花鱸aqp3a基因的克隆、表達(dá)分析及滲透調(diào)節(jié)功能研究*

李金庫(kù)， 于 朋， 溫海深， 齊 鑫， 孫冬磊， 王靈鈺， 李 昀

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

硬骨魚(yú)類與陸生脊椎動(dòng)物一樣都需要維持體液的離子平衡及滲透穩(wěn)態(tài)，魚(yú)類在水中面臨更加多變的離子環(huán)境，因而維持體液穩(wěn)態(tài)對(duì)硬骨魚(yú)類來(lái)說(shuō)更具有挑戰(zhàn)性[1]。為了應(yīng)對(duì)水環(huán)境中的鹽度變化，魚(yú)類進(jìn)化出復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制[2]。長(zhǎng)久以來(lái)，人們普遍認(rèn)為水分的跨膜運(yùn)輸是以自由擴(kuò)散的方式通過(guò)磷脂雙分子層。然而，在之后的研究中人們發(fā)現(xiàn)水分子可以快速的通過(guò)選擇性通道進(jìn)入紅細(xì)胞而其它的溶質(zhì)分子和離子則不能通過(guò)。直至1991 年，Agre 等完成了對(duì)水通道蛋白1(AQP1)的克隆和鑒定[3]，從而確定了細(xì)胞膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)水的特定性通道蛋白，由此揭開(kāi)了研究水通道蛋白的序幕。隨后人們?cè)诩棺祫?dòng)物中共鑒定出17個(gè)水通道蛋白同源基因(aqp0～aqp16)，將其稱為水通道蛋白家族，其功能多樣，能顯著增加細(xì)胞膜水的通透性，參與水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外平衡的調(diào)節(jié)，廣泛參與細(xì)胞滲透壓以及生理與病理的調(diào)節(jié)。

水通道蛋白3(AQP3)參與水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外平衡的調(diào)節(jié)，在魚(yú)類的滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。AQP3作為水通道蛋白家族的一員，除了對(duì)水有通透性以外，還允許甘油和尿素等小分子物質(zhì)的通過(guò)。近年來(lái)有關(guān)硬骨魚(yú)中aqp3基因的研究取得了一些進(jìn)展。 Cutler等在歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)中克隆出aqp3基因并對(duì)其組織表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于眼、食道、腸和鰓，在胃和腎臟中沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)量很低。對(duì)其鰓中aqp3的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其表達(dá)水平在海水適應(yīng)過(guò)程中顯著降低[4]。進(jìn)一步研究表明aqp3與水或尿素的運(yùn)輸有關(guān)，AQP3可能在基底外側(cè)膜中充當(dāng)一個(gè)管道，將水釋放到漿膜液中，并防止細(xì)胞腫脹[4-6]。隨后，Hirata 等在瓦氏雅羅魚(yú)(Tribolodonhakonensis)中也鑒定出aqp3基因。研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境中瓦氏雅羅魚(yú)鰓組織中aqp3的表達(dá)量顯著增加，并利用免疫組化技術(shù)將AQP3定位在了瓦氏雅羅魚(yú)鰓組織的氯細(xì)胞中，與Na+/K+-ATP酶的定位結(jié)果相似。這表明酸誘導(dǎo)的aqp3表達(dá)促進(jìn)了基底外側(cè)膜的水轉(zhuǎn)運(yùn)，在一定程度參與了滲透調(diào)節(jié)[7]。Watanabe等在莫桑比克羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)中克隆出了aqp3基因，利用RT-PCR對(duì)海水和淡水適應(yīng)過(guò)程中的aqp3基因進(jìn)行組織表達(dá)分析，結(jié)果顯示在淡水適應(yīng)過(guò)程中，AQP3在主要的滲透調(diào)節(jié)器官如鰓中的表達(dá)量明顯高于海水，而在腎、腸中的表達(dá)情況相反。此外利用免疫組化技術(shù)將aqp3定位在了鰓中氯細(xì)胞的基底外側(cè)[8]。隨著多種硬骨魚(yú)類全基因組數(shù)據(jù)的公布，越來(lái)越多的aqp3在硬骨魚(yú)中被鑒定出來(lái)，例如日本鰻鱺(Anguillajaponica)[9]、日本青鳉(Oryziaslatipes)[10]、歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)[11]、薩羅羅非魚(yú)(Sarotherodonmelanothern)[12]等，使得硬骨魚(yú)aqp3的結(jié)構(gòu)、功能方面的研究愈發(fā)深入。

花鱸(Lateolabraxmaculatus)又稱中國(guó)花鱸，俗稱海鱸、七星鱸、寨花等，廣泛分布于中國(guó)沿海以及朝鮮沿海，是中國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[13]?；|具有廣鹽性的特征(能適應(yīng)0～45的鹽度范圍)[14]，是研究滲透調(diào)節(jié)機(jī)制的理想模型，然而關(guān)于花鱸水通道蛋白基因的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究獲得了花鱸aqp3a基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其序列特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析；利用枝位點(diǎn)模型進(jìn)行了選擇壓力分析，預(yù)測(cè)出了aqp3a基因進(jìn)化過(guò)程中受到正選擇的位點(diǎn)；利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了花鱸aqp3a基因的組織表達(dá)譜，及其在淡水和海水轉(zhuǎn)換后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、1d、3d、7d)鰓中的表達(dá)情況。此外，利用顯微注射技術(shù)將花鱸aqp3a在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，以進(jìn)一步檢測(cè)AQP3a蛋白的透水活性。本研究結(jié)果為深入研究花鱸aqp3a基因的滲透調(diào)節(jié)功能提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其它魚(yú)類水通道蛋白的相關(guān)研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 鹽度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用花鱸及實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地均由東營(yíng)市利津縣雙瀛水產(chǎn)苗種有限責(zé)任公司提供。隨機(jī)選取90尾室內(nèi)海水(鹽度30)人工養(yǎng)殖的健康的1齡花鱸((120.66 ± 1.87) g)，隨機(jī)分配到6個(gè)體積為100 L的白色塑化桶中(3個(gè)淡水桶，3個(gè)海水桶)，每桶放置15尾。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3周分別在淡水(FW，鹽度0)和海水(SW，鹽度30)環(huán)境下馴化，馴化期間于每日8:30和16:30投喂配合飼料，并在投喂1 h后吸除殘餌和糞便。每2天換一次水，換水量為50%。

馴化3周后正式進(jìn)行鹽度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)：將淡水中的個(gè)體迅速轉(zhuǎn)入海水，標(biāo)記為FW-SW組；同時(shí)將海水中的個(gè)體迅速轉(zhuǎn)移至淡水中，并標(biāo)記為SW-FW組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。其它實(shí)驗(yàn)條件包括溫度((15.0±0.5 ) ℃)、溶解氧((7.1±0.4) mg/L)、pH(8.0±0.3)等在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持恒定。分別于鹽度轉(zhuǎn)換前(0 h)和轉(zhuǎn)換后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12 h、1 d、3 d 和 7 d)采集樣品，于各實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)平行桶中各取3尾魚(yú)，即每個(gè)實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)共取9尾魚(yú)，經(jīng)MS222(200 mg/L)麻醉后立即取樣。采集鰓組織樣本并迅速放入液氮中，隨后置于-80 ℃保存。另外，0 h對(duì)照組每條魚(yú)除鰓組織外，采集腎、性腺、胃、腸、肌肉、心、脾、肝和腦9個(gè)組織，并立即放入液氮中，隨后置于-80 ℃保存，用于總RNA的提取和組織表達(dá)譜的分析。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)從所取組織樣品中提取總RNA。采用Biodropsis BD-1000核酸分析儀(OSTC, Beijing)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA的濃度和完整性。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A Takara)試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 花鱸aqp3a基因的鑒定及克隆

從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載6種脊椎動(dòng)物的aqp3核苷酸序列，包括人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)和斑馬魚(yú)(Daniorerio)，利用TBLASTN (1×e-5)對(duì)花鱸參考基因組(PRJNA408177)及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(PRJNA515783)進(jìn)行檢索，初步確定花鱸候選aqp3a基因序列。

按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa)說(shuō)明書(shū)，以花鱸鰓組織的總RNA為模板合成第一鏈cDNA。根據(jù)獲得的候選aqp3a基因序列設(shè)計(jì)用于CDS克隆的正、反向引物和用于5′、3′非編碼區(qū)克隆的特異性引物，以花鱸鰓組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用FastPure? Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收試劑盒(Vazyme)純化，純化產(chǎn)物與TA/Blunt-Zero載體(Vazyme)連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。實(shí)驗(yàn)所用引物信息詳見(jiàn)表1, 引物合成及測(cè)序均由華大基因完成。將獲得的序列利用open rea-ding frame (ORF) finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件來(lái)預(yù)測(cè)氨基酸序列，并通過(guò)BLASTP比對(duì)NCBI非冗余(NR)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。利用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對(duì)鑒定得到的花鱸aqp3a基因的特征結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences

1.4 氨基酸序列分析

通過(guò)ExPASy Prot-Param在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算得到預(yù)測(cè)的花鱸AQP3a蛋白的分子量(MW, kD)和等電點(diǎn)(pI)。利用TMHMM Server v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi-ces/TMHMM/)預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列中的α跨膜螺旋。通過(guò)Swiss-Model程序(https://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建花鱸AQP3a蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，并用PyMOL 1.3軟件作圖。通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)人、小鼠、雞、非洲爪蟾、歐洲鱸、尼羅羅非魚(yú)、遮目魚(yú)(Chanoschanos)、黃顙魚(yú)(Tachysurusfulvidraco)、銀大馬哈魚(yú)(Oncorhynchuskisutch)、斑馬魚(yú)以及花鱸的預(yù)測(cè)AQP3a蛋白進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)，并對(duì)序列同源性及親水性進(jìn)行分析。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用花鱸和其它幾種脊椎動(dòng)物的AQP3氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值為1 000。

1.6 選擇壓力分析

基于花鱸與其它物種構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用枝位點(diǎn)模型對(duì)兩個(gè)主要的進(jìn)化枝(硬骨魚(yú)類與高等脊椎動(dòng)物)進(jìn)行選擇壓力分析。以硬骨魚(yú)類為前景枝，高等脊椎動(dòng)物為后景枝，利用EasyCodeML程序?qū)χξ稽c(diǎn)模型的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，采用似然比檢驗(yàn)(LRT)比較模型對(duì)的擬合程度，采用貝葉斯法(BEB)對(duì)正選擇位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別[15],利用Protter (http://wlab.ethz.ch/protter/start/)在線軟件繪制AQP3氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)并標(biāo)注正選擇位點(diǎn)的位置分布。

1.7 qRT-PCR分析

使用StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems) PCR儀，對(duì)花鱸aqp3a進(jìn)行qRT-PCR相對(duì)表達(dá)定量分析。20 μL反應(yīng)總體系包含2 μL cDNA模板，正向和反向引物各0.4 μL，10 μL SYBR?FAST qPCR Master Mix、0.4 μL ROX Dye和6.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s, 共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以18s RNA為內(nèi)參[16]。使用primer 5軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物，引物具體信息見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因的相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算, 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

1.8 花鱸aqp3a基因的異源表達(dá)

實(shí)驗(yàn)所用非洲爪蟾由山東大學(xué)生命學(xué)院動(dòng)物細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。非洲爪蟾的年齡為3～4齡，體長(zhǎng)(10.22 ± 3.00) cm。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將非洲爪蟾暫養(yǎng)在循環(huán)水系統(tǒng)中(自來(lái)水充分曝氣；水溫：15 ℃；光照：12 h光照/12 h黑暗)，每周投喂3次。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后挑選發(fā)育良好的雌性個(gè)體，注射50單位的人絨毛膜促性腺激素促進(jìn)其產(chǎn)卵，以人工擠卵的方式獲得Ⅴ～Ⅵ期的卵母細(xì)胞，并在解剖鏡下剝除卵膜。將花鱸aqp3acDNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA用于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的顯微注射。顯微注射系統(tǒng)(ZGENEBIO, PCO-1500, Taiwan)的注射壓力為43 psi，注射時(shí)間為10 ms。用于顯微注射的卵母細(xì)胞分為2組，其中實(shí)驗(yàn)組每顆卵母細(xì)胞注射含10 ngaqp3acRNA的水溶液50 nL，對(duì)照組每顆卵母細(xì)胞注射50 nL蒸餾水，之后在改良的Barth溶液(MBS，88 mmol/L； NaCl，1 mmol/L； KCl， 0.7 mmol/L； CaCl2，2.5 mmol/L； NaHCO3，1 mmol/L；MgSO4，5 mmol/L；HEPES，1 000 IU/mL；青霉素，鏈霉素100 μg/mL；制真菌素125 IU/mL)中孵育48 h(18 ℃，滲透壓：200 mOsmol)。隨后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10倍稀釋的MBS (20 mOsmol)中，通過(guò)顯微鏡5 min內(nèi)每30 s獲取一張卵母細(xì)胞輪廓圖像。保存的圖像隨后使用tpsDig232軟件進(jìn)行測(cè)量(http://life.bio.sunysb.edu/morph/)，以此來(lái)測(cè)定卵母細(xì)胞的透水率(Pf)。Pf值計(jì)算公式為：Pf=V0·[d(V/V0)/dt]/ [S·Vw·(Oin-Oout)]，其中V0代表卵母細(xì)胞的初始體積；[d(V/V0)dt]表示相對(duì)卵母細(xì)胞體積隨時(shí)間的變化;Vw為水的摩爾體積(Vw=18 cm3/mol)；S為卵母細(xì)胞初始表面積；Oin和Oout為卵母胞內(nèi)、外環(huán)境的滲透壓。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 花鱸aqp3a基因的鑒定及序列分析

克隆獲得了花鱸aqp3a基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其序列的特征信息列于表2：aqp3a基因的mRNA全長(zhǎng)2 058 bp，其中5′非編碼區(qū)長(zhǎng)84 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)1 065 bp，CDS長(zhǎng)909 bp，編碼302個(gè)氨基酸，編碼區(qū)含有2個(gè)水通道蛋白家族的特征性天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列(見(jiàn)圖1)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明其存在6個(gè)α跨膜螺旋，跨膜位點(diǎn)為：21～43、58～80、101～123、162～181、194～216和249～271(見(jiàn)圖1)。預(yù)測(cè)的花鱸AQP3a蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖2所示。AQP3a的C端和N端氨基酸的親水系數(shù)較高，其親水性氨基酸位點(diǎn)主要分布在跨膜區(qū)域，而其它位點(diǎn)表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性(見(jiàn)圖3)。

(加粗部分為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；黃色標(biāo)注序列為6個(gè)α跨膜螺旋；紅色圓圈內(nèi)序列為2個(gè)水通道蛋白家族的特征性天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列。 The bold part is the start codon (ATG) and the stop codon (TAG)，The yellow labeled sequences were 6 transmembrane helices. The sequence in the red circle is the characteristic Asparagine-Proline -Alanine (NPA) sequence of the Aquaporin family.)

表2 花鱸aqp3a基因序列信息統(tǒng)計(jì)Table 2 Summary of characteristics of aqp3a genes in spotted sea bass

(圖中TM1～TM6為α跨膜螺旋，NPA為天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列。In the figure, TM1～TM6 is the transmembrane helix, and NPA is the sequence of Asparagine-Proline-Alanine.)

(縱軸數(shù)值大小代表氨基酸序列的親水性，值越大親水性越強(qiáng)。 The value of the vertical axis represents the hydrophilicity of amino acid sequence, the higher the value, the stronger the hydrophilicity.)

2.2 AQP3氨基酸序列的多重比對(duì)及同源性分析

利用DANMAN軟件對(duì)花鱸與其它10種脊椎動(dòng)物的AQP3的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果如圖4所示，各個(gè)物種間的蛋白序列相對(duì)保守，都有2個(gè)高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)模體以及6個(gè)α跨膜螺旋。花鱸AQP3a與歐洲鱸AQP3的同源性最高，為91.1%，其次是尼羅羅非魚(yú)AQP3ab，同源性為89.6%，與其它高等脊椎動(dòng)物的同源性則較低，為68.1%～69.4%。

(圖中黃色矩形內(nèi)的序列代表6個(gè)共同的α跨膜螺旋；橙色矩形內(nèi)的序列代表水通道蛋白家族的特征性天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列。The sequence in the yellow rectangle represents 6 common transmembrane helices. The orange rectangle represents the characteristic Asparagine-Proline-Alanine (NPA) sequence of the Aquaporin family.)

2.3 AQP3a的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MAGA 7.0 軟件構(gòu)建了aqp3基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。如圖5所示，高等脊椎動(dòng)物的aqp3基因聚成一枝，硬骨魚(yú)類的aqp3基因則聚為另外一枝。其中花鱸aqp3a與歐洲鱸aqp3、尼羅羅非魚(yú)aqp3ab的同源關(guān)系相對(duì)較近。

圖5 AQP3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic trees of AQP3

2.4 選擇壓力分析

我們采用枝位點(diǎn)模型，選取硬骨魚(yú)為前景枝、高等脊椎動(dòng)物為后景枝，來(lái)檢驗(yàn)aqp3在硬骨魚(yú)中表現(xiàn)出的正選擇位點(diǎn)，并通過(guò)似然率檢驗(yàn)(LRT)獲得P值確定零假設(shè)模型和備選模型之間是否存在差異。如表3所示，根據(jù)貝葉斯法(BEB)，硬骨魚(yú)和高等脊椎動(dòng)物之間存在22個(gè)正選擇位點(diǎn)：15 F，16 Q，42 A，46 L，55 M，61 F，67 A，73 V，74 C，92 L，94 G ，99 R*，105 F**，107 F**，119 I，122 M，127 L，164 I，174 I，203 L**，219 L，236 T，其中99 R，105 F，107 F和203 L為顯著受正選擇的位點(diǎn)(P>0.95)，利用Protter (http://wlab.ethz.ch/protter/start/)在線軟件根據(jù)花鱸AQP3a氨基酸序列繪制其二級(jí)結(jié)構(gòu)并標(biāo)注正選擇位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)，其中的3個(gè)位點(diǎn)分別在2個(gè)跨膜螺旋中，剩下的1個(gè)位點(diǎn)位于構(gòu)成水孔通道的重要位置。相比于高等脊椎動(dòng)物，在硬骨魚(yú)中，99位的精氨酸替換了異亮氨酸，105位和107位的苯丙氨酸替換了丙氨酸，203位的亮氨酸替換了蘇氨酸。

表3 AQP3的選擇壓力分析Table 3 Selective pressure analysis of AQP3

圖6 枝位點(diǎn)模型預(yù)測(cè)的AQP3的正選擇位點(diǎn)Fig. 6 Distribution of positive selection sites of AQP3 predicted by the branch-site models

2.5 花鱸aqp3a基因mRNA的組織表達(dá)譜分析

花鱸aqp3a基因的組織表達(dá)譜分析結(jié)果如圖7所示，aqp3a基因在各個(gè)組織中的表達(dá)情況存在顯著差異。以表達(dá)量最低的心臟組織為參照，計(jì)算aqp3a基因在其它各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，aqp3a在鰓中的表達(dá)量顯著高于其它各個(gè)組織。aqp3a在鰓組織中的表達(dá)量最高，是其在心臟中表達(dá)量的416.36倍，而在其它組織中表達(dá)量相對(duì)較低。

(柱形圖上方字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Different letters on the column indicate significant difference (P<0.05).)

2.6 在淡水及海水適應(yīng)過(guò)程中花鱸aqp3a基因在鰓中的表達(dá)響應(yīng)

在淡水適應(yīng)(SW-FW組)過(guò)程中，花鱸aqp3a基因在鰓中的表達(dá)情況如圖8A所示，轉(zhuǎn)入淡水后12 h，aqp3a基因的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異，1 d時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)到最大值，為0 h的32.6倍，3 d的表達(dá)量上調(diào)為0 h的18.5倍，7 d時(shí)的表達(dá)量降低至與0 h無(wú)顯著差異。在海水適應(yīng)(FW-SW)過(guò)程中，aqp3a基因在鰓中的表達(dá)情況如圖8B所示，在轉(zhuǎn)入海水后其表達(dá)量逐漸下調(diào)然后維持穩(wěn)定，在1 d時(shí)顯著下調(diào)為0 h的0.32倍，3和7 d時(shí)aqp3a的表達(dá)量維持在較低水平，與1 d時(shí)無(wú)明顯差異。

(柱形圖上方字母不同表示差異顯著(P<0.05)。圖A為淡水適應(yīng)過(guò)程中，花鱸aqp3a基因在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量水平。圖B為海水適應(yīng)過(guò)程中花鱸aqp3a基因在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量水平。Different letters on the column indicate significant difference (P<0.05). Fig. A shows the relative expression level of aqp3a gene in the gill tissue of spotted sea bass during freshwater adaptation. Fig. B shows the relative expression level of aqp3a gene in the gill tissue of spotted sea bass during seawater adaptation.)

2.7 花鱸AQP3a在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的功能驗(yàn)證

為了檢測(cè)花鱸AQP3a的水轉(zhuǎn)運(yùn)活性，本研究將花鱸AQP3a在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中進(jìn)行了異源表達(dá)。結(jié)果如圖9所示，顯微注射了aqp3acRNA的實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞體積在5 min內(nèi)膨脹至初始體積的1.3～1.4倍，而注射蒸餾水的對(duì)照組體積膨脹較小或無(wú)顯著膨脹(見(jiàn)圖9A)；表達(dá)AQP3a蛋白的卵母細(xì)胞的透水率(Pf)約為對(duì)照組的5倍(見(jiàn)圖9B)，由此表明花鱸的AQP3a對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞體積的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。

(圖A為注射了蒸餾水的對(duì)照組卵母細(xì)胞和注射了花鱸AQP3a cRNA的實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞在轉(zhuǎn)移至低滲培養(yǎng)液后的相對(duì)體積變化。矩形代表對(duì)照組，圓形代表實(shí)驗(yàn)組。圖B為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞的透水率對(duì)比圖。 Fig. A shows the relative volume changes of oocytes in the control group injected with distilled water and those in the experimental group injected with AQP3a cRNA after being transferred to low-osmotic medium. The rectangle represents the control group and the circle represents the experimental group. Fig. B shows the comparison of oocyte permeability between the control group and the experimental group.)

3 討論

本研究成功從花鱸中鑒定出了aqp3a基因，并通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析確定了命名的正確性。將花鱸AQP3a序列與其它物種進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示其具有高度保守性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，硬骨魚(yú)類的aqp3基因和高等脊椎動(dòng)物的aqp3基因各聚為一枝，其中花鱸的AQP3a先后與歐洲鱸的AQP3、尼羅羅非魚(yú)的AQP3ab聚為一枝，這表明它們的同源關(guān)系較近。此外，采用枝位點(diǎn)模型對(duì)aqp3進(jìn)行選擇壓力分析并在硬骨魚(yú)分支上篩選出了4個(gè)顯著的正選擇位點(diǎn)，其中有3個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)跨膜螺旋中，剩下的位點(diǎn)位于構(gòu)成水孔通道的重要位置。這些受正選擇作用的非同義氨基酸替換可能導(dǎo)致硬骨魚(yú)與高等脊椎動(dòng)物的AQP3蛋白透水性的顯著差異，影響水的通透性并影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這種氨基酸的非同義替換對(duì)蛋白功能的影響需要通過(guò)氨基酸殘基誘變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

在硬骨魚(yú)中，aqp3基因的表達(dá)具有組織特異性。Cutler等的研究證實(shí)了aqp3基因廣泛分布在魚(yú)類的鰓、腎、腸等多個(gè)組織中且分布和表達(dá)量會(huì)隨著魚(yú)的種類及環(huán)境的變化而變化[4-6]。甘遠(yuǎn)迪等對(duì)薩羅羅非魚(yú)(Sarotherodonmelanothern)的研究表明，aqp3基因在鰓、肌肉、皮膚等組織中表達(dá)量較高，且表達(dá)量隨鹽度的變化而變化[12]。本研究利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)花鱸aqp3a基因的組織表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，得到了相似的結(jié)果，結(jié)果顯示aqp3a基因在各組織中廣泛表達(dá)(心臟組織除外)，且在鰓中的表達(dá)量顯著高于其它組織。這表明花鱸aqp3a基因在鰓組織中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

硬骨魚(yú)類復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制使其在面對(duì)海、淡水環(huán)境時(shí)，可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)器官調(diào)節(jié)水鹽平衡，在整個(gè)滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中鰓發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17-19]。在鹽度適應(yīng)過(guò)程aqp3基因在鰓中的表達(dá)量具有顯著差異，如歐洲鱸、歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、莫桑比克羅非魚(yú)等相關(guān)研究結(jié)果表明aqp3mRNA在淡水條件下的表達(dá)量均高于海水條件下的表達(dá)量。部分學(xué)者認(rèn)為這是由于AQP3的作用可能是通過(guò)水分的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞體積。本實(shí)驗(yàn)對(duì)花鱸aqp3a基因在淡水適應(yīng)過(guò)程中的鰓組織中的表達(dá)變化情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入淡水后其表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，與之前的研究結(jié)果一致，但在3 d后表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，7 d后表達(dá)趨于穩(wěn)定并與對(duì)照組無(wú)顯著差異，該結(jié)果與Giffard-Mena等人對(duì)歐洲鱸aqp3在淡水適應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)變化的研究略有不同，其鰓組織中aqp3在淡水適應(yīng)一周后的表達(dá)量仍比對(duì)照組上調(diào)8倍。因此，我們提出另一種假設(shè)，在花鱸鰓組織中，aqp3a的作用并非通過(guò)建立細(xì)胞膜通路直接控制水分運(yùn)輸，而是間接參與細(xì)胞體積的調(diào)節(jié)。以往對(duì)歐洲鰻鱺、莫桑比克羅非魚(yú)的免疫組化研究結(jié)果顯示AQP3主要分布在氯細(xì)胞中，與Na+/K+-ATP酶共定位于基底側(cè)的微管網(wǎng)中[8]，在低滲環(huán)境下，水分子通過(guò)水通道蛋白由外界水環(huán)境進(jìn)入氯細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，進(jìn)而激活Na+/K+-ATP酶的活性，調(diào)節(jié)離子濃度，進(jìn)而維持細(xì)胞體積。而短時(shí)間內(nèi)花鱸aqp3a的顯著上調(diào)可能與氯細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)化和細(xì)胞分化有關(guān)。對(duì)羅非魚(yú)胚胎表皮細(xì)胞的研究表明，氯細(xì)胞存在4種類型且在海、淡水環(huán)境中以不同的類型存在[20]。當(dāng)花鱸由海水轉(zhuǎn)入淡水時(shí)，海水型氯細(xì)胞大量凋亡而淡水型氯細(xì)胞的建立和分化促使aqp3amRNA的顯著上調(diào)，至淡水適應(yīng)7 d時(shí)表達(dá)趨于穩(wěn)定。同樣有很多學(xué)者對(duì)aqp3在海水適應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，Cutler等對(duì)歐洲鰻鱺進(jìn)行海水馴化，3周后aqp3的表達(dá)量顯著下降[5]。Tse等將日本鰻鱺由FW轉(zhuǎn)入SW中，鰓中aqp3mRNA水平也出現(xiàn)類似的下降[9]。我們同樣對(duì)花鱸aqp3a基因海水適應(yīng)過(guò)程中在鰓組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)入海水后其表達(dá)量逐漸下調(diào)，并在1 d后維持穩(wěn)定。Isaia等認(rèn)為鰻鱺aqp3mRNA表達(dá)的下降與向SW轉(zhuǎn)移后鰓的水滲透性下降有關(guān)[21]。Lignot等利用免疫組化在鹽度適應(yīng)的歐洲鰻鱺中，將AQP3定位在了鰓的氯細(xì)胞、基底上皮細(xì)胞及覆蓋鰓弓的上皮細(xì)胞中，且在SW馴化的歐洲鰻鱺中，這兩個(gè)非氯細(xì)胞位置的染色均顯著減少，并由此推測(cè)氯細(xì)胞中AQP3蛋白水平的降低可能是導(dǎo)致SW中AQP3 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)的原因[22-24]。同樣在SW馴化后的羅非魚(yú)鰓中AQP3免疫組化染色程度也有所降低[24]。針對(duì)花鱸aqp3a在海水馴化過(guò)程中的表達(dá)情況，根據(jù)我們的假設(shè)，其在海水適應(yīng)過(guò)程中表達(dá)量逐漸降低然后維持穩(wěn)定一方面原因是由于海、淡水不同類型的氯細(xì)胞相互轉(zhuǎn)化，另一方面可能是由于海水環(huán)境中除了氯細(xì)胞外，上皮細(xì)胞等其它類型細(xì)胞中aqp3a的表達(dá)量降低。由此表明，aqp3a在花鱸的滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。

非洲爪蟾的卵母細(xì)胞作為功能基因組學(xué)中重要的研究工具可在短時(shí)間內(nèi)正確的表達(dá)外源基因，翻譯合成蛋白質(zhì)[25]。為進(jìn)一步驗(yàn)證花鱸aqp3a基因的功能，利用非洲爪蟾Ⅴ～Ⅵ期的卵母細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)。通過(guò)顯微注射技術(shù)將花鱸aqp3a的cRNA注射入卵母細(xì)胞中，以此檢測(cè)其透水活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示花鱸aqp3a的cRNA能夠在非洲爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜中高效表達(dá)，并顯著提高細(xì)胞膜的透水能力，這表明花鱸aqp3a基因?qū)λ霓D(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞體積調(diào)節(jié)有重要作用。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究克隆、分析了花鱸的aqp3a基因，并檢測(cè)了該基因的組織表達(dá)情況。結(jié)果表明aqp3a基因存在組織表達(dá)特異性，且在鰓中的表達(dá)量顯著高于其它組織。通過(guò)短期鹽度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該基因在海、淡水適應(yīng)過(guò)程中在鰓組織中的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示aqp3a基因在海、淡水適應(yīng)過(guò)程中的變化情況存在顯著差異。同時(shí)利用非洲爪蟾的卵母細(xì)胞對(duì)花鱸aqp3a基因進(jìn)行異源表達(dá)以檢測(cè)其透水活性，結(jié)果顯示該基因能顯著提高細(xì)胞膜的透水活性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)花鱸aqp3a基因在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用進(jìn)行了初步研究，其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。