用于實驗。

1.3.2hPMSCs特異性抗原鑒定 選取第3代處于對數(shù)生長期的hPMSCs細胞，用0.25%胰蛋白酶液消化5 min后將細胞漂洗3次，接著用300目濾膜過濾。調(diào)整細胞數(shù)至1×107/ml并分裝，每支流式細胞管加入0.1 ml細胞，然后加入CD45、CD14、CD90、CD34、CD105、CD73及HLA-DR-FITC等流式抗體，靜置15 min后PBS重懸，加入PBS制成細胞懸液，最后進行流式細胞儀檢測。

1.3.3hPMSCs與ALI患者外周血單個核細胞(PBMNCs)共培養(yǎng) 將hPMSCs置于37℃恒溫水浴鍋中，加25 mg/L絲裂霉素C預(yù)處理30 min。調(diào)整細胞濃度，將hPMSCs以1×105個/孔接種于24孔板。抽取ALI患者晨起空腹靜脈血，采用Ficoll密度梯度離心法分離，得到PBMNCs。用RPMI1640培養(yǎng)液將其洗滌3次后，將PBMNCs以1×106個/孔接種到上述24孔板中，并加入10 μg/ml植物凝集素(PHA)，分為4組：PBMNCs組，PBMNCs+PHA組，hPMSCs+PBMNCs組，hPMSCs+PBMNCs+PHA組，每組3個重復(fù)樣本；置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。

1.3.4MTT法檢測hPMSCs+PBMNCs細胞增殖 將hPMSCs+PBMNCs細胞以1×104/孔接種于96孔板，分為4組：空白組(等量培養(yǎng)液)，PBMNCs組，PBMNCs+PHA組，hPMSCs+PBMNCs+PHA組，每組3個復(fù)孔，37℃恒溫培養(yǎng)72 h后，各孔加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄凈上清液，每孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分溶解后，測定490 nm波長處各孔的吸光度(A)值。

1.3.5ELISA檢測hPMSCs+PBMNCs細胞IL-10、IFN-γ水平1.3.2中hPMSCs+PBMNCs細胞共培養(yǎng)72 h后，用ELISA法檢測IL-10、干擾素(IFN)-γ水平，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3.6流式細胞術(shù)檢測hPMSCs+PBMNCs細胞淋巴細胞亞群1.3.2中hPMSCs+PBMNCs細胞共培養(yǎng)72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，PBS-CMF漂洗3次，取100 μl(1×107/ml)分裝，然后加入單克隆抗體IgG1-PE、IgG2a-FITC、CD4-FITC、CD8-PE，避光靜置20 min，PBS漂洗3次，最后進行流式細胞儀檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1hPMSCs的形態(tài)學(xué)特征 hPMSCs在換液后貼壁生長，接種48 h換液后只有少量細胞貼壁，3 d呈分散細胞克隆，7～10 d細胞克隆大量繁殖，細胞直徑增大，細胞胞質(zhì)透明、核質(zhì)比大、呈渦旋狀生長。取第3代(P3)hPMSCs于倒置顯微鏡下觀察(圖1)，細胞形態(tài)均為長梭形，渦旋式生長，與成纖維細胞外觀相似。上述特征符合MSCs典型細胞形態(tài)。

圖1 hPMSCs的形態(tài)學(xué)特征(×300)

2.2hPMSCs特異性抗原鑒定 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hPMSCs細胞表達CD73、CD90、CD105，不表達CD14、CD34、CD45和HLA-DR，具有典型MSCs表面標志。見圖2。

圖2 hPMSCs表面標志檢測結(jié)果

2.3hPMSCs對患者PBMNCs增殖的影響 在倒置顯微鏡下，經(jīng)PHA活化的PBMNCs細胞T細胞克隆性繁殖，成簇生長?？瞻捉MOD值0.07、PBMNCs組OD值0.60、PBMNCs+PHA組OD值1.26、PBMNCs+PHA+hPMSCs組OD值0.68。PBMNCs+PHA+hPMSCs組與PBMNCs+PHA組比較，PBMNCs細胞增殖水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4對患者PBMNCs細胞IL-10、IFN-γ的影響 PBMNCs+PHA+hPMSCs組細胞因子IL-10水平顯著高于PBMNCs+PHA組，細胞因子IFN-γ水平顯著低于PBMNCs+PHA組(均P<0.05)。見表1。

表1 hPMSCs對患者PBMNCs細胞IL-10、IFN-γ的 影響

2.5對患者PBMNCs細胞T細胞亞群的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與hPMSCs細胞共培養(yǎng)后，PBMNCs+hPMSCs組CD4+、CD8+T細胞水平明顯降低，顯著低于PBMNCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 hPMSCs對患者PBMNCs細胞T細胞亞群的 影響

3 討 論

近年來，干細胞研究與臨床應(yīng)用發(fā)展迅速，受到廣泛關(guān)注。多數(shù)發(fā)達國家在生命科學(xué)與干細胞的臨床研究中投入巨大，并取得突破性進展。研究表明〔7，8〕，不同種類不同來源的干細胞具有不同的生物學(xué)特性，可誘導(dǎo)性不同，可分化為合適的細胞，分泌各種生長因子和細胞因子，對受損區(qū)域進行修復(fù)。

MSCs來源廣泛，幾乎存在于人體所有組織與器官，比較容易獲得。而且，MSCs具有自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)功能及抗炎等特點〔9，10〕，在臨床治療ALI這類目前尚無有效治療手段的疾病方面有巨大潛能。有研究發(fā)現(xiàn)〔11～13〕，MSCs可向受損、炎癥及腫瘤組織等部位遷移，通過分泌諸多因子(趨化因子、免疫抑制因子、細胞外基質(zhì)蛋白等)，作用于活化的免疫細胞，修復(fù)損傷部位，抑制炎癥反應(yīng)，參與ALI等疾病的治療。hPMSCs相對于其他來源的MSCs，不僅取材容易而且對人體沒有傷害，不涉及道德倫理與法律問題，是理想的干細胞治療來源。

本研究結(jié)果表明hPMSC培養(yǎng)分離成功。Zheng等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞和肺部炎癥因子對肺部微血管內(nèi)皮可造成破壞作用，進而使得內(nèi)皮通透性增加，MSCs可改善炎癥因子對肺微血管內(nèi)皮的破壞。吳海青等〔15〕用MSC處理ALI小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠炎癥反應(yīng)程度降低，且MSCs移植對大鼠無明顯毒副作用。本研究表明hPMSCs可在一定程度上降低ALI患者的炎癥反應(yīng)，抑制T細胞的免疫反應(yīng)。hPMSCs作為ALI臨床治療策略還有很長的路要走，最終能否成功可能取決于對hPMSCs作用機制的更多了解。