大氣顆粒物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的區(qū)域差異性研究*

張 波, 馬曼曼, 孫宇航, 馮文榮, 米鐵柱, 甄 毓**

(1. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266100；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237；3. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100)

生物氣溶膠是直接從生物圈釋放到大氣中的大氣粒子的一個(gè)子集，其粒子直徑范圍從納米到約十分之一毫米之間[1]。生物氣溶膠是大氣氣溶膠的重要組成部分。Huffman等[2]對(duì)亞馬遜雨林中的生物氣溶膠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，生物氣溶膠粒子數(shù)占大氣顆粒物數(shù)的30%～80%。生物氣溶膠還包括許多不同來(lái)源的生物顆粒或大分子，例如病毒、細(xì)菌、真菌、花粉、細(xì)胞碎片和生物膜等[3]。通過(guò)空氣傳播的生物氣溶膠可以引起人類(lèi)疾病[4-5]，也在大氣化學(xué)和成核過(guò)程中起著重要作用，例如有機(jī)物的生物轉(zhuǎn)化、碳循環(huán)、光化學(xué)反應(yīng)和云形成等過(guò)程，從而可能影響氣候和環(huán)境[1,6]，目前已有不少研究集中于通過(guò)分析生物氣溶膠中微生物群落組成和結(jié)構(gòu)[7]，了解其對(duì)全球氣候和環(huán)境變化以及人類(lèi)健康等方面的影響。高通量測(cè)序技術(shù)能夠在基因水平上較為全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征，因而被廣泛應(yīng)用在大氣微生物研究中[8-9]。

近年來(lái)針對(duì)大氣中微生物的研究越來(lái)越多，研究發(fā)現(xiàn)，大氣中可能存在幾種常見(jiàn)細(xì)菌組成的微生物背景[10]，且這些細(xì)菌在大氣環(huán)境中普遍存在，但隨著空間、時(shí)間和大氣顆粒物粒徑等的變化，大氣中優(yōu)勢(shì)菌的組成及占比會(huì)發(fā)生改變[8]，并且這些因素可能會(huì)影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。例如，Despres等[11]發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域(鄉(xiāng)村、城市、沿海、海平面和高山等)空氣中細(xì)菌群落的多樣性和細(xì)菌種類(lèi)的組成存在一定的差異；武麗婧[12]對(duì)比了青島和黃海氣溶膠中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)陸地生物氣溶膠中微生物群落的豐富度高于海洋。除了區(qū)域的變化可能會(huì)對(duì)大氣中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響外，時(shí)間或季節(jié)的變化也可能產(chǎn)生影響。例如，在米蘭的較冷季節(jié)，Burkholderiales和Actinomycetales的相對(duì)豐度更高，而Chloroplasts是溫暖季節(jié)下大氣細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌[13]；Du等[14]研究發(fā)現(xiàn)，北京春季樣品中的微生物群落的豐富度高于其他季節(jié)。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，不同粒徑的大氣顆粒物上的微生物對(duì)環(huán)境的耐受能力不同[15]，可能導(dǎo)致生物氣溶膠中不同粒徑的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Lu等[16]發(fā)現(xiàn)西安市生物氣溶膠中TSP(Total Suspended Particulate)的細(xì)菌群落豐富度和多樣性高于PM2.5和PM10；Bowers等[17]分析發(fā)現(xiàn)美國(guó)科羅拉多州大氣中粗顆粒(PM10～2.5)細(xì)菌群落的豐富度高于細(xì)顆粒(PM2.5)，且假單胞菌和梭菌的相對(duì)豐度的差異是導(dǎo)致粗、細(xì)顆粒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所差異的主要原因。已有研究顯示，沿海、內(nèi)陸以及海洋等區(qū)域的生物氣溶膠中微生物群落結(jié)構(gòu)和種類(lèi)存在差異，以及不同粒徑范圍內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)特征也存在一定的差異[18-20]，但區(qū)域和大氣顆粒物粒徑的差異對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制尚不明確。除此之外，相對(duì)濕度、溫度、風(fēng)向、風(fēng)速和氣態(tài)污染物(O3、SO2、NO2和CO等)等環(huán)境因素對(duì)大氣微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)也可能產(chǎn)生不同程度的影響[21-22]，但因研究區(qū)域以及天氣條件不同，環(huán)境因子對(duì)于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步分析。

青島瀕臨黃海，該地氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可能受海洋和陸地源的共同影響[23-25]。蘭州地處西北內(nèi)陸地區(qū)，受亞洲沙塵的影響在春季容易發(fā)生沙塵暴[26-27]。此外，亞洲沙塵還可以經(jīng)內(nèi)蒙古西部和黃土高原后輸入黃渤海，蘭州和青島均位于該傳輸路徑上[26,28]。海洋微表層是微生物從水體進(jìn)入大氣的主要來(lái)源，海洋氣溶膠可以通過(guò)海-氣界面并且能在大氣中進(jìn)行長(zhǎng)距離傳輸[29]。因此，本研究分別在青島、蘭州和黃海設(shè)置采樣點(diǎn)，對(duì)不同地點(diǎn)和不同采樣時(shí)間的大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征以及不同環(huán)境因子對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行比較分析，了解海洋、沿海和內(nèi)陸大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的異同。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 海上樣品采集 2014年3月18日，作者搭乘“東方紅2”于黃海(33°44.040′N(xiāo)—33°19.394′N(xiāo)，124°43.232′E—125°21.874′E)采集生物氣溶膠樣品。為防止污染，只在船航行期間采集，停船時(shí)將采樣器關(guān)閉。

采用FA-1篩孔撞擊式空氣微生物采樣器(遼陽(yáng)康潔儀器研究所)采集樣品，采樣器流量為28.3 L/min，采樣時(shí)長(zhǎng)為1 h。采樣膜為0.22 μm的聚碳酸酯膜(北京升河誠(chéng)信膜科技發(fā)展有限公司)。在采集樣品前，對(duì)需要用到的實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行高壓滅菌，防止受到污染。然后在超凈臺(tái)中將烘干后的濾膜放入用酒精滅菌后的采樣器中。完成采樣后，在超凈臺(tái)內(nèi)用鋁箔將采樣膜包好，并放入-20 ℃冰箱保存，以待后續(xù)分析。

1.1.2 陸地樣品采集 采樣點(diǎn)位于蘭州市西北師范大學(xué)生科樓樓頂(36°07′N(xiāo)，103°43′E)和青島市中國(guó)海洋大學(xué)嶗山區(qū)教學(xué)樓六區(qū)天臺(tái)(36°09′N(xiāo)，120°29′E)。兩個(gè)采樣點(diǎn)周?chē)鶡o(wú)明顯的污染源，受人類(lèi)活動(dòng)影響較小。青島的采樣時(shí)間為2015年1月7日、3月25日和8月16日，蘭州的采樣時(shí)間為2015年3月24和27日。同樣使用FA-1篩孔撞擊式空氣微生物采樣器采集樣品，采樣器流量為28.3 L/min，采樣時(shí)長(zhǎng)為30 min，采樣膜為0.22 μm的聚碳酸酯膜，生物氣溶膠樣品采樣前的準(zhǔn)備工作同上述海上樣品采集。在采樣期間，記錄各采樣點(diǎn)的氣象條件(見(jiàn)表1)。

FA-1篩孔撞擊式空氣微生物采樣器采用慣性撞擊原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，它分為六級(jí)且每級(jí)對(duì)生物氣溶膠的捕集范圍分別為0.65～1.1 μm、1.1～2.1 μm、2.1～3.3 μm、3.3～4.7 μm、4.7～7.0 μm和大于7.0 μm，隨著采樣器每級(jí)篩孔直徑的縮小，其空氣流速逐漸增大(最大可達(dá)23.14 m/s)，從而把氣溶膠樣品分粒徑采集到采樣膜上[12]。根據(jù)采樣器對(duì)粒徑分割的限制和氣溶膠粗細(xì)粒子粒徑范圍的劃分[30]，本文用f表示細(xì)粒徑(小于2.1 μm)，c表示粗粒徑(大于2.1 μm)，分別將黃海(YS)、青島(QD0107、QD0325和QD0816)和蘭州(LZ0324和LZ0327)的樣品分為粗細(xì)粒徑兩組(見(jiàn)表1)。

表1 2014—2015年黃海、青島和蘭州生物氣溶膠采樣期間氣象資料

1.2 樣品處理

1.2.1 細(xì)菌總DNA提取與檢測(cè) 在超凈臺(tái)內(nèi)，將采樣膜剪碎放入2 mL離心管中，利用(QIAamp DNA Mini Kit)試劑盒進(jìn)行DNA提取。對(duì)提取的總DNA利用細(xì)菌16S rDNA引物341F(5 ′-CCTACGGGRSGCAGCAG)和806R(5 ′-GGACTACCAGGGTATCTAAT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠下進(jìn)行電泳檢測(cè)[12]，將合格的DNA樣本送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 高通量測(cè)序 將提取的DNA樣品作為PCR反應(yīng)模板，擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。其中，PCR反應(yīng)正反引物分別是341F和806R，擴(kuò)增后得到約466 bp的擴(kuò)增片段，檢測(cè)合格后加測(cè)序接頭并通過(guò)HiSeq2×250測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 質(zhì)量控制 通過(guò)Pandaseq[31]軟件(version 2.9)將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)的Reads拼接成一條序列，可以得到高變區(qū)的原始序列，然后將拼接的序列進(jìn)行質(zhì)量控制(將平均質(zhì)量低于20和3個(gè)以上含N堿基的序列去除)得到有效序列，進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

1.3.2 OTU聚類(lèi) 將有效序列中的Singletons過(guò)濾，利用Uparse[32]軟件(version 7.0.100 1, http://drive5.com/uparse/)在97%的相似度下對(duì)非重復(fù)序列的操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)進(jìn)行聚類(lèi)。在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到的OTU可以用于物種分類(lèi)。然后，從各個(gè)樣品的OTUs中選出豐度最高的一條序列作為代表序列，與已知物種的16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)(GreenGenes[33], http://greengenes.l bl.gov)進(jìn)行比對(duì)，從而進(jìn)行物種注釋。最后，根據(jù)對(duì)每個(gè)OTU序列的條數(shù)得到的OTU分類(lèi)表，并分析物種豐度和熱圖。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)QIIME[34]軟件(version 1.9.0)計(jì)算樣品的Alpha多樣性指數(shù)。使用R軟件中VeenDiagram程序包繪制韋恩圖(Veen圖)，并繪制稀釋曲線(xiàn)，分析不同樣品OTU組成的相似性；用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)圖和聚類(lèi)熱圖，來(lái)反映樣品間是否存在細(xì)菌群落差異。

1.3.4 環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落影響分析 利用Canoco 5軟件進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)，找到可能對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響的環(huán)境因子，以顯示環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響，并通過(guò)蒙特卡洛檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.3.5 后向軌跡分析 利用拉格朗日混合單粒子軌道模型(Hybrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory, HYSPLIT)[35]分別對(duì)黃海、青島和蘭州的3個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行后向軌跡分析，根據(jù)GDAS1氣象數(shù)據(jù)集和基于垂直速度垂直運(yùn)動(dòng)法的模型，由于500 m的高度可以準(zhǔn)確反映大氣邊界層平均流場(chǎng)的特征[36]，將其作為該模型起始高度，計(jì)算在此高度下后推72 h的后向軌跡。

2 結(jié)果

2.1 大氣細(xì)菌群落多樣性分析

結(jié)6組(共12個(gè))粗細(xì)粒徑樣品測(cè)序，共得到1 013 295條有效序列，對(duì)所有樣品的序列經(jīng)均一化處理后，在97%的相似度水平下聚類(lèi)，6組樣品共獲得5 708個(gè)OTUs，且每組樣品OTU數(shù)介于639與2 079之間。

3月青島QD0324和蘭州LZ0324和LZ0327共有856個(gè)OTUs，約占總OTU數(shù)的15.00%，但與黃海均沒(méi)有共有OTU(見(jiàn)圖1(a))，表明黃海和陸地(青島和蘭州)樣品氣溶膠中細(xì)菌種類(lèi)明顯不同。青島不同采樣時(shí)間的生物氣溶膠樣品中只有1個(gè)共有OTU，且1和8月樣品共有332個(gè)OTUs，說(shuō)明這2個(gè)月份的青島生物氣溶膠中細(xì)菌種類(lèi)差異較小。

((a)3月黃海、青島和蘭州；(b)青島不同采樣時(shí)間。(a) The Yellow Sea, Qingdao and Lanzhou in March; (b) Different sampling time in Qingdao.)圖1 2014—2015年黃海、青島和蘭州生物氣溶膠OTUs韋恩圖

在所有樣品中(見(jiàn)圖2(a))，蘭州樣品LZ0327c氣溶膠的OTU數(shù)目最多，有1 625個(gè)，青島樣品Q(chēng)D0816f氣溶膠的OTUs最少，為333個(gè)； 黃海樣品中粗細(xì)粒徑OTU個(gè)數(shù)的差值最低(p<0.05)；而LZ0327氣溶膠樣品中粗細(xì)粒徑OTU個(gè)數(shù)的差值大于LZ0234樣品(p<0.05)，說(shuō)明LZ0327比LZ0324樣品氣溶膠中粗細(xì)粒徑OTU的相似性低。在青島3個(gè)采樣時(shí)間的樣品中，QD0325氣溶膠中粗細(xì)粒徑OTUs相差最大，其次是QD0816樣品，最小是QD0107樣品(p<0.05)。

黃海、青島和蘭州粗細(xì)粒徑樣品的Goods_coverage指數(shù)均大于98%，表明此時(shí)的測(cè)序深度已經(jīng)基本涵蓋細(xì)菌類(lèi)群的信息，結(jié)果能夠呈現(xiàn)出樣本真實(shí)情況。Chao 1值表示細(xì)菌群落的豐富度，即Chao 1值越大細(xì)菌群落越豐富。由圖2(b)可知，蘭州樣品LZ0327c氣溶膠中細(xì)菌群落豐富度最高，而青島樣品Q(chēng)D0816f氣溶膠中細(xì)菌群落豐富度最低(p<0.01)；各個(gè)樣品的粗細(xì)粒徑氣溶膠中，QD0325生物氣溶膠樣品中粗粒徑細(xì)菌群落豐富度低于細(xì)粒徑，其余則相反；LZ0327粗細(xì)粒徑樣品的細(xì)菌群落豐富度差異最大，黃海粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落豐富度差異則最小(p>0.05)。Shannon和Simpson指數(shù)均可以衡量細(xì)菌群落多樣性。其中，黃海粗粒徑細(xì)菌群落多樣性最高，青島樣品Q(chēng)D0816f細(xì)菌群落多樣性最低(p<0.01)，且QD0816樣品粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落多樣性差異相對(duì)較大(p<0.05)(見(jiàn)圖2(c)和圖2(d))。

圖2 2014—2015年黃海、青島和蘭州生物氣溶膠中粗粒徑和細(xì)粒徑上OTU數(shù)(a)、細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Chao 1指數(shù)(b)、Shannon指數(shù)(c)及Simpson指數(shù)(d)

2.2 大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析

根據(jù)屬分類(lèi)水平上相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析可知(見(jiàn)圖3)，3月27日蘭州樣品粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，說(shuō)明該樣品粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較低，但其他樣品粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較小。從整體上看，黃海與其他陸地樣品氣溶膠的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異明顯，說(shuō)明黃海和陸地樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性較低。ANOSIM檢驗(yàn)表明，組間差異顯著大于組內(nèi)差異(R=0.822，p<0.01)，即黃海、青島和蘭州以及青島不同采樣時(shí)間的生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異顯著大于同一氣溶膠樣品中粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。

圖3 2014—2015年黃海、青島和蘭州生物氣溶膠中粗粒徑和細(xì)粒徑樣品主成分分析

對(duì)物種數(shù)據(jù)(OTUs)進(jìn)行聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖4)，結(jié)果顯示3月的青島和蘭州樣品聚為一支，說(shuō)明同一時(shí)期陸地生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較?。坏?月黃海與陸地(青島和蘭州)樣品聚類(lèi)距離較長(zhǎng)，表明黃海樣品與陸地樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。青島不同采樣時(shí)間的樣品中，1和8月樣品的聚為一支，說(shuō)明青島冬季和夏季生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高。

圖4 2014—2015年黃海、青島和蘭州生物氣溶膠樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基于Bray-curtis距離的聚類(lèi)分析

2.3 大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

在門(mén)分類(lèi)水平上(見(jiàn)圖5(a))，變形菌(Proteobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、放線(xiàn)菌(Actinobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)為黃海、青島和這3個(gè)采樣點(diǎn)氣溶膠樣品的優(yōu)勢(shì)菌，它們?cè)邳S海、蘭州和青島粗細(xì)粒徑氣溶膠中的相對(duì)豐度之和均超過(guò)75%，在樣品Q(chēng)D0325和LZ0324的粗細(xì)粒徑中甚至達(dá)到90%以上。這各個(gè)采樣點(diǎn)粗粒徑樣品中，Proteobacteria相對(duì)豐度均低于其在細(xì)粒徑中的相對(duì)豐度，F(xiàn)irmicutes則相反；蘭州LZ0324樣品Actinobacteria的相對(duì)豐度在粗粒徑氣溶膠高于細(xì)粒徑，其余樣品則相反；青島QD0107、QD0325和蘭州LZ0327樣品Bacteroidetes的相對(duì)豐度在粗粒徑氣溶膠低于細(xì)粒徑，其余樣品則相反。

在屬分類(lèi)水平上(見(jiàn)圖5(b))，黃海細(xì)粒徑氣溶膠中，擬桿菌(Bacteroides,4.81%)的相對(duì)豐度最高，粗粒徑氣溶膠中假單胞菌(Pseudomonas,10.87%)的相對(duì)百分比最高；在青島樣品中，QD0107的細(xì)粒徑氣溶膠中假單胞菌(Pseudomonas,22.93%)的相對(duì)豐度最高，粗粒徑氣溶膠中韋榮氏球菌(Veillonella,7.12%)的相對(duì)豐度最高；QD0325細(xì)粒徑氣溶膠中嗜冷桿菌(Psychrobacter,24.38%)相對(duì)豐度最高，粗粒徑氣溶膠中類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus,31.57%)的相對(duì)豐度最高；鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)在QD0816粗細(xì)粒徑氣溶膠中的相對(duì)豐度均是最高的且分別達(dá)13.93%和64.66%。在蘭州樣品中，LZ0324細(xì)粒徑氣溶膠中雙歧桿菌(Bifidobacterium,22.07%)和韋榮氏球菌(Veillonella,22.80%)為優(yōu)勢(shì)菌，雙歧桿菌(Bifidobacterium,1.87%)為粗粒徑氣溶膠的優(yōu)勢(shì)菌；LZ0327細(xì)粒徑氣溶膠中不動(dòng)桿菌(Acinetobacter,23.53%)為優(yōu)勢(shì)菌，雙歧桿菌(Bifidobacterium,9.73%)為粗粒徑氣溶膠的優(yōu)勢(shì)菌。綜上可得，不同區(qū)域甚至是同一區(qū)域的不同采樣時(shí)間細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌是不同的，而且同一樣品粗、細(xì)優(yōu)勢(shì)菌組成也是不同的。

圖5 2014—2015年黃海、青島和蘭州粗粒徑和細(xì)粒徑生物氣溶膠中(a)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和(b)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度

2.4 環(huán)境因子對(duì)大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

首先，對(duì)物種數(shù)據(jù)(OTUs)進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis，DCA)，根據(jù)分析結(jié)果，若最大軸長(zhǎng)大于4.0則選擇典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis，CCA)，小于3.0則選擇冗余分析(Redundancy analysis，RDA)，介于3.0～4.0之間兩者均可。DCA分析結(jié)果表明，CCA更適合用來(lái)分析2014—2015年黃海、青島和蘭州大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子間的相關(guān)性。2014—2015年細(xì)菌群落結(jié)果和環(huán)境因子(溫度、風(fēng)速和相對(duì)濕度)的典范對(duì)應(yīng)分析(見(jiàn)圖6)和置換檢驗(yàn)表明，風(fēng)速對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響(p<0.01)。

圖6 2014—2015年黃海、青島和蘭州生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的典范對(duì)應(yīng)分析

2.5 后向軌跡分析

分別將黃海、青島和蘭州生物氣溶膠樣品采樣時(shí)的北京時(shí)間均轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)世界時(shí)(Coordinated Universal Time，UTC)，并對(duì)這3個(gè)采樣點(diǎn)500 m的高度進(jìn)行72 h后向軌跡分析(見(jiàn)圖7)。結(jié)果表明，除青島QD0816采樣點(diǎn)的氣團(tuán)來(lái)自海洋源外(見(jiàn)圖7(d))，其余采樣時(shí)氣團(tuán)均來(lái)自陸地源，雖然這些氣團(tuán)來(lái)自不同的地區(qū)，但均是通過(guò)長(zhǎng)距離氣團(tuán)傳輸。

((a)YS；(b)QD0107；(c)QD0325；(d)QD0816；(e)LZ0324；(f)LZ0327。 (a) YS; (b) QD0107; (c) QD0325; (d) QD0816; (e) LZ0324; (f) LZ0327.)

3 討論

3.1 時(shí)空差異性分析

細(xì)菌廣泛分布于大氣氣溶膠中，是大氣環(huán)境的重要組成部分。經(jīng)高通量測(cè)序，黃海氣溶膠樣品中細(xì)菌群落多樣性略高于陸地(青島和蘭州)(p<0.01)，青島樣品中細(xì)菌群落的多樣性高于同時(shí)期的蘭州樣品(p<0.01)。隨著測(cè)序方法和建庫(kù)深度等技術(shù)的不斷進(jìn)步，本研究中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性遠(yuǎn)高于之前對(duì)挪威海[41]和韓國(guó)首爾沙塵和非沙塵天氣下[39]的生物氣溶膠的研究結(jié)果(見(jiàn)表2)。黃海氣溶膠中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性高于渤海[10](見(jiàn)表2)。根據(jù)后向軌跡的結(jié)果所示，黃海的氣團(tuán)主要來(lái)自西北方向的陸地氣團(tuán)，即細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受陸地氣團(tuán)影響較大，可能導(dǎo)致細(xì)菌群落的豐富和多樣性高于其他海域。但青島和蘭州的細(xì)菌群落的豐富度低于中國(guó)常州市[38]以及泰山部分時(shí)間段的生物氣溶膠樣品[37](見(jiàn)表2)，不同地區(qū)由于氣象因素和微生物的來(lái)源不同，生物氣溶膠在空間分布上存在一定的差異。同時(shí)，由于氣候條件和周?chē)h(huán)境的變化，同一地點(diǎn)生物氣溶膠的微生物也會(huì)發(fā)生季節(jié)性變化[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)，3月份青島生物氣溶膠中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性均高于1和8月(p<0.05)，即春季大氣生物氣溶膠中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性高于冬季和夏季。

表2 2014—2015年黃海、青島和蘭州細(xì)菌群落多樣性與國(guó)內(nèi)外對(duì)比一覽表

對(duì)生物氣溶膠中OTU分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，3月的黃海與陸地(青島和蘭州)沒(méi)有共有OTUs(細(xì)菌核心類(lèi)群)，表明這些樣品的生物氣溶膠中細(xì)菌獨(dú)有物種數(shù)較高。后向軌跡分析表明，3月黃海、青島和蘭州這三地的氣團(tuán)均是陸地源，但氣團(tuán)來(lái)源地和遠(yuǎn)距離傳輸路徑不同，且對(duì)于進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳輸?shù)奈⑸飼?huì)受到大氣中惡劣環(huán)境條件的影響，如極端氣溫，干燥的天氣和強(qiáng)烈的紫外線(xiàn)等[42]，這都可能是導(dǎo)致不同地點(diǎn)生物氣溶膠樣品中的物種出現(xiàn)明顯差異的原因。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，3月青島和蘭州樣品聚為一支，說(shuō)明陸地群落結(jié)構(gòu)較為相似；但3月黃海與陸地(青島和蘭州)樣品聚類(lèi)距離較長(zhǎng)，表明黃海樣品與陸地樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。已有研究結(jié)果可知黃海OTU數(shù)最高，且優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中擬桿菌占比最高，這可能導(dǎo)致該樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與同時(shí)期陸地樣品差異較大。同時(shí)，青島不同采樣時(shí)間的生物氣溶膠中只有1個(gè)共有OTU，又由于不同采樣時(shí)間的氣團(tuán)來(lái)源不同，大氣氣流對(duì)于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響也是不同的。主成分分析表明，黃海與其他陸地樣品氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異明顯，說(shuō)明黃海和陸地樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性較低。組間差異分析的結(jié)果也表明，黃海、青島和蘭州以及青島不同采樣時(shí)間的生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性顯著大于同一氣溶膠樣品中粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異(p<0.01)。海洋氣溶膠可以直接從海水表層產(chǎn)生[43]，或者通過(guò)遠(yuǎn)距離大氣傳輸或沿海地區(qū)的海陸風(fēng)將陸地氣溶膠傳輸?shù)胶Ｑ罂諝庵衃44]，所以海洋氣溶膠可能受海洋源和陸地源共同影響，其微生物群落結(jié)果與其他陸地樣品存在差異性。Fang等[45]對(duì)杭州市的不同季節(jié)4個(gè)地點(diǎn)空氣進(jìn)行采集，其結(jié)果表明不同采樣點(diǎn)細(xì)菌濃度存在顯著差異，且不同采樣點(diǎn)細(xì)菌濃度呈季節(jié)性變化。

本研究現(xiàn)黃海、青島和蘭州各個(gè)生物氣溶膠中粗細(xì)粒徑的優(yōu)勢(shì)菌分別均是Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes。Seifried等[46]對(duì)從北海到波羅的海的不同海域的細(xì)菌群落研究發(fā)現(xiàn)，最豐富的細(xì)菌同樣是這4種細(xì)菌；且這4種細(xì)菌在春季常州市和石河子市的細(xì)菌群落中豐度也最高[38,47]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不同采樣點(diǎn)地理位置和環(huán)境因素等不同，其生物氣溶膠中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌也存在一定的差異[10,37-41](見(jiàn)表2)。研究還發(fā)現(xiàn)，黃海、青島和蘭州生物氣溶膠中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬是不同的，Pseudomonas在黃海和青島氣溶膠樣品中豐度均相對(duì)較高，但在蘭州則豐度很低。在一些海洋或者沿海地區(qū)的生物氣溶膠研究中發(fā)現(xiàn)Pseudomonas是主要菌屬[20,46,48]，并且它們也主要寄生于植物中，說(shuō)明植物也可能是空氣微生物的來(lái)源之一[38,49]，但蘭州地處中國(guó)西北地區(qū)，氣候干旱且植被覆蓋率不高，這可能導(dǎo)致Pseudomonas含量不高。Bacteroides在黃海氣溶膠樣品中的豐度值高于陸地樣品，Ma等[10]也發(fā)現(xiàn)渤海、黃海和西北太平洋氣溶膠中Bacteroides是細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌屬。Seifried等[46]提出大氣中可能存在穩(wěn)定的“細(xì)菌核心群落”，可能來(lái)自熱帶雨林、大型草地或土壤等區(qū)域，它們可以在長(zhǎng)距離傳輸中不斷分布和混合，例如擬桿菌和假單胞菌，是海洋和沿海生態(tài)系統(tǒng)生物氣溶膠研究中的優(yōu)勢(shì)菌。而青島和蘭州采樣點(diǎn)氣溶膠中有些細(xì)菌，例如Veillonella、Bifidobacterium、Psychrobacter和Paenibacillus等細(xì)菌在黃海海域氣溶膠樣品中豐度極低，表明這些屬種很大可能來(lái)源于陸地。此外，同一采樣點(diǎn)的不同采樣時(shí)間，其生物氣溶膠中細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌屬也不同的。在8月青島的生物氣溶膠中Sphingomonas的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于1和3月，Sphingomonas在高溫、紫外線(xiàn)和嚴(yán)寒等不利的環(huán)境變化下，能高效調(diào)整自身的生長(zhǎng)來(lái)抵抗[50]，本研究中8月采樣時(shí)正值夏季，溫度高且紫外線(xiàn)強(qiáng)烈，這使得Sphingomonas相對(duì)豐度值升高；而Psychrobacter和Paenibacillus只有在3月的青島樣品中才檢測(cè)到，表明不同時(shí)間的生物氣溶膠樣品中有各自特異的菌種存在。因此，由于空間和時(shí)間的不同，環(huán)境、氣團(tuán)傳輸軌跡和微生物來(lái)源等也是不同的，這可能導(dǎo)致細(xì)菌群落的多樣性、結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌的組成等在不同空間和時(shí)間分布上存在差異，且生物氣溶膠樣品中有各自特異的菌種存在。

3.2 粒徑差異性分析

黃海氣溶膠中粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落豐富度差異較小，但3月27日蘭州樣品中粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落的豐富度差異較大(p>0.05)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，微生物主要分布在粗粒徑中[24,51]，Lu等[16]研究發(fā)現(xiàn)粗粒徑(PM10～2.5)細(xì)菌豐富度高于細(xì)粒徑(PM2.5)；Ma等[10]發(fā)現(xiàn)黃海和西北太平洋氣溶膠中粗粒徑細(xì)菌多樣性高于細(xì)粒徑。但本研究發(fā)現(xiàn)，僅3月25日青島生物氣溶膠樣品中粗粒徑細(xì)菌豐富度低于細(xì)粒徑，有研究發(fā)現(xiàn)沿海地區(qū)粗顆粒氣溶膠的濃度受風(fēng)速和相對(duì)濕度等環(huán)境因子的影響，即在相對(duì)濕度或風(fēng)速較低時(shí)，粗粒徑氣溶膠濃度會(huì)降低，而細(xì)顆粒容易保持其在大氣中的懸浮狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)幾天或幾周，并且可以進(jìn)行長(zhǎng)距離傳輸[52]。在本次采樣期間，QD0325樣品采樣時(shí)風(fēng)速(約3.8 m/s)小于其他樣品，這可能導(dǎo)致該青島氣溶膠樣品粗粒徑細(xì)菌的豐富度低于細(xì)粒徑。蘭州LZ0324樣品采樣時(shí)相對(duì)濕度和風(fēng)速均高于LZ0327樣品且伴有沙塵天氣[53]，使得從3月24—27日生物氣溶膠中粗粒徑細(xì)菌的豐富度和多樣性增加速度大于細(xì)粒徑。研究發(fā)現(xiàn)沙塵發(fā)生時(shí)，約55%的微生物附著在粗顆粒上(>5 μm)，僅約7%的微生物附著在細(xì)顆粒上(1～2 μm)[54]。通過(guò)主成分分析也可以發(fā)現(xiàn)，蘭州LZ0324樣品粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯高于其他樣品。同一時(shí)期李洪濤等[55]發(fā)現(xiàn)，蘭州沙塵發(fā)生時(shí)微生物濃度的增加主要由于長(zhǎng)距離的沙塵顆粒攜帶大量的外源微生物。該時(shí)期蘭州采樣點(diǎn)氣團(tuán)的后向軌跡分析也可以看出，氣團(tuán)主要來(lái)自俄羅斯和蒙古國(guó)等北方地區(qū)的長(zhǎng)距離傳輸。

Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes也是黃海、青島和蘭州生物氣溶膠中粗細(xì)粒徑細(xì)細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但這4種優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度值在粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落中是不同的(p<0.01)，例如，Proteobacteria主要存在細(xì)粒徑細(xì)菌群落中，而Firmicutes則在粗粒徑細(xì)菌群落中豐度較高。可能是Firmicutes在大氣中主要以細(xì)菌聚合物的形式存在于粗粒徑氣溶膠中，而Proteobacteria主要以孢子狀態(tài)存在于大氣細(xì)粒徑中且含量較高[56]。尤其是在3月27日發(fā)生沙塵時(shí)，LZ0327細(xì)粒徑樣品中的Proteobacteria明顯高于LZ0324細(xì)粒徑樣品。Polymenakou等[57]通過(guò)對(duì)東地中海沿海城市空氣中微生物粒徑分布的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在大粒徑顆粒物(>3.3 μm)中厚壁菌豐度較高，而在小粒徑顆粒物(<3.3 μm)中放線(xiàn)菌和擬桿菌豐度更高。黃海、青島和蘭州粗細(xì)粒徑樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬也存在明顯的差異。例如，Bacteroides在黃海粗粒徑樣品中的相對(duì)豐度高于細(xì)粒徑；Psychrobacter和Paenibacillus分別是QD0325粗細(xì)粒徑中的優(yōu)勢(shì)菌；沙塵發(fā)生時(shí)，蘭州細(xì)粒徑樣品中的優(yōu)勢(shì)菌由Bifidobacterium轉(zhuǎn)為Acinetobacter，粗粒徑樣品中的優(yōu)勢(shì)菌仍是Bifidobacterium但相對(duì)豐度值發(fā)生增長(zhǎng)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，粗顆?？梢园?xì)菌從而減少細(xì)菌受到紫外線(xiàn)輻射，還可以為細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；但細(xì)顆粒較大的比表面積導(dǎo)致細(xì)菌受到外界環(huán)境的影響較大，因此粗顆粒物上的細(xì)菌對(duì)環(huán)境急劇變化的適應(yīng)能力較細(xì)顆粒物上的要強(qiáng)[16]，使得粗細(xì)粒徑樣品中的細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化。

3.3 環(huán)境因子對(duì)大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

現(xiàn)有研究表明，采樣點(diǎn)之間細(xì)菌群落組成的差異可能會(huì)受到采樣點(diǎn)的選擇及其附近生態(tài)系統(tǒng)的影響[46]。通過(guò)后向軌跡分析，除了QD0816采樣的氣團(tuán)來(lái)自海洋源，其余黃海、青島和蘭州采樣點(diǎn)的氣團(tuán)均主要來(lái)自陸地源，但這些生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間存在差異，說(shuō)明生物氣溶膠中細(xì)菌類(lèi)群可能受到地理位置和環(huán)境因子的影響。Wei等[58]通過(guò)分析華北平原生物物質(zhì)燃燒擾動(dòng)后細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)特征，認(rèn)為環(huán)境因子與微生物類(lèi)群密切相關(guān)。此外，同一采樣點(diǎn)在季節(jié)分布上其微生物的群落結(jié)構(gòu)也具有一定的差異性，這些差異主要是因?yàn)椴蓸訒r(shí)的氣候條件、氣象因子和微生物來(lái)源等因素，使得生物氣溶膠中微生物的種類(lèi)和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異。同時(shí)，同一采樣點(diǎn)粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異可能是由于細(xì)菌在傳播過(guò)程中的不斷混合并且其來(lái)源發(fā)生了變化，以及受當(dāng)?shù)貧庀髼l件的影響。本研究觀察到的環(huán)境因子中，風(fēng)速對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(p<0.01)，風(fēng)速對(duì)微生物的影響主要表現(xiàn)為風(fēng)速較大時(shí)使得大氣邊界層發(fā)生擾動(dòng)，導(dǎo)致大氣顆粒物懸浮且微生物的濃度增加，但如果風(fēng)速過(guò)大則會(huì)對(duì)大氣中微生物起到稀釋的作用，降低大氣中微生物濃度[22]。

4 結(jié)論

在本研究中，基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)黃海、青島和蘭州的采樣點(diǎn)大氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行對(duì)比分析，獲得以下結(jié)論：

(1)組間差異分析的結(jié)果表明，黃海、青島和蘭州以及青島不同采樣時(shí)間的生物氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性顯著大于同一氣溶膠樣品中粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異(p<0.01)。具體表現(xiàn)為，黃海氣溶膠樣品中細(xì)菌群落多樣性略高于陸地(青島和蘭州)(p<0.01)，青島樣品中細(xì)菌群落的多樣性高于同時(shí)期的蘭州樣品(p<0.01)，青島春季大氣生物氣溶膠中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性高于冬季和夏季(p<0.05)。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，3月黃海與陸地(青島和黃海)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。受采樣位置和環(huán)境因子的影響，Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes為這三地生物氣溶膠中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但不同采樣點(diǎn)甚至是同一采樣點(diǎn)的不同采樣時(shí)間細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌是不同的。

(2)除3月青島樣品外，其他樣品生物氣溶膠中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性高于細(xì)粒徑，其中沙塵發(fā)生后，蘭州粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)差異較大(p>0.05)。又由于粗細(xì)顆粒耐受環(huán)境變化的能力不同，可能導(dǎo)致黃海、青島和蘭州粗細(xì)粒徑細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度發(fā)生變化。例如，Bacteroides在黃海粗粒徑樣品中的相對(duì)豐度高于細(xì)粒徑；Psychrobacter和Paenibacillus分別是3月青島樣品中粗細(xì)粒徑中的優(yōu)勢(shì)菌；沙塵發(fā)生時(shí)，蘭州細(xì)粒徑樣品中的優(yōu)勢(shì)菌由Bifidobacterium轉(zhuǎn)為Acinetobacter，粗粒徑樣品中的優(yōu)勢(shì)菌仍是Bifidobacterium但相對(duì)豐度值增大。

(3)本研究觀察到的環(huán)境因子中(溫度、風(fēng)速和相對(duì)濕度)，風(fēng)速對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(p<0.01)。由于海上樣品采樣時(shí)間受出海航次的影響，不同地點(diǎn)時(shí)間分布的差異會(huì)對(duì)微生物群落有一定的影響。但本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同地點(diǎn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了對(duì)比分析，獲得了對(duì)不同時(shí)間和不同地點(diǎn)尤其是對(duì)海洋和陸地大氣微生物群落結(jié)構(gòu)的初步認(rèn)識(shí)，可為研究大范圍氣溶膠特點(diǎn)提供微生物生態(tài)學(xué)方面的依據(jù)。

致謝：感謝西北師范大學(xué)蘇雪老師、中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院鐘茜和董立杰同學(xué)在樣品采集中提供的幫助。